含有嵌合抗原受体的融合蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种含有嵌合抗原受体的融合蛋白及其应用。
背景技术
恶性肿瘤已经成为全世界最主要的死亡原因之一。随着科学技术的不断发展，通过对癌症早期的诊断和治疗，已经能够较大幅度地提高癌症的治愈率，改善患者的生活质量。但大多数恶性肿瘤仍存在预后差，易复发等问题。在所有的肿瘤治疗手段中，免疫疗法受到研究者们的不断关注和期待。免疫疗法最大的特点在于利用免疫系统自身去对抗癌症，包括抗体治疗、细胞治疗和免疫调节剂治疗。其中尤为引人关注的细胞治疗是指将细胞制剂回输到患者体内，从而激活患者自身的免疫应答以达到抗肿瘤的目的。而在细胞免疫治疗中，嵌合抗原受体（Chimerica antigen recptor，CAR）修饰T细胞（CAR-modified Tcell，CAR T）疗法被证实能够有效治疗血液系统的恶性肿瘤，成为癌症治疗领域中的热点。随着2017年美国食品药品监督管理局(FDA)正式批准了诺华公司及吉利德公司的两款CART细胞产品（Kymriah和Yescarta）上市，用于急性B淋巴细胞白血病以及弥漫性大B细胞淋巴瘤的治疗，开创了CAR T疗法的新纪元。基于CAR T在血液瘤治疗中的突破，进一步将CAR T疗法拓展到了实体瘤的治疗，并在包括乳腺癌、肝癌、结直肠癌和肺癌等多种实体肿瘤中进行了探索，但是由于实体瘤与血液瘤不同，其缺乏安全且特意的靶点，而且实体瘤存在复杂的肿瘤免疫微环境，最终导致治疗效果不佳。因此，急需发现特异且安全的实体瘤治疗靶点、优化CAR的结构、改善肿瘤微环境，从而提高CAR T细胞的抗肿瘤效应。
滋养层细胞表面抗原2（Trophoblast cell-surface antigen 2，Trop2）是由TACSTD2基因编码表达的Ⅰ型跨膜糖蛋白，是TACSTD基因家族中的一员，人TASTD2基因位于1号染色体短臂的3区2带（1p32）。Trop2在人的胚胎滋养层细胞和绒毛膜癌细胞中高表达，在正常组织和癌旁组织中不表达或低表达，在上皮细胞癌组织中高表达。相关研究表明，Trop2与肿瘤的转移与侵袭程度正相关，影响肿瘤患者的预后。靶向Trop2的单抗偶联药物（Antibody-drug conjugate，ADC）在临床治疗中具有出色的安全性和有效性，在难治性复发的三阴乳腺癌的治疗上取得令人鼓舞的结果，Trop2作为肿瘤靶向的治疗靶点受到越来越多的关注。
发明内容
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及融合蛋白，其包括依次串联的嵌合抗原受体、2A肽、第一信号肽、Sirpα结构域和IgG1 Fc；
所述嵌合抗原受体包含scFv区，铰链区，跨膜域和胞内信号传导区；
所述scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
所述Sirpα结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3所示。
根据本发明的第二方面，还涉及一种分离的核酸，其表达得到如上所述的融合蛋白。
根据本发明的第三方面，还涉及一种载体，其含有如上所述的核酸。
根据本发明的第四方面，还涉及T细胞，其含有如上所述的核酸，或被如上所述的载体所转化。
根据本发明的第五方面，还涉及组合物，其包含药学上可接受的载体以及如上所述的T细胞。
根据本发明的第六方面，还涉及如上所述的T细胞或如上所述的组合物在制备用于预防和/或治疗实体瘤的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1）Sirf CAR T细胞能够减轻肿瘤负荷、提高荷瘤小鼠的生存率，并且没有明显的血液毒性和副作用，具有较好的临床应用潜力。
2）SIRPα-Fc融合蛋白可以增强了CAR T细胞的抗凋亡和记忆表型，并改变肿瘤组织的免疫微环境。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的原理示意图；
图2为本发明一个实施例中CAR的结构示意图；显示了靶向Trop2的小鼠二代CAR（T2-m28z）和Sirf mCAR（T2-m28z SIRPα-Fc）的逆转录载体构建示意图；
图3为本发明一个实施例中小鼠CAR T细胞的制备；使用逆转录病毒感染小鼠CD3+T细胞，（A）采用流式细胞术检测mCAR T细胞的转导效率；（B）流式检测各组小鼠T细胞亚群中CD4+ T与CD8+ T细胞的比例；
图4为本发明一个实施例中Sirf CAR T细胞表达SIRPα-Fc融合蛋白；免疫印迹的方法检测T2-m28z和Sirf的CAR T细胞培养的上清中SIRPα-Fc融合蛋白的表达情况；
