具体实施方式

一方面，本发明实施例提供了一种蛋白复合物，其包括TIGIT的胞外段、TIGIT的跨膜区、CD28的胞内段，以及4-1BB的胞内段。

具体地，TIGIT即T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(T cell immunoreceptorwith Ig and ITIM domains,TIGIT)，又名Vsig9(V-set and immunoglobulin domain-containing protein9)、Vstm3(V-set and transmembrane domain-containing protein3)，或WUCAM(Washington University cell adhesion molecule)。TIGIT基因位于人类3号染色体，编码244个氨基酸组成了I型跨膜蛋白。人TIGIT分子胞膜外区长141个氨基酸，有1个免疫球蛋白V样结构域；跨膜区有23个氨基酸；胞质区较短，有80个氨基酸，还具有1个PDZ结合结构域和1个ITIM模体。TIGIT分子较为保守，在多种哺乳动物中都发现了其同源分子，人类TIGIT分子与猴、狗和小鼠的TIGIT分子分别具有88％、67％和58％的同源性。

TIGIT广泛表达于多种免疫效应细胞上，如活化T细胞、NK细胞、记忆T细胞、滤泡Th细胞和Tregs等。T细胞表面具有很多重要的膜分子，它们对于T细胞的活化、增殖和分化以及效应功能的发挥具有重要的作用。有研究者认为TIGIT可能通过与DC细胞上表达的CD155结合，活化其胞内的ERK分子信号通路，上调IL-10分子的表达来抑制T细胞的活化。同样有研究者通过构建动物模型(敲除TIGIT基因的小鼠)，在无抗原提呈细胞存在的培养体系中，使用具有功能活性的TIGIT单克隆抗体刺激T细胞，出现免疫下调的现象，表明TIGIT分子是一种免疫抑制分子，可以直接抑制T细胞的免疫功能。

CD28是诱导T细胞活化的重要协同刺激分子，4-1BB则是T细胞协同刺激分子，可以与CD28共同参与T细胞的活化及增殖。

TIGIT的配体，是指与TIGIT具有亲和力的分子。TIGIT具有多个配体，如CD112、CD113以及CD155。其中，CD155与TIGIT的亲和力最高。肿瘤表面高表达的CD155一旦与免疫效应细胞表面的TIGIT结合，这些免疫效应细胞对肿瘤细胞的杀伤作用就会被抑制。

基于此，本发明实施例提供的蛋白复合物包括具有免疫抑制功能的TIGIT胞外段和TIGIT跨膜区，使TIGIT表达于细胞膜外，从而可以与TIGIT配体结合；同时，该蛋白复合物还包括作为共刺激信号分子的CD28胞内段和4-1BB胞内段，当细胞膜外的TIGIT与其配体结合时，信号传递到胞内，胞内的CD28和4-1BB激活免疫效应细胞的第二信号，从而阻断了抑制性信号的传递，解除TIGIT原本的免疫抑制效应。此外，CD28和4-1BB的激活还将TIGIT与其配体结合所产生的抑制性信号转换为激活性信号，进而增强免疫效应细胞的免疫功能。更重要的是，本发明实施例提供的蛋白复合物通过解除免疫抑制并增强免疫效应细胞的免疫功能，可进一步提升免疫效应细胞的增殖能力，促进免疫效应细胞的大量扩增。与现有的免疫抑制-共刺激信号转换分子相比，本发明实施例提供的蛋白复合物通过采用TIGIT跨膜区以及CD28和4-1BB的胞内段，更加有利于增强免疫效应细胞的免疫功能，并促进免疫效应细胞的扩增，因此在预防或治疗肿瘤方面具有更好的效果。

在一些实施方案中，蛋白复合物还包括TIGIT的胞内段。作为优选，该TIGIT的胞内段的N端与TIGIT的跨膜区的C端连接。进一步优选地，TIGIT的胞内段的氨基酸序列如SEQID NO:1所示，编码该TIGIT的胞内段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。T细胞以及CD28和4-1BB的活化方式依赖于免疫突触的形成，这意味着本发明实施例提供的蛋白复合物的胞内段需要向免疫突触集中。因此，本发明实施例通过增加TIGIT的部分胞内段，一方面可以使胞内的CD28和4-1BB更为舒展；另一方面，当TIGIT的胞内段的N端与TIGIT的跨膜区的C端连接时，将更有利于TIGIT的跨膜区的移动，促进免疫突触的形成和质量，以进一步促进其对免疫功能的增强作用。

