Ski在制备增效型CAR-T细胞中的应用
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体地，涉及一种嵌合抗原受体，其包含B7H3抗原结合结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域以及人源Ski，更具体地，涉及Ski在制备增效型CAR-T细胞中的应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric antigen receptor T-cellimmunotherapy，CAR-T)作为一种新兴的肿瘤过继免疫疗法，其利用基因工程技术将逆转录病毒和慢病毒载体转座系统或直接将mRNA转导到T细胞内，使T细胞获得识别特异性肿瘤细胞的能力并激活T细胞杀死肿瘤细胞的嵌合抗体，通过将这些T细胞回输至患者体内使患者的免疫系统获得特异性识别和杀伤肿瘤的能力(Shi H,Sun M,Liu L,et al.Chimericantigen receptor for adoptive immunotherapy of cancer:latest research andfuture prospects[J].Molecular cancer,2014,13(1):1-8.)，CAR-T的核心作用元件是嵌合抗原受体CAR，它由T细胞受体(T cell receptor，TCR)的胞内信号转导区、跨膜区以及胞外抗原结合区组成，其胞外区负责抗原的特异性地识别(Melenhorst J J,Levine BL.Innovation and opportunity for chimeric antigen receptor targeted Tcells[J].Cytotherapy,2013,15(9):1046-1053.)，CAR-T技术因对恶性肿瘤细胞的靶向性、杀伤活性和持久性强而在癌症等恶性疾病的治疗中展示出了巨大的应用前景。
B7H3，又称CD276，是一种I型跨膜蛋白，属于B7免疫共刺激和共抑制家族，其主要形式为包含两个细胞外串联的IgV-IgC结构域(即：IgV-IgC-IgV-IgC)(Collins M,Ling V,Carreno B M.The B7 family of immune-regulatory ligands[J].Genome biology,2005,6(6):1-7.)，具有免疫抑制功能，可以减少T细胞释放的I型干扰素(IFN)、降低NK细胞的细胞毒性。B7H3 mRNA在大多数组织表达，但其蛋白在正常组织(例如前列腺、乳腺、肝脏和淋巴器官)中表达非常有限，然而B7H3蛋白在在大部分恶性肿瘤及肿瘤相关成纤维细胞表面均异常高表达。多个独立实验已经证实了在多种恶性肿瘤细胞中B7H3蛋白均显著高表达，且这种高表达与恶性肿瘤疾病的严重程度密切相关(Zang X,Allison J P.The B7family and cancer therapy:costimulation and coinhibition[J].Clinical cancerresearch,2007,13(18):5271-5279.)，并且表明了B7H3参与肿瘤的免疫逃逸过程(Hofmeyer K A,Ray A,Zang X.The contrasting role of B7-H3[J].Proceedings ofthe National Academy of Sciences,2008,105(30):10277-10278.)。
转化生长因子-β(TGF-β)在调节细胞和组织的动态平衡中发挥着重要作用，在正常情况下，它主要通过对相关基因的转录调控来维持细胞和组织的动态平衡。作为一个抑癌基因，TGF-β的正常功能通常在肿瘤细胞中发生改变，这主要源于其受体或通路相关基因的突变和癌基因之间的相互作用。在肿瘤形成后期TGF-β会发挥促进肿瘤生长的功能，之后肿瘤细胞自身释放大量的活性TGF-β，这就有利于肿瘤的侵润、转移、血管生成以及对抗癌免疫功能的抑制(Hsu H J,Yang Y H,Shieh T Y,et al.TGF-β1and IL-10singlenucleotide polymorphisms as risk factors for oral cancer in Taiwanese[J].TheKaohsiung journal of medical sciences,2015,31(3):123-129.；Yue D,Zhang Z,Li J,et al.Transforming growth factor-beta1promotes the migration and invasion ofsphere-forming stem-like cell subpopulations in esophageal cancer[J].Experimental cell research,2015,336(1):141-149.)，TGF-β的这种双面功能使得其有望作为肿瘤治疗的靶标。
目前，针对实体瘤的CAR-T细胞治疗进展缓慢且效果不佳，缺乏安全有效的特异性肿瘤抗原靶点是重要的阻碍因素之一，鉴于此，本发明人选用B7H3作为靶点，制备靶向B7H3的CAR、及CAR-T细胞，所述CAR包含B7H3抗原结合结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域以及人源Ski，制备得到的CAR-T不仅对表达B7H3的肿瘤细胞具有高效的杀伤能力，而且高表达Ski后的CAR-T能够拮抗TGF-β信号，进一步增强CAR-T细胞的杀伤功能，可针对广谱的实体肿瘤，应用范围广，不但对本领域具有较高的参考价值，而且具有良好的应用潜力。
发明内容
为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本发明人对本领域存在的技术缺陷进行了深入研究，在付出了大量的创造性劳动后，完成了本发明。
具体而言，本发明所要解决的技术问题是：提供一种拮抗TGF-β的CAR-T细胞、及其构建方法和应用，以提高免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效果，进一步提高免疫细胞对实体瘤的治疗效果。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：
第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体。
进一步，所述嵌合抗原受体包括胞外结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域和拮抗TGF-β的结构域依次串联而成；
优选地，所述胞外结构域包括与B7H3特异性结合的抗体scFv；
更优选地，所述scFv的氨基酸序列具有(I)、(II)、(III)所示的氨基酸序列中的任意一个：
(I)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(II)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；
(III)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
最优选地，所述scFv的氨基酸序列为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
优选地，所述胞外结构域还包括铰链区；
更优选地，所述铰链区包含选自CD8α，CD28，4-1BB，PD-1、CD34、OX40，CD3ε、IgG1、IgG4蛋白质的铰链区；
最优选地，所述铰链区为CD8α蛋白质的铰链区；
最优选地，所述铰链区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；
最优选地，所述铰链区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
优选地，所述胞外结构域还包括胞外信号肽；
更优选地，所述胞外信号肽包含选自CD8、CD45、CD3ζ、CD28、CD3ε、CD45、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD4、CD5、CD9、CD80、CD86、ICOS、CD154、GITR、CD134、CD137、GM-CSF、IgG6信号肽；
最优选地，所述胞外信号肽为IgG6信号肽；
最优选地，所述胞外信号肽包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或与如SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；
最优选地，所述胞外信号肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
优选地，所述跨膜结构域包含选自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154蛋白质的跨膜结构域；
更优选地，所述跨膜结构域为CD8α的跨膜结构域；
最优选地，所述跨膜结构域包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或与如SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；
最优选地，所述跨膜结构域的氨基酸序列为如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
优选地，所述胞内信号结构域包括信号转导结构域；
更优选地，所述信号转导结构域包含选自CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d的功能性信号传导结构域；
最优选地，所述信号转导结构域为CD3ζ的功能性信号传导结构域；
最优选地，所述信号转导结构域包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；