图5为本发明一个实施例中肿瘤细胞表面CD47的表达水平；流式检测肿瘤细胞MC38-Trop+（A）和4T1-Trop2+ （B）表面CD47的表达；将扩增培养后的T2-m28z和Sirf的mCART细胞的上清，分别与肿瘤细胞孵育1 h，再用抗CD47流式抗体去竞争检测对照的肿瘤细胞以及上清孵育后的肿瘤细胞表面CD47的水平；
图6为本发明一个实施例中巨噬细胞的肿瘤吞噬功能；吞噬作用检测是将CFSE标记肿瘤细胞MC38-Trop+与体外扩大培养6天的BMDM细胞按照4：1的比例在不同上清中进行共培养，加入体外培养后的不同组T细胞上清（A）；或是与肿瘤细胞共培养后的不同组的T细胞上清（B）；4 h后收集细胞，采用流式检测F4/80+的巨噬细胞中CFSE+的比例来确定小鼠巨噬细胞的吞噬肿瘤作用；实验数据的结果以mean ± SEM 表示，通过单因素方差分析计算p值，ns 无统计学差异，* p< 0.05，** p< 0.01。；
图7为本发明一个实施例中T2-mCAR T对肿瘤细胞的体外裂解作用；通过测定LDH释放来评估T2-mCAR T细胞对Trop2阳性小鼠肿瘤细胞的细胞毒作用；（A） MC38-Trop2+；（B） 4T1-Trop2+；实验数据的结果以mean ± SEM 表示，通过单因素方差分析计算p值，* p< 0.05，** p< 0.01，*** p< 0.001，**** p< 0.0001；
图8为本发明一个实施例中T2-mCAR T细胞胞内IFN-γ的表达水平。采用流式细胞术的方法检测CD3+细胞中IFN-γ表达阳性的细胞比例；与MC38-Trop2+细胞共培养后（A-B）；与4T1-Trop2+细胞共培养后（C-D）；实验数据的结果以mean ± SEM 表示，通过单因素方差分析计算 p 值，*p< 0.05，**p< 0.01，***p< 0.001，**** p< 0.0001；
图9为本发明一个实施例中T2-mCAR T细胞的活化水平；（A）T细胞与MC38-Trop2+共培养48小时后，通过流式细胞术测定CD69在不同T细胞上的表达情况；（B）CD69阳性细胞占CD3+ T细胞中的比例，UTD组作为阴性对照。实验数据的结果以mean ± SEM 表示，通过单因素方差分析计算p值，**** p< 0.0001；
图10为本发明一个实施例中Sirf CAR T细胞对小鼠结肠癌的体内抗肿瘤作用；（A）C57BL/6小鼠背部皮下接种MC38-Trop2+小鼠肿瘤细胞，接种后第7天经尾静脉回输不同T细胞，并定期测量肿瘤的大小；（B）荷瘤小鼠肿瘤大小的生长曲线；（C）荷瘤小鼠的体重变化情况；（D）在成瘤后第31天取材小鼠的肿瘤组织进行拍照比较；（E）比较不同组的荷瘤小鼠之间肿瘤重量；实验数据的结果以mean ± SEM 表示，小鼠数量N=5只/组，*p< 0.05，**p< 0.01，***p< 0.001，**** p< 0.0001；
图11为本发明一个实施例中Sirf CAR T细胞对小鼠乳腺癌的体内抗肿瘤作用；（A）BALB/c小鼠背部皮下接种4T1-Trop2+小鼠肿瘤细胞，接种后第2天，第7天经尾静脉回输不同T细胞，并定期测量肿瘤的大小；（B）荷瘤小鼠肿瘤大小的生长曲线；实验数据的结果以mean ± SEM 表示，小鼠数量N=5只/组，*p< 0.05，**p< 0.01，***p< 0.001，**** p<0.0001；
图12为本发明一个实施例中Sirf CAR T提高CY预处理后荷瘤小鼠的生存率；（A）C57BL/6小鼠背部皮下接种MC38-Trop2+小鼠肿瘤细胞，接种后第14天腹腔单次注射CY 80mg/kg，CY处理后的第三天经尾静脉回输1×106个不同的T细胞（B）荷瘤小鼠生存曲线；（C）在成瘤后小鼠的肿瘤生长曲线；（N=5，CY组；N = 5，T2-m28z组；N =7，Sirf组）；实验数据的结果以mean ± SEM 表示，生存率的比较采用Log-rank(Mantel–Cox)检验计算p值，*p<0.05，**p< 0.01，***p< 0.001，**** p< 0.0001；
图13为本发明一个实施例中小鼠脾脏中免疫细胞的比例；流式细胞术检测荷瘤小鼠脾脏细胞中CAR的阳性率；CD3+ T细胞中CAR的阳性率（A）；CD4+ T细胞中CAR的阳性率（B）；CD8+ T细胞中CAR的阳性率（C）；小鼠脾脏中CD3+ CAR+细胞的表面标记物CD44和CD62L的流式检测（D）；实验数据的结果以mean ± SEM 表示，小鼠数量N=3只/组，*p< 0.05，**p<0.01，***p< 0.001，**** p< 0.0001；