TIGIT的胞内段的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)：

LTR

编码TIGIT的胞内段的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:2)：

TTGACTAGA

本发明实施例提供的蛋白复合物中，对于CD28的胞内段和4-1BB的胞内段的位置关系没有特别限制，两者的位置可以互换。在一些实施方案中，CD28的胞内段位于4-1BB的胞内段的N端，且可以理解的是，此时CD28的胞内段既可以与4-1BB的胞内段直接连接，也可以在两者之间设置一段连接肽(link)来连接。优选CD28的胞内段与4-1BB的胞内段通过连接肽连接，从而使蛋白结构折叠时更为舒展，有利于充分发挥各蛋白部分的作用。此外，连接肽连接后，所得蛋白复合物可使T细胞活化水平受到控制以避免过于强烈，更容易成为记忆T细胞，进而提升中央记忆性T细胞的比例。

在另一些实施方案中，4-1BB的胞内段位于CD28的胞内段的N端。同样地，此时4-1BB的胞内段可以与CD28的胞内段直接连接，也可以在两者之间设置一段连接肽来连接。优选4-1BB的胞内段与CD28的胞内段段通过连接肽连接，其原因同上，此处不再赘述。

更优选地，蛋白复合物中的胞外段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码该胞外段的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码该跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，CD28的胞内段的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，编码该CD28的胞内段的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，4-1BB的胞内段的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，编码该4-1BB的胞内段的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，编码该连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

TIGIT胞外段的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:3)：

MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIP

编码TIGIT胞外段的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:4)：

ATGATGACAGGCACAATAGAAACAACGGGGAACATTTCTGCAGAGAAAGGTGGCTCTATCATCTTACAATGTCACCTCTCCTCCACCACGGCACAAGTGACCCAGGTCAACTGGGAGCAGCAGGACCAGCTTCTGGCCATTTGTAATGCTGACTTGGGGTGGCACATCTCCCCATCCTTCAAGGATCGAGTGGCCCCAGGTCCCGGCCTGGGCCTCACCCTCCAGTCGCTGACCGTGAACGATACAGGGGAGTACTTCTGCATCTATCACACCTACCCTGATGGGACGTACACTGGGAGAATCTTCCTGGAGGTCCTAGAAAGCTCAGTGGCTGAGCACGGTGCCAGGTTCCAGATTCCA

TIGIT跨膜区的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:5)：

LLGAMAATLVVICTAVIVVVA

编码TIGIT跨膜区的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:6)：

TTGCTTGGAGCCATGGCCGCGACGCTGGTGGTCATCTGCACAGCAGTCATCGTGGTGGTCGCG

CD28胞内段的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:7)：

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

编码CD28胞内段的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:8)：

AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC

4-1BB胞内段的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:9)：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

编码4-1BB胞内段的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:10)：

AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG

连接肽的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:11)：

GGGGGGGGG

编码连接肽的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:12)：

GGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGT

在一些实施方案中，蛋白复合物还包括信号肽，该信号肽的C末端与TIGIT的胞外段的N末端连接。信号肽可以提高本发明实施例提供的蛋白复合物的分泌效果，并在表达后被切除。信号肽的选择对蛋白复合物的活性具有重要影响，如信号肽选择不当，可能会导致蛋白复合物失活。因此，作为优选，该信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，编码该信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。

信号肽的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:13)：

MRWCLLLIWAQGLRQAPLASG

编码信号肽的核苷酸序列如下(SEQ ID NO:14)

ATGCGCTGGTGTCTCCTCCTGATCTGGGCCCAGGGGCTGAGGCAGGCTCCCCTCGCCTCAGGA

在一些实施方案中，蛋白质复合物从N端至C端依次为：信号肽、TIGIT的胞外段、TIGIT的跨膜区、TIGIT的胞内段、CD28的胞内段和4-1BB的胞内段，此时，蛋白质复合物的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。

蛋白质复合物的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:15)：

MRWCLLLIWAQGLRQAPLASGMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPLLGAMAATLVVICTAVIVVVALTRRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL*

在一些实施方案中，蛋白质复合物从N端至C端依次为：信号肽、TIGIT的胞外段、TIGIT的跨膜区、TIGIT的胞内段、CD28的胞内段、连接肽和4-1BB的胞内段，此时，蛋白质复合物的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

蛋白质复合物的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:16)：

MRWCLLLIWAQGLRQAPLASGMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPLLGAMAATLVVICTAVIVVVALTRGGGGGGGGGRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL*

另一方面，本发明实施例还提供了一种免疫抑制-共刺激信号转换分子(又称“Switch”)，其包括本发明实施例提供的蛋白复合物。相应地，不包含上述连接肽的蛋白复合物可称之为(SWITCH)，包含上述连接肽的蛋白复合物可称之为(SWITCH-link)。