最优选地，所述信号转导结构域的氨基酸序列为如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
优选地，所述胞内信号结构域还包括共刺激信号结构域；
更优选地，所述共刺激信号结构域包含选自CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、OX40、CDS、ICAM-1、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β的功能性信号传导结构域；
最优选地，所述共刺激信号结构域为CD28的功能性信号传导结构域；
最优选地，所述共刺激信号结构域包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；
最优选地，所述共刺激信号结构域的氨基酸序列为如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
优选地，所述拮抗TGF-β的结构域包括与TGF-β特异性结合的抗体、编码抑制TGF-β信号传导的蛋白的核酸分子；
更优选地，所述拮抗TGF-β的结构域为人源Ski；
最优选地，所述拮抗TGF-β的结构域包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或与如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；
最优选地，所述拮抗TGF-β的结构域的氨基酸序列为如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括自裂解肽T2A；
更优选地，所述自裂解肽T2A包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与如SEQID NO:8所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；
最优选地，所述自裂解肽T2A的氨基酸序列为如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
优选地，所述嵌合抗原受体由IgG6信号肽、scFv、CD8α的铰链区、CD8α的跨膜结构域、CD28的功能性信号传导结构域、CD3ζ的功能性信号传导结构域、自裂解肽T2A、人源Ski依次串联得到；
更优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列为如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供了一种核酸分子。
进一步，所述核酸分子包括编码本发明第一方面所述嵌合抗原受体的核酸分子；
优选地，所述scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
优选地，所述CD8α铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
优选地，所述IgG6信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
优选地，所述CD8α跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；
优选地，所述CD3ζ信号转导结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；
优选地，所述CD28共刺激信号结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；
优选地，所述自裂解肽T2A的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；
优选地，所述人源Ski的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；
更优选地，所述编码本发明第一方面所述嵌合抗原受体的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
第三方面，本发明提供了一种核酸构建物。
进一步，所述核酸构建物含有本发明第二方面所述的核酸分子；
优选地，所述核酸构建物还包含与本发明第二方面所述核酸分子操作性连接、指导本发明第一方面所述嵌合抗原受体在宿主细胞中表达的一个或多个调控序列；
更优选地，所述调控序列包括启动子序列、转录终止子序列、前导序列；
最优选地，所述启动子包括CMV启动子、EF-1α启动子、SV40早期启动子、MMTV启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子、肌酸激酶启动子、金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子、四环素启动子；
最优选地，所述转录终止子包括CYC1转录终止子、T7转录终止子、rrnBT1转录终止子、rrnBT2转录终止子、ADH1转录终止子、TIF51A转录终止子、ALG6转录终止子、AOD转录终止子、AOX1转录终止子、ARG4转录终止子、PMA1转录终止子、TEF1转录终止子、TT1转录终止子、TT2转录终止子。
第四方面，本发明提供了一种重组载体。
进一步，所述重组载体含有本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的核酸构建物；
优选地，所述载体包括克隆载体、表达载体；
优选地，所述载体包括DNA载体、RNA载体、质粒、病毒来源的载体；
更优选地，所述病毒来源的载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体。
第五方面，本发明提供了一种重组宿主细胞。
进一步，所述重组宿主细胞含有本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的核酸构建物、本发明第四方面所述的重组载体；
优选地，所述宿主细胞包括哺乳动物细胞、植物细胞、细菌、酵母细胞、真菌细胞；
优选地，所述宿主细胞包括免疫细胞；
更优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞或其任意组合；
最优选地，所述免疫细胞为T淋巴细胞。
第六方面，本发明提供了一种重组宿主细胞群体。
进一步，所述重组宿主细胞群体包括本发明第五方面所述的重组宿主细胞；
优选地，所述宿主细胞群体还包含不包含本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的核酸构建物、本发明第四方面所述的重组载体的宿主细胞；
更优选地，所述宿主细胞包括免疫细胞；
最优选地，所述免疫细胞包括为T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞或其任意组合。
第七方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体的衍生物。
进一步，所述衍生物包括本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的核酸构建物、本发明第四方面所述的重组载体、本发明第五方面所述的重组宿主细胞、本发明第六方面所述的重组宿主细胞群体；
优选地，所述衍生物包括药物组合物、试剂盒、缀合物；
更优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料；
更优选地，所述试剂盒还包括将本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的核酸构建物、本发明第四方面所述的重组载体引入到宿主细胞中的各种试剂；
更优选地，所述缀合物还包括修饰部分；
最优选地，所述修饰部分包括荧光化合物、酶、辅基、发光材料、生物发光材料、发射荧光的金属原子；
最优选地，所述荧光化合物包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白；
最优选地，所述酶包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶；
最优选地，所述辅基包括链霉亲和素、生物素、抗生物素蛋白；
最优选地，所述发光材料包括鲁米诺；
最优选地，所述生物发光材料荧光素酶、荧光素、水母发光蛋白；
最优选地，所述发射荧光的金属原子包括铕(Eu)。
第八方面，本发明提供了一种细胞注射液。
进一步，所述细胞注射液含有本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的核酸构建物、本发明第四方面所述的重组载体、本发明第五方面所述的重组宿主细胞、本发明第六方面所述的重组宿主细胞群体。
第九方面，本发明提供了如下任一种方法：
(1)一种制备本发明第五方面所述的重组宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的核酸构建物、本发明第四方面所述的重组载体引入到宿主细胞中；
优选地，所述引入的方法包括物理方法、化学方法、生物方法；
更优选地，所述物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔；
更优选地，所述化学方法包括胶体分散系统、基于脂质的系统；
最优选地，所述胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；
最优选地，所述基于脂质的系统包括水包油乳剂、胶束、混合胶束、脂质体；
更优选地，所述生物方法包括DNA载体、RNA载体、慢病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体；
(2)一种调节受试者体内的免疫应答的方法，所述方法包括如下步骤：向受试者施用本发明第五方面所述的重组宿主细胞、本发明第六方面所述的重组宿主细胞群体、本发明第七方面中所述的药物组合物、本发明第八方面所述的细胞注射液。