图14为本发明一个实施例中活化后的CAR T细胞的凋亡情况；采用流式细胞术检测与MC38-Trop2+肿瘤细胞体外无细胞因子添加条件下共培养48 h后，CAR T细胞的表面标志物CD44、CD62L和凋亡情况；（A）CAR T细胞的CD44和CD62L；（B）用Annexin V / 7-AAD检测CAR阳性 T细胞中的凋亡水平；（C）CAR阴性T细胞中的凋亡水平。实验数据的结果以mean ±SEM 表示，N=3只/组，*p< 0.05，**p< 0.01，***p< 0.001，**** p< 0.0001；
图15为本发明一个实施例中荷瘤小鼠肿瘤组织中免疫细胞分布；采用流式细胞术检测荷瘤小鼠肿瘤组织中免疫细胞的比例；（A） CD4+ CAR+ T细胞占总细胞数的比例；（B）CD8+ CAR+ T细胞占总细胞数的比例；（C）CD45+ CD11c+的细胞占总数的比例；（D）CD11b+Ly6G+细胞占总细胞数的比例；实验数据的结果以mean ± SEM 表示，小鼠数量N = 3只/组，*p< 0.05，**p< 0.01，***p< 0.001；
图16为本发明一个实施例中CAR T细胞激活后的PD-1表达水平；采用流式细胞术检测与MC38-Trop2+肿瘤细胞在体外无任何细胞因子添加条件下共培养48 h后，T细胞中PD-1+的细胞比例，实验数据的结果以mean ± SEM 表示，通过t检验分析计算 p 值，N=3；*p< 0.05，**p< 0.01；
图17为本发明一个实施例中荷瘤小鼠的血液学变化；C57BL/6小鼠背部皮下接种MC38-Trop2+小鼠肿瘤细胞，接种后第14天经尾静脉回输T2-m28z和Sirf的CAR T细胞，3天后检测小鼠外周血常规变化；（A）白细胞计数，（B）红细胞计数，（C）血小板计数，（D）血红蛋白浓度；实验数据的结果以mean ± SEM 表示，N = 4只/组，ns 指无统计学差异，*p<0.05；
图18为本发明一个实施例中荷瘤小鼠的组织学改变；C57BL/6小鼠背部皮下接种MC38-Trop2+小鼠肿瘤细胞，接种后第7天经尾静脉回输不同的CAR T细胞，荷瘤31天后H&E染色检测小鼠的心、肝、肺和肾的病理改变；
图19为本发明一个实施例中对人CAR T细胞的体外杀伤作用结果；RPMI 1640完全培养基将肿瘤细胞重悬至1×105个/mL，分别将对应的CAR T细胞用RPMI 1640重悬至1×105个/mL，与肿瘤细胞比例（E: T）为5:1比例，将肿瘤细胞与CAR T细胞在96孔圆底板中共培养8 h后，检测上清中的乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）的含量，计算CAR T细胞的杀伤靶细胞的效率；实验数据的结果以mean ± SEM 表示，通过t检验分析计算 p 值，N=4；**** p< 0.0001。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明涉及融合蛋白，其包括依次串联的嵌合抗原受体、2A肽、第一信号肽、Sirpα结构域和IgG1 Fc；
所述嵌合抗原受体包含scFv区，铰链区，跨膜域和胞内信号传导区；
所述scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
所述Sirpα结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2（鼠）或SEQ ID NO: 3（人）所示。
本发明将CAR T细胞技术与CD47阻断剂SIRPα-Fc融合蛋白相结合，让CAR T细胞成为破坏实体瘤的“踹门砖”，通过表达肿瘤细胞表面CD47分子的阻断剂，调动机体自身免疫系统的功能，改善肿瘤组织微环境，增强CAR T细胞的抗肿瘤功能，从而达到抑制实体瘤的目的，为实体瘤的后续治疗提供了借鉴和思路。
其中，本发明的各段多肽（例如IgG1 Fc、信号肽、嵌合抗原受体的各部分）可以独立地选自相同或者不同的种属来源，例如鼠（小鼠、大鼠）、兔、绵羊、山羊、马、鸡、牛、犬以及人。
其中IgG1 Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7（鼠源）或SEQ ID NO: 8（人源）所示。
在一些实施方式中，所述2A肽为P2A肽。
在一些实施方式中，所述P2A肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示。
在一些实施方式中，所述铰链区选自CD8α的hinge区。
在一些实施方式中，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10（鼠源）或SEQ IDNO: 11（人源）所示。