本发明实施例提供的蛋白复合物可作为免疫抑制-共刺激信号转换分子或免疫抑制-共刺激信号转换分子的组分之一，单独或与其它免疫抑制-共刺激信号转换分子共同用于解除免疫抑制的同时增强免疫效应细胞的免疫功能。

在一些实施方案中，其它免疫抑制-共刺激信号转换分子为：以表达在胞外和跨膜区的、起免疫抑制作用的TIGIT，与作为共刺激信号蛋白的CD28的胞内区或4-1BB的胞内区形成的蛋白复合物；或者以表达在胞外和跨膜区的、起免疫抑制作用的TIGIT，与不同于CD28的胞内区和4-1BB的胞内区的共刺激信号蛋白形成的蛋白复合物；或者以不同于TIGIT且起免疫抑制作用的免疫抑制蛋白与任意一种共刺激信号蛋白形成的蛋白复合物。其中，不同于TIGIT且其免疫抑制作用的免疫抑制蛋白包括但不限于PD1、CTLA4、BTLA、TIM3或TGFβ受体；不同于CD28的胞内区和4-1BB的胞内区的共刺激信号蛋白包括但不限于CD134、LCK、ICOS或DAP10的胞内结构域肽段。

另一方面，本发明实施例提供了一种多核苷酸，该多核苷酸用于编码本发明实施例提供的蛋白复合物。

在一些实施方案中，该多核苷酸为第一多核苷酸，其序列如SEQ ID NO:17所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。

编码蛋白复合物的第一多核苷酸的序列如下(SEQ ID NO:17)：

ATGCGCTGGTGTCTCCTCCTGATCTGGGCCCAGGGGCTGAGGCAGGCTCCCCTCGCCTCAGGAATGATGACAGGCACAATAGAAACAACGGGGAACATTTCTGCAGAGAAAGGTGGCTCTATCATCTTACAATGTCACCTCTCCTCCACCACGGCACAAGTGACCCAGGTCAACTGGGAGCAGCAGGACCAGCTTCTGGCCATTTGTAATGCTGACTTGGGGTGGCACATCTCCCCATCCTTCAAGGATCGAGTGGCCCCAGGTCCCGGCCTGGGCCTCACCCTCCAGTCGCTGACCGTGAACGATACAGGGGAGTACTTCTGCATCTATCACACCTACCCTGATGGGACGTACACTGGGAGAATCTTCCTGGAGGTCCTAGAAAGCTCAGTGGCTGAGCACGGTGCCAGGTTCCAGATTCCATTGCTTGGAGCCATGGCCGCGACGCTGGTGGTCATCTGCACAGCAGTCATCGTGGTGGTCGCGTTGACTAGAAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGTAA

在一些实施方案中，该多核苷酸为第二多核苷酸，其序列如SEQ ID NO:18所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

编码蛋白复合物的第二多核苷酸的序列如下(SEQ ID NO:18)：

ATGCGCTGGTGTCTCCTCCTGATCTGGGCCCAGGGGCTGAGGCAGGCTCCCCTCGCCTCAGGAATGATGACAGGCACAATAGAAACAACGGGGAACATTTCTGCAGAGAAAGGTGGCTCTATCATCTTACAATGTCACCTCTCCTCCACCACGGCACAAGTGACCCAGGTCAACTGGGAGCAGCAGGACCAGCTTCTGGCCATTTGTAATGCTGACTTGGGGTGGCACATCTCCCCATCCTTCAAGGATCGAGTGGCCCCAGGTCCCGGCCTGGGCCTCACCCTCCAGTCGCTGACCGTGAACGATACAGGGGAGTACTTCTGCATCTATCACACCTACCCTGATGGGACGTACACTGGGAGAATCTTCCTGGAGGTCCTAGAAAGCTCAGTGGCTGAGCACGGTGCCAGGTTCCAGATTCCATTGCTTGGAGCCATGGCCGCGACGCTGGTGGTCATCTGCACAGCAGTCATCGTGGTGGTCGCGTTGACTAGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGTAA

另一方面，本发明实施例还提供了一种表达载体，其包括本发明实施例提供的多核苷酸。表达载体是指包括重组核苷酸的载体，该重组核苷酸包括与待表达的核苷酸序列有效连接的表达控制序列。表达载体包括足以用于表达的顺式作用元件，用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。在本发明实施例中，表达载体包括本领域已知的所有载体，包括但不限于黏粒、质粒、病毒。其中，病毒包括但不限于慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等。