进一步，所述方法还包括一种治疗患有表达B7H3肿瘤的受试者的方法，所述方法包括如下步骤：向有需要的受试者施用本发明第五方面所述的重组宿主细胞、本发明第六方面所述的重组宿主细胞群体、本发明第七方面中所述的药物组合物、本发明第八方面所述的细胞注射液；
(3)一种筛选预防和/或治疗肿瘤的候选药物的方法，所述方法包括如下步骤：
(I)提供待测物质以及阳性对照物质，所述的阳性对照物质为本发明第五方面所述的重组宿主细胞和/或本发明第六方面所述的重组宿主细胞群体；
(II)在测试组中，检测步骤(I)中所述待测物质对肿瘤细胞的杀伤效果，并与阳性对照组以及阴性对照组中相应的实验结果进行比较；
优选地，在步骤(II)中，将测试组与阳性对照组以及阴性对照组的实验结果进行比较，如果测试组中对肿瘤细胞的杀伤效果显著低于阴性对照组，且测试组中待测物质对肿瘤细胞的杀伤效果(A1)/阳性对照组中本发明第五方面所述的重组宿主细胞和/或本发明第六方面所述的重组宿主细胞群体对肿瘤细胞的杀伤效果(A2)≥80％，则提示所述待测物质是预防和/或治疗肿瘤的候选药物；
优选地，所述方法还包括：进一步对步骤(II)筛选出的候选药物进行测定，以评价其对预防和/或治疗肿瘤的效果；
优选地，所述肿瘤细胞为表达B7H3和/或CD20的肿瘤细胞；
更优选地，所述肿瘤包括卵巢癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、食管癌、前列腺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌、肝癌、膀胱癌、骨肉瘤、非霍奇金淋巴瘤；
最优选地，所述肿瘤为肺癌。
第十方面，本发明提供了如下任一方面的应用：
(1)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的核酸构建物、本发明第四方面所述的重组载体、本发明第五方面所述的重组宿主细胞、本发明第六方面所述的重组宿主细胞群体在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；
(2)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的核酸构建物、本发明第四方面所述的重组载体、本发明第五方面所述的重组宿主细胞、本发明第六方面所述的重组宿主细胞群体在制备用于制备预防和/或治疗肿瘤的免疫细胞的试剂盒中的应用；
(3)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的核酸构建物、本发明第四方面所述的重组载体、本发明第五方面所述的重组宿主细胞、本发明第六方面所述的重组宿主细胞群体在制备用于预防和/或治疗肿瘤的细胞注射液中的应用；
(4)本发明第七方面中所述的药物组合物在预防和/或治疗肿瘤中的应用；
(5)本发明第七方面中所述的试剂盒在制备用于预防和/或治疗肿瘤的免疫细胞中的应用；
(6)本发明第八方面所述的细胞注射液在预防和/或治疗肿瘤中的应用；
(7)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体在制备核酸分子、核酸构建物、重组载体、重组宿主细胞、重组宿主细胞群体中的应用；
(8)本发明第二方面所述的核酸分子在制备核酸构建物、重组载体、重组宿主细胞、重组宿主细胞群体中的应用；
(9)本发明第三方面所述的核酸构建物在制备重组载体、重组宿主细胞、重组宿主细胞群体中的应用；
(10)本发明第四方面所述的重组载体在制备重组宿主细胞、重组宿主细胞群体中的应用；
(11)本发明第五方面所述的重组宿主细胞在制备重组宿主细胞群体中的应用；
(12)Ski在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；
(13)Ski在筛选预防和/或治疗肿瘤的候选药物中的应用；
(14)Ski在制备用于预防和/或治疗肿瘤的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞中的应用；
(15)Ski在促进预防和/或治疗肿瘤的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞增殖中的应用；
(16)Ski在促进预防和/或治疗肿瘤的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的杀伤作用中的应用；
优选地，所述嵌合抗原受体为本发明第一方面所述的嵌合抗原受体；
优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞或其任意组合；
更优选地，所述免疫细胞为T淋巴细胞；
优选地，所述肿瘤为表达B7H3和/或CD20的肿瘤；
更优选地，所述肿瘤包括卵巢癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、食管癌、前列腺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌、肝癌、膀胱癌、骨肉瘤、非霍奇金淋巴瘤；
最优选地，所述肿瘤为肺癌。
采用上述技术方案后，本发明的有益效果是：
本发明提供了靶向B7H3的CAR、及CAR-T细胞，所述CAR包含B7H3抗原结合结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域以及人源Ski，制备得到的CAR-T不仅对表达B7H3的肿瘤细胞具有高效的杀伤能力，而且高表达Ski后的CAR-T能够拮抗TGF-β信号，进一步增强CAR-T细胞的杀伤功能，可针对广谱的实体肿瘤，应用范围广，不但对本领域具有较高的参考价值，而且具有良好的应用潜力。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示对制备得到的CAR-T细胞验证的结果图，其中，A图：利用流式细胞仪检测CAR-T中CAR的表达的结果图，B图：利用流式细胞仪检测CAR-T中CAR的表达的结果统计图，C图：CAR-T细胞生长曲线图，D图：Western blot检测CAR-T细胞中hSki的表达的结果图；
图2显示TGF-β对CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞能力影响的结果图；
图3显示hSki高表达的CAR-T细胞IFN-γ的分泌情况的结果图；
图4显示本发明制备得到的hSki高表达的CAR-T对小鼠肺癌移植瘤的清除能力的结果图，
其中，A：实验流程图，B：不同天数的小鼠体内的肿瘤体积的结果图，C：注射肿瘤细胞成瘤后的第51天小鼠体内的肿瘤体积的结果统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1hSki高表达的B7H3-CAR-T的制备
1、实验方法
(1)PBMC细胞的分离
1)采集健康志愿者外周血，室温1300g离心10分钟后弃掉血浆部分，剩余血细胞用等体积生理盐水稀释混匀；
2)将血细胞悬液缓慢加入到淋巴细胞分离液上层，室温600g离心25分钟；
3)吸取中间白膜层淋巴细胞，加入生理盐水洗涤，必要时做裂解红细胞处理，室温400g离心10分钟，弃上清，即得PBMC细胞。
(2)CAR表达载体的构建
1)合成靶向人B7H3的scFv编码序列，所述scFv包括重链VH和轻链VL，二者之间由3×G4S短肽连接；
2)将逆转录毒载体MSCV和步骤1)合成的靶向人B7H3的scFv经Nco I和Mlu I双酶切，进行片段回收，回收的目的片段用T4连接酶连接，然后转化Stbl3感受态细胞；
3)挑取单克隆进行质粒提取，经酶切鉴定后送测序确认，正确的质粒即为MSCV-M13B702。
上述构建方法中，重链VH的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，轻链VL的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，G4S短肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
(3)逆转录病毒包装
1)准备293T细胞铺板，3×106/100mm培养皿；
2)第二天，观察293T细胞状态，生长良好，进行转染；
3)用1.5mL EP管准备转染试剂：30μL Genejuice+470μL IMDM，室温孵育5min；
4)将MSCV-M13B702穿梭质粒与辅助质粒pCL-Ampho按照总量10μg，比例为3:2，依次加入新的1.5mL EP管，为DNA Mix；
5)将一份转染试剂加入至DNA Mix中，轻轻混匀，室温孵育15min；
6)标记培养皿，将上步所得试剂分别加入皿中，48-72h后收取病毒上清；
7)取上清，分装于1.5mL EP管中，每管1mL，-80℃冰箱保存备用。
(4)逆转录病毒转导
1)Day-1：hCD3/CD28抗体包被24孔板；
2)Day0：复苏人PBMC，计数，L500培养基(L500+10％FBS+1％P.S.，CAR-T细胞制备期间添加细胞因子5ng/mL IL-15、10ng/mL IL-7)重悬细胞至1×106/mL，弃去包被液，每孔接种细胞1mL；
3)Day1：1μg/mL Retronectin包被24孔板；
4)Day2：细胞活化48h后，进行CAR病毒感染，收集细胞至离心管，计数后按照(0.5-1)×106个细胞每管分配，离心后弃去上清，用1mL病毒液重悬T细胞，将T细胞接种于该24孔板中，30℃1500g离心2小时，轻轻弃掉上清液，缓慢加入含有细胞因子的L500培养基。
(5)hSki高表达的B7H3-CAR-T细胞的扩增
Day4-Day14：根据细胞生长情况和细胞数量，补加培养基，使细胞密度维持在(0.5-1)×106/mL。
(6)CAR表达效率的检测
Day4：流式检测T细胞纯度和CAR阳性率，用B7H3-Fc蛋白标记细胞，室温孵育20min后清洗，再加入PE-Anti Human IgG-Fc抗体，室温避光孵育20min后清洗，最后进行APC-CD3染色，应用流式细胞仪进行分析。
2、实验结果