在一些实施方式中，所述跨膜域选自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160( BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、和NKG2C中的一种。
在一些实施方式中，所述跨膜域的为CD28跨膜区，进一步优选其氨基酸序列如SEQID NO: 12或SEQ ID NO: 13所示。
在一些实施方式中，所述胞内信号传导区选自CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83 的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、 HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、 ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226 )、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、 Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100( SEMA4D )、CD69、SLAMF6( NTB-A、Ly108 )、SLAM( SLAMF1、CD150、IPO-3 )、BLAME( SLAMF8)、SELPLG( CD162 )、 LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、PKCθ、FcεRIγ、ZAP70和CD3胞内域中的至少一种。
在一些实施方式中，所述胞内信号传导区选自CD28和CD3胞内结构域，优选CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14（鼠源）或SEQ ID NO: 15（人源）所示；CD3胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16（鼠源）或SEQ ID NO: 17（人源）所示。
在一些实施方式中，所述第一信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4（鼠源）或SEQID NO:5（人源）所示。
在一些实施方式中，所述融合蛋白的N段还具有第二信号肽，其氨基酸序列如SEQID NO: 6所示。
在一些实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 18（鼠源）或SEQID NO: 19（人源）所示。
本发明还涉及分离的核酸，其表达得到如上所述的融合蛋白。
核酸可为DNA或RNA。
本发明还涉及含有如上所述核酸的载体。
在本公开的一些具体的实施方式中，所述载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒、腺病毒相关病毒或CRISPR/CAS质粒。
本发明还涉及T细胞，其含有如上所述的核酸或被如上所述的载体所转化。
在本公开的一些具体的实施方式中，所述 T 细胞为辅助 T 细胞、细胞毒性 T 细胞、记忆 T 细胞、调节性 T 细胞、MAIT细胞、γδT细胞中的任意一种。
在一些实施方式中，所述T细胞是CD3+T细胞；
在一些实施方式中，所述T细胞是CD3+CD4+T细胞和/或CD3+CD8+T细胞。
根据本发明的再一方面，还涉及组合物，其包含在药学上可接受的载体以及如上所述的T细胞。
本发明还涉及如上所述的T细胞或如上所述的组合物在制备用于预防和/或治疗实体瘤的药物中的应用。
在本发明中，“实体瘤”包括：骨、骨连接、肌肉、肺、气管、心脏、脾脏、动脉、静脉、毛细血管、淋巴结、淋巴管、淋巴液、口腔、咽、食管、胃、十二指肠、小肠、结肠、直肠、肛门、阑尾、肝、胆、胰腺、腮腺、舌下腺、泌尿肾、输尿管、膀胱、尿道、卵巢、输卵管、子宫、阴道、外阴部、阴囊、睾丸、输精管、阴茎、眼、耳、鼻、舌、皮肤、脑、脑干、延髓、脊髓、脑脊液、神经、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体、松果体、胰岛、胸腺、性腺、舌下腺以及腮腺中任一处病变生成的肿瘤。特别地，优选预期的肿瘤可被靶向，例如胆管癌、乳腺癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓源性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈部癌、霍奇金氏淋巴瘤、肺癌、甲状腺髓样癌、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌和尿路膀胱癌。