实验结果见图1A-D，结果显示：本发明构建的B7H3-CAR-T细胞中含有Ski基因，表明了本发明成功构建了含有人Ski基因靶向B7H3的全人源CAR，并进一步制备成B7H3-CAR-T细胞，流式细胞仪分析的结果显示：hSki高表达的B7H3-CAR-T细胞中CAR表达阳性率高达90％，Ski在制备的CAR-T细胞中高效表达，Ski的表达不但不会影响CAR表达阳性率，而且会促进B7H3-CAR-T细胞的增殖。
实施例2hSki高表达的B7H3-CAR-T细胞有效拮抗TGF-β免疫抑制
1、实验方法
(1)24孔板，根据实验需要确定所需的孔板数，消化处理肿瘤细胞后，每孔铺约50000个，此时应用加入血清双抗的L500基础培养基；
(2)待肿瘤细胞贴壁(约5个小时)后，依次按照效靶比1:1、1:2.5、1:5加入不同组的CAR-T(提前检测好CAR-T阳性率，确保为同一批次制备的CAR-T)，并设置添加3ng/mLTGF-β的实验对照组，每孔定容2mL(使用加入血清双抗的L500基础培养基)；
(3)并收取相应效靶比的各管与T细胞混合悬液，用APC-CD3抗体标记染色，用流式检测不同组不同效靶比情况下的肿瘤细胞与CAR-T的初始比例；
(4)过程中使用显微镜观察CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果，必要时补充培养基或者更换培养基；
(5)待肿瘤杀伤到一定程度，效靶比1:1杀伤显著时，分别收取各孔悬浮的CAR-T细胞和消化收取肿瘤细胞，用APC-CD3抗体标记染色，用流式检测不同组不同效靶比情况下的肿瘤细胞与CAR-T的比例；
(6)FlowJ分析流式检测结果。
2、实验结果
实验结果见图2，将28ζ及28ζ-hSki CAR-T细胞以不同效靶比(E:T＝1:1、1:2.5、1:5)与A549肺癌细胞共孵育，添加或不添加3ng/mL TGF-β处理，0小时收取初始三种效靶比的混合细胞悬液，应用CD3-APC流式抗体染色，流式细胞仪检测两种细胞组分的初始比例。共孵育60小时后收取各实验样品的CAR-T及A549细胞，进行CD3-APC抗体染色，通过流式分析CAR-T及A549细胞比例，以评估28ζ及28ζ-hSki CAR-T细胞对A549肿瘤细胞的杀伤能力。结果显示：在无TGF-β的情况下，28ζ和28ζ-hSki CAR-T细胞杀伤A549效果无显著差异；但在TGF-β存在时，28ζCAR-T的杀伤功能明显受到抑制，而28ζ-hSki CAR-T则基本不受影响，表明了28ζ-hSki CAR-T细胞能拮抗TGF-β的免疫抑制作用，高效杀伤肿瘤细胞，在实体瘤微环境中具有更好的杀伤效果。
实施例3hSki高表达的B7H3-CAR-T细胞IFN-γ的分泌情况
1、实验方法
(1)12孔板，根据实验需要确所需的孔板数，消化处理肿瘤细胞后，每孔铺约150000个，此时应用加入血清双抗的L500基础培养基；
(2)待肿瘤细胞贴壁(约5个小时)后，依次按照效靶比1:1、1:2.5、1:5加入不同组的CAR-T(提前检测好CAR-T阳性率，确保为同一批次制备的CAR-T)，并设置添加3ng/mLTGF-β的实验对照组，每孔定容2mL(使用加入血清双抗的L500基础培养基)；
(3)设置空白对照孔按效靶比1:1时的CAR-T细胞数量在与第(2)步相同的培养条件下分别单独培养28ζ及28ζ-hSki CAR-T细胞，作为共培养前后的差异对照；
(4)48h后收取各组的CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养的上清200-500μL至EP管中(尽量不要收到细胞，必要时离心取上清)，标记名称时间，-80℃冰箱冻存备用；
(5)提前一天在实验板条中预包备Capture mAb 1-D1k，用pH 7.4的PBS稀释至终浓度2μg/mL，每孔100μL，4℃过夜；
(6)PBS清洗预包备的板条两次(200μL/孔)；
(7)加入含有0.05％Tween-20和1％BSA的PBS，200μL/孔，室温孵育1h；
(8)处理提前取出在冰上融化已分装的IFN-γ标准品(1μg/mL)及待检测样品；IFN-γ标准品倍比稀释至七个梯度浓度，即500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8pg/mL，待检测样品均50倍稀释；稀释标准品和样品均使用含有0.05％Tween-20和1％BSA的PBS；
(9)用含有0.05％Tween-20的PBS清洗板条5次，每次加入后静置1min，在废液缸中叩掉清洗液后，再在吸水纸上充分弃净，操作中避免各孔交叉污染；
(10)将稀释好的标准品和待检测样品按照次序以100μL/孔加入孔中，室温孵育2h；
(11)重复步骤(9)的操作；
(12)加入100μL 1μg/mL的Detection mAb 7-B6-1，室温孵育1h(使用含有0.05％Tween-20和1％BSA的PBS稀释)；
(13)重复步骤(9)的操作；
(14)加入100μL 1:1000稀释的Streptavidin-HRP，室温孵育1h(使用含有0.05％Tween-20和1％BSA的PBS稀释)；
(15)重复步骤(9)的操作；
(16)加入100μL TMB底物溶液，观察显色反应；
(17)观察约10min左右，高反应孔显示深蓝色即可加入终止液终止反应，蓝色变成黄色；终止液配制：9.1mL ddH2O+1mL浓硫酸；
(18)用酶标仪检测450nm波长下各孔的光密度(OD值)；
(19)拷贝数据，进行分析。
2、实验结果
实验结果见图3，将28ζ及28ζ-hSki CAR-T细胞以不同效靶比(E:T＝1:1、1：2.5、1：5)与A549肺癌细胞共孵育，添加或不添加3ng/mL TGF-β处理。0小时直接收取混合的细胞培养上清作为空白组(Blank)，48h后再次收集培养上清，ELISA检测上清中IFN-γ的含量，结果显示：未接触靶细胞前，28ζ-hSki CAR-T细胞分泌IFN-γ能力显著高于28ζCAR-T细胞；与靶细胞A549共孵育后28ζ和28ζ-hSki CAR-T细胞的IFN-γ分泌量显著上升，说明CAR-T细胞被激活；但当TGF-β存在时，28ζCAR-T细胞的IFN分泌显著降低，而28ζ-hSki CAR-T细胞仍保持较高水平的IFN-γ分泌。进一步表明了28ζ-hSki CAR-T细胞能拮抗TGF-β的免疫抑制作用。
实施例4hSki高表达的B7H3-CAR-T细胞体内清除肺癌皮下移植瘤的验证
1、实验方法
(1)4-6周龄NCG雌鼠，在小鼠右侧背部皮下注射含有1×107人肺癌细胞A549的细胞悬液150μL；
(2)持续观察皮下移植瘤增长情况，待瘤体逐渐增大时使用游标卡尺测量瘤体的长径(a)和短径(b)，瘤体体积为a×b2/2；
(3)待瘤体大小约为100-200mm3时，随机分为5组；
(4)将制备好的28ζ及28ζ-hSki CAR-T细胞，按照2×106/100μL、5×106/100μL的剂量分别给予荷瘤小鼠尾静脉注射治疗，PBS组作为对照；
(5)每3-4天测量小鼠体重、荷瘤体积的变化及观察治疗过程中的综合情况。
2、实验结果
实验结果见图4A-C，建立肺癌NCG小鼠皮下移植瘤模型，待小鼠荷瘤体积100-200mm3时，将小鼠随机分成5组(PBS、2×106 28ζ、5×106 28ζ、2×106 28ζ-hSki、5×106 28ζ-hSki)，每组6只，给予28ζ或28ζ-hSki CAR-T细胞2×106或者5×106治疗剂量的尾静脉给药，PBS组为对照组。连续检测小鼠体重、荷瘤体积的变化及观察治疗过程中的综合情况。自皮下移植瘤形成，每三天测量并记录小鼠体重及移植瘤的大小变化，计算出移植瘤体积，按照时间轴绘制出肿瘤生长曲线。结果显示：28ζ-hSki CAR-T细胞在较低剂量的情况下即可高效杀伤肺癌移植瘤，表明了28ζ-hSki CAR-T细胞杀伤肿瘤效果显著优于28ζCAR-T细胞。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 徐州医科大学
<120> Ski在制备增效型CAR-T细胞中的应用
<141> 2021-07-07
<150> 2021107393035
<151> 2021-06-30
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Phe Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
145 150 155 160
Ile Ser Ile Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro
165 170 175
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
195 200 205
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Tyr
210 215 220
Ser Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
225 230 235 240
<210> 2
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
35 40 45
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 4
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 5
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 6
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 7
<211> 728
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Glu Ala Ala Ala Gly Gly Arg Gly Cys Phe Gln Pro His Pro Gly
1 5 10 15
Leu Gln Lys Thr Leu Glu Gln Phe His Leu Ser Ser Met Ser Ser Leu
20 25 30
Gly Gly Pro Ala Ala Phe Ser Ala Arg Trp Ala Gln Glu Ala Tyr Lys