在一些实施方式中，实体瘤包括结直肠癌、乳腺癌。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例
1. 构建共表达SIRPα-Fc融合蛋白的Sirf CAR T细胞
1.1 构建共表达SIRPα-Fc的T2-mCAR分子
在众多的CD47抗体或受体阻断的分子中，我们选择了在研药物SIRPα-Fc 融合蛋白（TTI-621），相对于抗体分子的150 kDa大小而言，SIRPα-Fc的分子量仅为90kDa，具有更好的穿透性和组织分布性。并且人源的SIRPα-Fc融合蛋白已经证实能够在体外结合肿瘤细胞表面的CD47分子，从而增强巨噬细胞吞噬功能，激活整个免疫系统的抗肿瘤功能。基于逆转录病毒载体骨架构建的小鼠CAR基因能够被高效的转导到小鼠的T细胞内，我们在原有的小鼠二代CAR分子T2-m28z（图2中的A）的基础上，构建共表达SIRPα-Fc的mCAR结构。融合小鼠的SIRPα胞外段和鼠源的IgG1结构的Fc区段，并且利用可剪切的融合蛋白接头衔接序列（2A peptide，P2A），将小鼠的SIRPα-Fc连接在无终止密码子的CAR基因的3’端，由于P2A能够不依赖蛋白酶而发生自行切割，使得其两个结构域断裂而达到两种分子共表达的结果。至此，我们构建了T2-m28z SIRPα-Fc ( Sirf )的鼠源CAR结构（图2中的B），其氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示。
1.2 制备共表达SIRPα-Fc蛋白的CAR T细胞
文献报道，不仅是CD8+ T细胞可用于制备CAR T细胞，用CD4+ T细胞制备的CAR T细胞也能引起直接的细胞毒性。同时在肿瘤的临床治疗中发现CD4+与CD8+细胞的比例在1：1时，CAR T的治疗效果会更持久。因此，在本研究的后续实验中，我们选择了既包含CD4+ T细胞也包含CD8+ T细胞的小鼠CD3+ T细胞作为后续制备mCAR T的细胞。根据先前的实验流程制备mCAR T细胞，通过流式细胞术检测了不同mCAR的转导效率。实验结果显示，T2-m28z和Sirf的CAR T的制备效率都很高，都在90%左右（图3中的A）。而且制备的mCAR T细胞中的CD4+与CD8+的比例在三组之间也比较相近（图3中的B），这也侧面表明分泌的SIRPα-Fc融合蛋白对于CD4+T细胞和CD8+ T细胞的分群没有影响。
1.3 Sirf CAR T细胞能够分泌SIRPα-Fc融合蛋白
为了进一步确认Sirf CAR T细胞成功表达了小鼠的SIRPα-Fc蛋白，我们通过对靶蛋白上HIS标签蛋白的检测，指示细胞上清中的分泌蛋白的表达情况。实验结果发现，在50kDa左右的目标条带处，发现Sirf CAR T的细胞上清有目的蛋白的表达，而T2-m28z CART细胞上清中并没有检测到相应的目的蛋白的表达（图4）。实验结果表明，构建的Sirf CART细胞可以表达SIRPα-Fc融合蛋白，并分泌到细胞培养上清中。
1.4 SIRPα-Fc融合蛋白能够结合肿瘤细胞表面CD47分子
为了验证Sirf CAR T细胞上清中的SIRPα-Fc融合蛋白是否能够结合肿瘤细胞表面的CD47，我们利用抗体竞争结合的方法，检测肿瘤细胞CD47分子的表达。实验结果发现，小鼠结直肠癌细胞MC38-Trop+表面高表达CD47，进一步用CD47的流式抗体检测与上清孵育后的肿瘤细胞表面CD47分子的表达，发现与T2-m28z的上清共孵育后肿瘤细胞的CD47分子荧光强度没有变化，而与Sirf CAR T细胞上清共孵育后肿瘤细胞表面的CD47分子的荧光强度明显降低（图5中的A），这表明Sirf CAR T细胞分泌表达的SIRPα-Fc融合蛋白能够结合肿瘤细胞表面的CD47，竞争抑制CD47流式抗体的再结合，使得CD47的流式检测值降低。在另外一株表达人Trop2的小鼠乳腺癌细胞系4T1-Trop2+中也观察到同样的实验结果（图5中的B）。上述实验结果说明，SIRPα-Fc融合蛋白能够与小鼠肿瘤细胞表明的CD47结合。
1.5 SIRPα-Fc融合蛋白增强巨噬细胞体外的肿瘤吞噬作用