35 40 45
Lys Glu Ser Ala Lys Glu Ala Gly Ala Ala Ala Val Pro Ala Pro Val
50 55 60
Pro Ala Ala Thr Glu Pro Pro Pro Val Leu His Leu Pro Ala Ile Gln
65 70 75 80
Pro Pro Pro Pro Val Leu Pro Gly Pro Phe Phe Met Pro Ser Asp Arg
85 90 95
Ser Thr Glu Arg Cys Glu Thr Val Leu Glu Gly Glu Thr Ile Ser Cys
100 105 110
Phe Val Val Gly Gly Glu Lys Arg Leu Cys Leu Pro Gln Ile Leu Asn
115 120 125
Ser Val Leu Arg Asp Phe Ser Leu Gln Gln Ile Asn Ala Val Cys Asp
130 135 140
Glu Leu His Ile Tyr Cys Ser Arg Cys Thr Ala Asp Gln Leu Glu Ile
145 150 155 160
Leu Lys Val Met Gly Ile Leu Pro Phe Ser Ala Pro Ser Cys Gly Leu
165 170 175
Ile Thr Lys Thr Asp Ala Glu Arg Leu Cys Asn Ala Leu Leu Tyr Gly
180 185 190
Gly Ala Tyr Pro Pro Pro Cys Lys Lys Glu Leu Ala Ala Ser Leu Ala
195 200 205
Leu Gly Leu Glu Leu Ser Glu Arg Ser Val Arg Val Tyr His Glu Cys
210 215 220
Phe Gly Lys Cys Lys Gly Leu Leu Val Pro Glu Leu Tyr Ser Ser Pro
225 230 235 240
Ser Ala Ala Cys Ile Gln Cys Leu Asp Cys Arg Leu Met Tyr Pro Pro
245 250 255
His Lys Phe Val Val His Ser His Lys Ala Leu Glu Asn Arg Thr Cys
260 265 270
His Trp Gly Phe Asp Ser Ala Asn Trp Arg Ala Tyr Ile Leu Leu Ser
275 280 285
Gln Asp Tyr Thr Gly Lys Glu Glu Gln Ala Arg Leu Gly Arg Cys Leu
290 295 300
Asp Asp Val Lys Glu Lys Phe Asp Tyr Gly Asn Lys Tyr Lys Arg Arg
305 310 315 320
Val Pro Arg Val Ser Ser Glu Pro Pro Ala Ser Ile Arg Pro Lys Thr
325 330 335
Asp Asp Thr Ser Ser Gln Ser Pro Ala Pro Ser Glu Lys Asp Lys Pro
340 345 350
Ser Ser Trp Leu Arg Thr Leu Ala Gly Ser Ser Asn Lys Ser Leu Gly
355 360 365
Cys Val His Pro Arg Gln Arg Leu Ser Ala Phe Arg Pro Trp Ser Pro
370 375 380
Ala Val Ser Ala Ser Glu Lys Glu Leu Ser Pro His Leu Pro Ala Leu
385 390 395 400
Ile Arg Asp Ser Phe Tyr Ser Tyr Lys Ser Phe Glu Thr Ala Val Ala
405 410 415
Pro Asn Val Ala Leu Ala Pro Pro Ala Gln Gln Lys Val Val Ser Ser
420 425 430
Pro Pro Cys Ala Ala Ala Val Ser Arg Ala Pro Glu Pro Leu Ala Thr
435 440 445
Cys Thr Gln Pro Arg Lys Arg Lys Leu Thr Val Asp Thr Pro Gly Ala
450 455 460
Pro Glu Thr Leu Ala Pro Val Ala Ala Pro Glu Glu Asp Lys Asp Ser
465 470 475 480
Glu Ala Glu Val Glu Val Glu Ser Arg Glu Glu Phe Thr Ser Ser Leu
485 490 495
Ser Ser Leu Ser Ser Pro Ser Phe Thr Ser Ser Ser Ser Ala Lys Asp
500 505 510
Leu Gly Ser Pro Gly Ala Arg Ala Leu Pro Ser Ala Val Pro Asp Ala
515 520 525
Ala Ala Pro Ala Asp Ala Pro Ser Gly Leu Glu Ala Glu Leu Glu His
530 535 540
Leu Arg Gln Ala Leu Glu Gly Gly Leu Asp Thr Lys Glu Ala Lys Glu
545 550 555 560
Lys Phe Leu His Glu Val Val Lys Met Arg Val Lys Gln Glu Glu Lys
565 570 575
Leu Ser Ala Ala Leu Gln Ala Lys Arg Ser Leu His Gln Glu Leu Glu
580 585 590
Phe Leu Arg Val Ala Lys Lys Glu Lys Leu Arg Glu Ala Thr Glu Ala
595 600 605
Lys Arg Asn Leu Arg Lys Glu Ile Glu Arg Leu Arg Ala Glu Asn Glu
610 615 620
Lys Lys Met Lys Glu Ala Asn Glu Ser Arg Leu Arg Leu Lys Arg Glu
625 630 635 640
Leu Glu Gln Ala Arg Gln Ala Arg Val Cys Asp Lys Gly Cys Glu Ala
645 650 655
Gly Arg Leu Arg Ala Lys Tyr Ser Ala Gln Ile Glu Asp Leu Gln Val
660 665 670
Lys Leu Gln His Ala Glu Ala Asp Arg Glu Gln Leu Arg Ala Asp Leu
675 680 685
Leu Arg Glu Arg Glu Ala Arg Glu His Leu Glu Lys Val Val Lys Glu
690 695 700
Leu Gln Glu Gln Leu Trp Pro Arg Ala Arg Pro Glu Ala Ala Gly Ser
705 710 715 720
Glu Gly Ala Ala Glu Leu Glu Pro
725
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 9
<211> 1234
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Phe Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Val Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser
145 150 155 160
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
165 170 175
Ser Gln Ser Ile Ser Ile Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly
180 185 190
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly
195 200 205
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
210 215 220
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln
225 230 235 240
Gln Thr Tyr Ser Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
245 250 255
Asp Ile Lys Thr Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
275 280 285
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
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Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
305 310 315 320
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser Arg
325 330 335
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
340 345 350
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