CD47抗体在肿瘤治疗中的主要途径是阻断CD47-SIRPα这个“别吃我”信号，从而使得巨噬细胞能够发挥吞噬肿瘤作用，解除免疫抑制并恢复免疫系统的抗肿瘤能力。已经证实Sirf CAR T细胞的表达的SIRPα-Fc能够结合肿瘤细胞表面的CD47，阻断CD47抗体的再结合（图5）。为了验证分泌表达的SIRPα-Fc融合蛋白增强巨噬细胞的肿瘤吞噬作用，在小鼠骨髓来源的巨噬细胞（Bone marrow derive macrophage，BMDM）与肿瘤细胞的共培养体系中加入不同CAR T细胞的培养上清，检测巨噬细胞的功能。结果发现，加入Sirf CAR T细胞上清后，巨噬细胞的吞噬作用增强，并高于对照的T2-m28z组和空白组UTD组。而UTD组与传统的二代CAR T2-m28z组中的巨噬细胞吞噬作用没有差异（图6中的A）。已有研究表明，IFN-γ能够强有利的活化巨噬细胞，同时CAR T细胞在识别肿瘤细胞后会高表达IFN-γ，那么分泌SIRPα-Fc蛋白的Sirf CAR T细胞在肿瘤治疗中对巨噬细胞的活化是否更强呢我们首先收集不同T细胞与肿瘤细胞共培养后的培养基上清，并将其作为BMDM和肿瘤细胞共培养的培养基，检测巨噬细胞吞噬能力。实验结果表明，两种mCAR T组的巨噬细胞的吞噬作用都要高于对照UTD组，而Sirf组比传统的T2-m28z组中的巨噬细胞具有更强的吞噬作用（图6中的B）。这表明活化后的CAR T细胞分泌的细胞因子也能增强巨噬细胞的肿瘤吞噬作用。以上结果说明，含有SIRPα-Fc融合蛋白的Sirf CAR T细胞培养上清在体外促进巨噬细胞的肿瘤吞噬作用。
2. SIRPα-Fc不影响Sirf CAR T细胞体外杀伤肿瘤功能
T细胞表面表达CD47，CD47抗体也会与T细胞结合，调控T细胞功能。因此，需要进一步验证SIRPα-Fc融合蛋白在体外对CAR T细胞杀伤肿瘤细胞功能的影响。
2.1 SIRPα-Fc融合蛋白不影响CAR T细胞的肿瘤杀伤作用
CAR T细胞的首要功能就是识别并杀伤肿瘤细胞，通过LDH释放的检测方法，比较T2-m28z和Sirf CAR T细胞裂解肿瘤细胞MC38-Trop2+的的能力。实验结果显示，Sirf与T2-m28z的CAR T细胞与靶细胞在共培养条件下，均能够有效裂解肿瘤细胞，并且CAR T细胞对肿瘤的杀伤能力随着效应细胞比例的升高而增强（图7中的A），这表明Sirf CAR T细胞具有肿瘤杀伤活性。但是比较Sirf与T2-m28z之间的裂解肿瘤能力没有差异。另外，在4T1-Trop2+的肿瘤细胞系也得到同样的实验结果（图7中的B）。以上实验结果说明，SIRPα-Fc融合蛋白不影响CAR T细胞的杀伤肿瘤细胞功能。
2.2 SIRPα-Fc融合蛋白不影响CAR T细胞的IFN-γ表达
IFN-γ是重要的抗肿瘤因子，因此我们进一步通过流式细胞术的方法检测CAR T细胞与MC38- Trop2+肿瘤细胞共培养后IFN-γ的表达情况。实验结果显示，相比于对照UTD组，Sirf与T2-m28z组的CAR T细胞都高表达IFN-γ，都在20%左右（图8中的 A，B），并且两者之间的IFN-γ的表达量没有差异。检测与4T1-Trop2+共培养的CAR T细胞也得到同样的实验结果，T2-m28z与Sirf CAR T细胞表达IFN-γ阳性细胞比例在30%左右（图8中的C，D）。以上实验结果说明，分泌表达的SIRPα-Fc融合蛋白不影响CAR T细胞IFN-γ的表达。
2.3 SIRPα-Fc融合蛋白不影响mCAR T细胞的激活水平
CAR T细胞在识别肿瘤细胞表面的相关抗原后，会触发CAR胞内信号，从而激活CART细胞，已有研究报道CD47与T细胞的活化相关。CD69是T细胞的早期活化分子，在静止的T细胞上是不表达的，在抗原刺激和激活下CD69会高表达，提示T细胞的激活水平。为了验证SIRPα-Fc融合蛋白对CAR T细胞活化的影响，我们检测了与肿瘤细胞共培养48 h后T细胞的CD69表达水平，实验结果发现，Sirf和T2-m28z CAR T细胞与肿瘤细胞共培养后都高表达CD69（图9中的A），说明两种CAR T细胞都被激活，并且Sirf与T2-m28z之间的CD69的表达没有差异（图9中的B）。以上结果说明，SIRPα-Fc融合蛋白的表达不影响CAR T细胞的活化。
3.SIRPα-Fc增强Sirf CAR T细胞体内抗肿瘤功能
评估肿瘤临床疗效的重要指标包括患者体内肿瘤大小和患者的生存率。因此，Sirf CAR T细胞的抗肿瘤功能需要在小鼠体内进行进一步验证从而确定其对实体瘤的实际治疗效果。在体外实验中，Sirf与T2-m28z杀伤肿瘤细胞的功能没有差异，但是CAR T细胞在体内会受到免疫微环境以及免疫系统的影响，各种免疫细胞之间也会发生相互作用，从而可能展现出不同的疗效。因此，为了更好的评估Sirf CAR T细胞的体内抗肿瘤功能，我们依旧选择在免疫健全的同种移植瘤小鼠模型中，验证Sirf CAR T细胞在完整免疫系统和肿瘤免疫微环境的条件下，是否能够发挥更好的抗肿瘤作用。
3.1 Sirf CAR T更有效的抑制小鼠结直肠癌的生长