355 360 365
Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
370 375 380
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
385 390 395 400
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
405 410 415
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
420 425 430
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
435 440 445
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
450 455 460
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
465 470 475 480
Pro Pro Arg Ala Cys Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr
485 490 495
Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Ala Ala Ala Gly
500 505 510
Gly Arg Gly Cys Phe Gln Pro His Pro Gly Leu Gln Lys Thr Leu Glu
515 520 525
Gln Phe His Leu Ser Ser Met Ser Ser Leu Gly Gly Pro Ala Ala Phe
530 535 540
Ser Ala Arg Trp Ala Gln Glu Ala Tyr Lys Lys Glu Ser Ala Lys Glu
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Ala Gly Ala Ala Ala Val Pro Ala Pro Val Pro Ala Ala Thr Glu Pro
565 570 575
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580 585 590
Pro Gly Pro Phe Phe Met Pro Ser Asp Arg Ser Thr Glu Arg Cys Glu
595 600 605
Thr Val Leu Glu Gly Glu Thr Ile Ser Cys Phe Val Val Gly Gly Glu
610 615 620
Lys Arg Leu Cys Leu Pro Gln Ile Leu Asn Ser Val Leu Arg Asp Phe
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Ser Arg Cys Thr Ala Asp Gln Leu Glu Ile Leu Lys Val Met Gly Ile
660 665 670
Leu Pro Phe Ser Ala Pro Ser Cys Gly Leu Ile Thr Lys Thr Asp Ala
675 680 685
Glu Arg Leu Cys Asn Ala Leu Leu Tyr Gly Gly Ala Tyr Pro Pro Pro
690 695 700
Cys Lys Lys Glu Leu Ala Ala Ser Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ser
705 710 715 720
Glu Arg Ser Val Arg Val Tyr His Glu Cys Phe Gly Lys Cys Lys Gly
725 730 735
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740 745 750
Cys Leu Asp Cys Arg Leu Met Tyr Pro Pro His Lys Phe Val Val His
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Ser His Lys Ala Leu Glu Asn Arg Thr Cys His Trp Gly Phe Asp Ser
770 775 780
Ala Asn Trp Arg Ala Tyr Ile Leu Leu Ser Gln Asp Tyr Thr Gly Lys
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Phe Asp Tyr Gly Asn Lys Tyr Lys Arg Arg Val Pro Arg Val Ser Ser
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Glu Pro Pro Ala Ser Ile Arg Pro Lys Thr Asp Asp Thr Ser Ser Gln
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Ser Pro Ala Pro Ser Glu Lys Asp Lys Pro Ser Ser Trp Leu Arg Thr
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Leu Ala Gly Ser Ser Asn Lys Ser Leu Gly Cys Val His Pro Arg Gln
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Lys Glu Leu Ser Pro His Leu Pro Ala Leu Ile Arg Asp Ser Phe Tyr
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Ser Tyr Lys Ser Phe Glu Thr Ala Val Ala Pro Asn Val Ala Leu Ala
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930 935 940
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965 970 975
Val Ala Ala Pro Glu Glu Asp Lys Asp Ser Glu Ala Glu Val Glu Val
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Glu Ser Arg Glu Glu Phe Thr Ser Ser Leu Ser Ser Leu Ser Ser Pro
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Ser Phe Thr Ser Ser Ser Ser Ala Lys Asp Leu Gly Ser Pro Gly Ala
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Pro Ser Gly Leu Glu Ala Glu Leu Glu His Leu Arg Gln Ala Leu Glu
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Gly Gly Leu Asp Thr Lys Glu Ala Lys Glu Lys Phe Leu His Glu Val
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Val Lys Met Arg Val Lys Gln Glu Glu Lys Leu Ser Ala Ala Leu Gln
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Ala Lys Arg Ser Leu His Gln Glu Leu Glu Phe Leu Arg Val Ala Lys
1090 1095 1100
Lys Glu Lys Leu Arg Glu Ala Thr Glu Ala Lys Arg Asn Leu Arg Lys
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Glu Ile Glu Arg Leu Arg Ala Glu Asn Glu Lys Lys Met Lys Glu Ala
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Asn Glu Ser Arg Leu Arg Leu Lys Arg Glu Leu Glu Gln Ala Arg Gln
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Ala Arg Val Cys Asp Lys Gly Cys Glu Ala Gly Arg Leu Arg Ala Lys
1155 1160 1165
Tyr Ser Ala Gln Ile Glu Asp Leu Gln Val Lys Leu Gln His Ala Glu
1170 1175 1180
Ala Asp Arg Glu Gln Leu Arg Ala Asp Leu Leu Arg Glu Arg Glu Ala
1185 1190 1195 1200
Arg Glu His Leu Glu Lys Val Val Lys Glu Leu Gln Glu Gln Leu Trp
1205 1210 1215
Pro Arg Ala Arg Pro Glu Ala Ala Gly Ser Glu Gly Ala Ala Glu Leu
1220 1225 1230
Glu Pro
<210> 10
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaggtgcagc tgttccagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc caggggtgtt 300
ggccggggct ttgactactg gggccagggg accacggtca ccgtctcctc aagtggcggt 360
ggctctggcg gtggtgggtc gggtggcggc ggatcagaca tccagttgac ccagtctcca 420
tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc 480
attagcatct atttaaattg gtatcggcag caaccaggga aagcccctaa gctcctgatc 540
tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg 600
acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttacttctgt 660
caacagactt acagtacccc tccgtggacg ttcggccaag ggaccaaagt ggatatcaaa 720
<210> 11
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgatatcta c 141
<210> 12
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggaatttg gcctgagctg gctgtttctg gtggcgattc tgaaaggcgt gcagtgcga 59
<210> 13
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 60
tactgc 66
<210> 14
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 15
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 16
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gagggcagag gcagcctgct gacatgtggc gacgtggaag agaaccctgg cccc 54
<210> 17
<211> 2187
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atggaggcgg cggcaggcgg ccgcggctgt ttccagccgc acccggggct gcagaagacg 60
ctggagcagt tccacctgag ctccatgagc tcgctgggcg gcccggccgc tttctcggcg 120
cgctgggcgc aggaggccta caagaaggag agcgccaagg aggcgggcgc ggccgcggtg 180
ccggcgccgg tgcccgcagc caccgagccg ccgcccgtgc tgcacctgcc cgccatccag 240
ccgccgccgc ccgtgctgcc cgggcccttc ttcatgccgt ccgaccgctc caccgagcgc 300
tgcgagaccg tactggaagg cgagaccatc tcgtgcttcg tggtgggagg cgagaagcgc 360
ctgtgtctgc cgcagattct caactcggtg ctgcgcgact tctcgctgca gcagatcaac 420
gcggtgtgcg acgagctcca catctactgc tcgcgctgca cggccgacca gctggagatc 480
ctcaaagtca tgggcatcct gcccttctcg gcgccctcgt gcgggctcat caccaagacg 540
gacgccgagc gcctgtgcaa cgcgctgctc tacggcggcg cctacccgcc gccctgcaag 600
aaggagctgg ccgccagcct ggcgctgggc ctggagctca gcgagcgcag cgtccgcgtg 660
taccacgagt gcttcggcaa gtgtaagggg ctgctggtgc ccgagctcta cagcagcccg 720
agcgccgcct gcatccagtg cctggactgc cgcctcatgt acccgccgca caagttcgtg 780
gtgcactcgc acaaggccct ggagaaccgg acctgccact ggggcttcga ctcggccaac 840
tggcgggcct acatcctgct gagccaggat tacacgggca aggaggagca ggcgcgcctc 900
ggccgctgcc tggacgacgt gaaggagaaa ttcgactatg gcaacaagta caagcggcgg 960
gtgccccggg tctcctctga gcctccggcc tccataagac ccaaaacaga tgacacctct 1020
tcccagtccc ccgcgccttc cgaaaaggac aagccgtcca gctggctgcg gaccttggcc 1080
ggctcttcca ataagagcct gggctgtgtt caccctcgcc agcgcctctc tgctttccga 1140
ccctggtccc ccgcagtgtc agcgagtgag aaagagctct ccccacacct cccggccctc 1200
atccgagaca gcttctactc ctacaagagc tttgagacag ccgtggcgcc caacgtggcc 1260
ctcgcaccgc cggcccagca gaaggttgtg agcagccctc cgtgtgccgc cgccgtctcc 1320
cgggcccccg agcctctcgc cacttgcacc cagcctcgga agcggaagct gactgtggac 1380
accccaggag ccccagagac gctggcgccc gtggctgccc cagaggagga caaggactcg 1440
gaggcggagg tggaagttga aagcagggag gaattcacct cctccttgtc ctcgctctct 1500
tccccgtcct ttacctcatc cagctccgcc aaggacctgg gctccccggg tgcgcgtgcc 1560
ctgccctcgg ccgtccctga tgctgcggcc cctgccgacg cccccagtgg gctggaggcg 1620
gagctggagc acctgcggca ggcactggag ggcggcctgg acaccaagga agccaaagag 1680
aagttcctgc atgaggtggt caagatgcgc gtgaagcagg aggagaagct cagcgcagcc 1740
ctgcaggcca agcgcagcct ccaccaggag ctggagttcc tacgcgtggc caagaaggag 1800
aagctgcggg aggccacgga ggccaagcgt aacctgcgga aggagatcga gcgtctccgc 1860
gccgagaacg agaagaagat gaaagaggcc aacgagtcac ggctgcgcct gaagcgggag 1920
ctggagcagg cgcggcaggc ccgggtgtgc gacaagggct gcgaggcggg ccgcctgcgc 1980
gccaagtact cggcccagat cgaagacctg caggtgaagc tgcagcacgc ggaggcggac 2040
cgggagcagc tgcgggccga cctgctgcgg gagcgcgagg cccgggagca cctggagaag 2100
gtggtgaagg agctgcagga acagctgtgg ccgcgggccc gccccgaggc tgcgggcagc 2160
gagggcgctg cggagctgga gccgtag 2187
<210> 18
<211> 3705
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atggaatttg gcctgagctg gctgtttctg gtggcgattc tgaaaggcgt gcagtgcgag 60
gtgcagctgt tccagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcac ctttagcagc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180
gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatt agtggtagtg gtggtagcac atactacgca 240
gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgccag gggtgttggc 360
cggggctttg actactgggg ccaggggacc acggtcaccg tctcctcaag tggcggtggc 420
tctggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga tcagacatcc agttgaccca gtctccatcc 480