首先，我们选择在免疫健全的C57BL/6小鼠右侧皮下荷瘤MC38-Trop2+的肿瘤细胞后，第七天经尾静脉回输1×106个mCAR T细胞，一周两次进行荷瘤小鼠的肿瘤大小测量和体重测量（图10中的A）。第31天对照组小鼠的肿瘤体积已经达到动物伦理中人道终点，我们进行了肿瘤组织的取材。实验结果显示，回输Sirf CAR T细胞组的小鼠肿瘤生长明显受到抑制，同比T2-m28z组有明显统计学差异（图10中的B），而三组小鼠体重的变化无差异（图10中的C）。在31天取材后，拍照对比肿瘤大小发现，Sirf组的肿瘤体积和重量要明显小于T2-m28z和UTD组（图10中的D，E）。以上实验结果说明，在体内实验的小鼠结直肠模型中，SirfCAR T细胞相比于T2-m28z CAR T细胞具有更强的抗肿瘤功能。
3.2 Sirf CAR T细胞抑制小鼠乳腺癌的生长
4T1是来自于BALB/c小鼠的乳腺癌细胞系，已有文献报道，4T1细胞在BALB/c荷瘤小鼠的生长特性与人乳腺癌的生长特性非常相近，是人类乳腺癌IV期非常重要的动物模型，常用于药物或者治疗方案在临床前的评估。在本研究中，我们利用BALB/c小鼠皮下接种4T1-Trop2+肿瘤细胞，并两次回输1×106个mCAR T细胞（图11中的A）观察Sirf CAR T细胞的抗肿瘤效果。实验结果显示，尽管回输两次mCAR T细胞，T2-m28z组的小鼠肿瘤的生长相比于对照组UTD只是受到一定程度的抑制，而且肿瘤大小在随着时间的延长而逐渐变大，UTD和T2-m28z的肿瘤生长速度仍然很快。但是Sirf组的小鼠肿瘤生长比T2-m28z和UTD这两组的肿瘤生长明显变慢，肿瘤体积也更小（图11中的B）。以上实验结果说明，Sirf CAR T细胞更为有效的抑制乳腺癌的生长。
3.3 Sirf CAR T细胞提高化疗预处理的荷瘤小鼠的生存率
已经证明Sirf CAR T细胞能有效抑制小鼠结直肠癌的肿瘤生长，但这是在小鼠荷瘤的较早期回输细胞后的治疗效果。在临床治疗中往往病人发现肿瘤的时候大多数已是晚期，所以是否在荷瘤小鼠成瘤后，更晚的回输不同的mCAR T细胞也会有不同的抗肿瘤效果呢同时，在现有的临床CAR T细胞回输治疗方案中，通常会先选择低剂量的氟达拉滨和环磷酰胺（Cyclophosphamide，CY）静脉滴注的方式进行调理，目的是清除外周血中的淋巴细胞和降低肿瘤负荷。我们在给小鼠回输治疗前，同样也采用环磷酰胺预处理小鼠，探讨SirfCAR T细胞是否能够延长荷瘤小鼠的生存时间。体内实验流程如图所示（图12中的 A），在长达61天的时间里观察到小鼠存活情况发现，回输了T2-m28z CAR T细胞组的小鼠与只注射CY组的小鼠的生存率没有差异。而回输Sirf CAR T细胞的小鼠生存率要比T2-m28z和UTD两组都高（图12中的B），差异有统计学意义。同时分析成瘤后31天内的肿瘤大小变化，发现当环磷酰胺处理后的所有小鼠的肿瘤都有小幅度的下降，但进一步回输Sirf CAR T细胞后，显著降低了荷瘤小鼠的肿瘤负荷。上述结果说明，Sirf CAR T细胞能够有效延长化疗药预处理后的荷瘤小鼠的生存时间、提高生存率。
4. Sirf CAR T细胞改善肿瘤微环境并增强自身抗凋亡能力
体内实验结果表明，Sirf CAR T细胞的抗肿瘤作用要明显优于T2-m28z CAR T细胞，Sirf CAR T细胞降低肿瘤负荷并且改善小鼠的生存率。为了进一步探究其中的原因，我们开展了系列的体外实验进行相关机制研究，并同步比较了荷瘤小鼠体内的免疫系统以及肿瘤免疫微环境的变化。
4.1 Sirf CAR T细胞在荷瘤小鼠脾脏存留增多，TCM比例升高
在MC38-Trop2+的荷瘤小鼠肿瘤模型中尾静脉回输CAR T细胞，然后检测了小鼠脾脏中的CAR T细胞的比例。结果表明，T2-m28z和Sirf组的荷瘤小鼠脾脏中都能检测到CAR T细胞的驻留（图13 中的A）。其中Sirf组小鼠脾脏的CD3+ T细胞中CAR T细胞所占的比例要高于T2-m28z组。对CD3亚群分析我们发现，Sirf和T2-m28z组之间 CD4阳性的CAR T细胞比例没有差异（图13 中的B），但Sirf组中CD8阳性的CAR T细胞比例要比T2-m28z更高（图13中的C）。进一步分析脾脏中的这部分CAR T细胞的分化水平，发现Sirf组的CAR T细胞中TCM（CD44+ CD62+）的细胞比例要远高于T2-m28z组，而TCM已被证实能够高效且持久的发挥抗肿瘤功能。以上结果说明，回输Sirf CAR T的荷瘤小鼠脾脏中存留有更多的具有高效抗肿瘤的TCMCAR T细胞。
4.2 Sirf CAR T细胞抗凋亡能力更强，T细胞的记忆表型明显
上述研究发现，荷瘤小鼠脾脏中的TCM Sirf CAR T细胞比例更高，而现有文献报道TCM抗凋亡能力强，存活时间长，维持体内长效抗肿瘤功能，因此我们在体外实验进一步验证Sirf CAR T细胞具有较强的抗凋亡能力。实验结果表明，与肿瘤细胞共培养后，Sirf CAR T细胞中CD44+CD62L+的TCM细胞比例明显高于T2-m28z CAR T细胞（图14中的 A）。CAR T细胞识别和杀伤肿瘤后，自身也会产生自发凋亡，检测与肿瘤细胞共培养后的T细胞的凋亡水平发现，Sirf组中CAR阳性的T细胞中的凋亡比例（Annexin V+/ 7-AAD+）显著低于T2-m28z组（图14中的B），但是两组之间的CAR阴性的这部分T细胞的凋亡水平却没有差异（图14中的C），这提示分泌表达SIRPα-Fc融合蛋白可能仅对激活后的CAR+ T细胞才有作用。以上结果说明，表达SIRPα-Fc融合蛋白增强了Sirf CAR T细胞的抗凋亡能力。
4.3 Sirf CAR T改善小鼠肿瘤组织区域的免疫微环境
肿瘤微环境中的免疫抑制效应是CAR T治疗实体瘤的瓶颈之一，通过对荷瘤小鼠肿瘤组织的检测发现，Sirf和T2-m28z两组肿瘤中的都能检测到CAR T细胞的驻留，其中回输Sirf CAR T细胞的肿瘤组织中不论是CD4+还是CD8+的CAR T细胞的比例都要高于T2-m28z组（图15中的A，B）。进一步检测肿瘤组织中的其他免疫细胞发现，Sirf组肿瘤中CD11c+的DC细胞比例高于T2-m28z和UTD组（图15中的C），而Sirf组肿瘤组织中CD11b+ Ly6G+的MDSC的细胞比例显著低于T2-m28z组（图15中的D）。以上结果说明Sirf CAR T细胞能够改善荷瘤小鼠的肿瘤免疫微环境。
4.4 Sirf CAR T细胞中PD-1阳性细胞比例降低
PD-1是癌症免疫治疗中的明星分子，阻断和下调PD-1分子能够显著增强CAR T细胞的抗肿瘤功能。体外实验结果发现，与肿瘤细胞共培养后的CAR T细胞中PD-1阳性的细胞比例明显增多，而且Sirf CAR T细胞中PD-1阳性的细胞比例低于T2-m28z CAR T细胞组，在非CAR T细胞中PD-1阳性率之间却没有差异（图16）。上述结果说明分泌表达的SIRPα-Fc融合蛋白不仅能够降低CAR T细胞中PD-1阳性的细胞比例，同时对非CAR T细胞没有产生额外的影响。
5. Sirf CAR T细胞治疗的安全性
由于CD47在正常组织和细胞中表达，因此在Sirf CAR T细胞治疗过程中CD47阻断剂SIRPα-Fc融合蛋白会否影响正常组织和器官的功能也是其成功应用到临床实践的关键。基于这个考量，我们对Sirf CAR T细胞的治疗安全性进行了初步评估。
现有临床数据表明，贫血和血小板减少症已经成为CD47抗体的剂量限制性毒性，因此本项目也在模型动物中检测了血红蛋白含量、血小板计数和红细胞数量等相关的指标。结果表明，对比模型组和T2-m28z CAR T细胞组，回输了Sirf T2-m28z CAR T细胞后，小鼠血液中的白细胞总数（图17中的A）、红细胞总数（图17中的B）、以及血红蛋白（图17中的D）的含量并没有差异。而血小板（图17中的C）的含量在回输Sirf T2-m28z CAR T细胞后对比模型组有明显上升，但和T2-m28z CAR T细胞组没有显著差异。以上实验结果说明，回输Sirf CAR T细胞不会引起贫血和血小板减少症等现有临床实践中应用CD47抗体导致的血液毒性，具有较好的安全性。
进一步评估Sirf CAR T细胞对正常组织的潜在毒性，我们检测回输治疗31天之后的小鼠的重要器官的病理变化，包括心脏、肝脏、肺脏和肾脏，并没有发现明显的重要脏器形态学改变（图18）。
6. 人源CAR T细胞的体外杀伤作用验证
将SEQ ID NO: 18所示的融合蛋白中的鼠源序列替换为SEQ ID NO: 19所示的人源序列，并进行体外杀伤作用验证。
实验结果表明，对比模型组，T2-m28z CAR T细胞组和Sirf CAR T细胞均能够杀伤Trop2阳性细胞MDA-MB-231和BGC-823肿瘤细胞系（图19）。以上结果说明，人源T2-CAR T细胞对Trop2阳性的肿瘤细胞均特异性的靶向杀伤作用。
综上所述，我们将CAR T细胞技术与CD47阻断剂SIRPα-Fc融合蛋白相结合，让CART细胞成为破坏实体瘤的“踹门砖”，通过表达肿瘤细胞表面CD47分子的阻断剂，调动机体自身免疫系统的功能，改善肿瘤组织微环境，增强CAR T细胞的抗肿瘤功能，从而达到抑制实体瘤的目的，为实体瘤的后续治疗提供了借鉴和思路。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中山大学
<120> 含有嵌合抗原受体的融合蛋白及其应用
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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