tccctgtctg catctgtagg agacagagtc accatcactt gccgggcaag tcagagcatt 540
agcatctatt taaattggta tcggcagcaa ccagggaaag cccctaagct cctgatctat 600
gctgcatcca gtttgcaaag tggggtccca tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca 660
gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa cctgaagatt ttgcaactta cttctgtcaa 720
cagacttaca gtacccctcc gtggacgttc ggccaaggga ccaaagtgga tatcaaaacg 780
cgtaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 840
ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 900
ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 960
ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt 1020
gactacatga acatgactcc ccgccgcccc gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat 1080
gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc tccagagtga agttcagcag gagcgcagac 1140
gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1200
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1260
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1320
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1380
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1440
ccccctcgcg catgcggatc tggagagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg 1500
gaggagaatc ccggccctat ggaggcggcg gcaggcggcc gcggctgttt ccagccgcac 1560
ccggggctgc agaagacgct ggagcagttc cacctgagct ccatgagctc gctgggcggc 1620
ccggccgctt tctcggcgcg ctgggcgcag gaggcctaca agaaggagag cgccaaggag 1680
gcgggcgcgg ccgcggtgcc ggcgccggtg cccgcagcca ccgagccgcc gcccgtgctg 1740
cacctgcccg ccatccagcc gccgccgccc gtgctgcccg ggcccttctt catgccgtcc 1800
gaccgctcca ccgagcgctg cgagaccgta ctggaaggcg agaccatctc gtgcttcgtg 1860
gtgggaggcg agaagcgcct gtgtctgccg cagattctca actcggtgct gcgcgacttc 1920
tcgctgcagc agatcaacgc ggtgtgcgac gagctccaca tctactgctc gcgctgcacg 1980
gccgaccagc tggagatcct caaagtcatg ggcatcctgc ccttctcggc gccctcgtgc 2040
gggctcatca ccaagacgga cgccgagcgc ctgtgcaacg cgctgctcta cggcggcgcc 2100
tacccgccgc cctgcaagaa ggagctggcc gccagcctgg cgctgggcct ggagctcagc 2160
gagcgcagcg tccgcgtgta ccacgagtgc ttcggcaagt gtaaggggct gctggtgccc 2220
gagctctaca gcagcccgag cgccgcctgc atccagtgcc tggactgccg cctcatgtac 2280
ccgccgcaca agttcgtggt gcactcgcac aaggccctgg agaaccggac ctgccactgg 2340
ggcttcgact cggccaactg gcgggcctac atcctgctga gccaggatta cacgggcaag 2400
gaggagcagg cgcgcctcgg ccgctgcctg gacgacgtga aggagaaatt cgactatggc 2460
aacaagtaca agcggcgggt gccccgggtc tcctctgagc ctccggcctc cataagaccc 2520
aaaacagatg acacctcttc ccagtccccc gcgccttccg aaaaggacaa gccgtccagc 2580
tggctgcgga ccttggccgg ctcttccaat aagagcctgg gctgtgttca ccctcgccag 2640
cgcctctctg ctttccgacc ctggtccccc gcagtgtcag cgagtgagaa agagctctcc 2700
ccacacctcc cggccctcat ccgagacagc ttctactcct acaagagctt tgagacagcc 2760
gtggcgccca acgtggccct cgcaccgccg gcccagcaga aggttgtgag cagccctccg 2820
tgtgccgccg ccgtctcccg ggcccccgag cctctcgcca cttgcaccca gcctcggaag 2880
cggaagctga ctgtggacac cccaggagcc ccagagacgc tggcgcccgt ggctgcccca 2940
gaggaggaca aggactcgga ggcggaggtg gaagttgaaa gcagggagga attcacctcc 3000
tccttgtcct cgctctcttc cccgtccttt acctcatcca gctccgccaa ggacctgggc 3060
tccccgggtg cgcgtgccct gccctcggcc gtccctgatg ctgcggcccc tgccgacgcc 3120
cccagtgggc tggaggcgga gctggagcac ctgcggcagg cactggaggg cggcctggac 3180
accaaggaag ccaaagagaa gttcctgcat gaggtggtca agatgcgcgt gaagcaggag 3240
gagaagctca gcgcagccct gcaggccaag cgcagcctcc accaggagct ggagttccta 3300
cgcgtggcca agaaggagaa gctgcgggag gccacggagg ccaagcgtaa cctgcggaag 3360
gagatcgagc gtctccgcgc cgagaacgag aagaagatga aagaggccaa cgagtcacgg 3420
ctgcgcctga agcgggagct ggagcaggcg cggcaggccc gggtgtgcga caagggctgc 3480
gaggcgggcc gcctgcgcgc caagtactcg gcccagatcg aagacctgca ggtgaagctg 3540
cagcacgcgg aggcggaccg ggagcagctg cgggccgacc tgctgcggga gcgcgaggcc 3600
cgggagcacc tggagaaggt ggtgaaggag ctgcaggaac agctgtggcc gcgggcccgc 3660
cccgaggctg cgggcagcga gggcgctgcg gagctggagc cgtag 3705
<210> 19
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaggtgcagc tgttccagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc caggggtgtt 300
ggccggggct ttgactactg gggccagggg accacggtca ccgtctcctc a 351
<210> 20
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc atctatttaa attggtatcg gcagcaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttactt ctgtcaacag acttacagta cccctccgtg gacgttcggc 300
caagggacca aagtggatat caaa 324
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
agtggcggtg gctctggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatca 45