在一些实施方案中，表达载体为慢病毒载体。慢病毒为逆转录病毒科的一个属，慢病毒在逆转录病毒中是独特的，其能够感染非分裂细胞，可以将大量遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体中最有效的方法之一，如HIV、SIV、FIV等均属于慢病毒。本发明实施例采用慢病毒作为表达载体时，其转染效率优于转座子系统，且外源基因插入基因组是稳定转化系统，免疫原性比腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体更低，具有更小的副作用和不良反应以及更高的有效性和安全性。

另一方面，本发明实施例还提供了一种细胞，其包括本发明实施例提供的载体。本发明实施例提供的细胞作为表达系统，用于表达本发明实施例提供的蛋白复合物。

在一些实施方案中，该细胞为T细胞、NK细胞、记忆T细胞、滤泡辅助性T细胞和/或调节性T细胞，优选为肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)。肿瘤微环境是指肿瘤局部浸润的免疫细胞、间质细胞及所分泌的活性介质等与肿瘤细胞所构成的局部内环境。在肿瘤微环境中，TIGIT作为一种抑制性受体在多种肿瘤的TILs上高表达。在小鼠肿瘤中，CD8⁺TIGIT⁺的TILs共表达PD-1、Tim-3和LAG3，并且在表达TIGIT的CD8⁺的TIL中表现出的功能障碍最为突出。重要的是，TIGIT在荷瘤小鼠外周淋巴器官中的表达相对较低，但在肿瘤组织中却高度富集，表明TIGIT在调节肿瘤组织中的免疫反应方面具有特殊作用。因此，当TIL表达本发明实施例提供的蛋白复合物时，该蛋白复合物可使原本在肿瘤微环境中受到免疫抑制的TIL解除免疫抑制，并增强TIL的免疫功能。同时，由于此时蛋白复合物所表达的TIL是能特异性识别肿瘤的T细胞，且不识别肿瘤的T细胞不表达本发明实施例提供的蛋白复合物，因此可保证对T细胞的免疫功能的解除抑制以及增强免疫是特异性的、选择性的，不识别肿瘤的T细胞不会因为被解除免疫抑制而杀伤正常细胞。与抑制免疫检查点的单抗药物相比，可显著降低自身免疫病的风险。

另一方面，本发明实施例还提供了一种免疫效应细胞，其表达本发明实施例提供的蛋白复合物。免疫效应细胞是指在免疫应答中参与清除异物抗原和行使效应功能的免疫细胞。

在一些实施方案中，该免疫效应细胞为T细胞、NK细胞、记忆T细胞、滤泡辅助性T细胞和/或调节性T细胞，优选为TIL。优选TIL的原因如上文所述，此处不再赘述。

另一方面，本发明实施例还提供了一种药物组合物，其包括本发明实施例提供的蛋白复合物、多核苷酸、表达载体、细胞、免疫效应细胞中的至少一种。

在一些实施方案中，除了包括本发明实施例提供的蛋白复合物、多核苷酸、表达载体、细胞、免疫效应细胞中的至少一种作为有效成分之外，该药物组合物还包括药学上可接受的辅料。

最后一方面，本发明实施例还提供了药物组合物在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明实施例提供的药物组合物适用于制备预防或治疗任何肿瘤的药物。在一些实施方案中，该药物组合物用于制备预防或治疗CD155高表达的肺癌、宫颈癌、黑色素瘤、胃癌和/或乳腺癌等的药物。之所以能用于肺癌、宫颈癌、黑色素瘤、胃癌和/或乳腺癌的治疗，是因为这些肿瘤类型是免疫浸润比较高的肿瘤类型(热肿瘤)，尤其当其有CD155高表达后，采用本方案的获得的TIGIT-Switch或TIGIT-Switch-link均能获得很好的效果。

为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例蛋白复合物及其应用的进步性能显著的体现，以下通过多个实施例来举例说明上述技术方案。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1.1SWITCH慢病毒包装和收获

第一天：

1)转染前将培养的293FT(采购自ATCC)换用9mL无抗生素DMEM+10％FBS；

2)设置2组EP管；

3)三个EP管A:OPTi-MEM 1.5ml+主质粒20ug+pMDLg.PRRE 10ug+PRSV-Rev 5ug+PMD2.G 5ug。质粒共40ug比例(4:2:1:1)；以及对应的三个EP管B:OPti-MEM 1.5ml+lipo3000 41μL。本步骤的质粒均采购自Addgene，且第一个EP管A的主质粒为空载质粒，第二个EP管A的主质粒为多克隆位点插入TIGIT-switch DNA片段的主质粒，第三个EP管A的主质粒为多克隆位点插入TIGIT-switch-link DNA片段的主质粒。

4)三个EP管B分别混匀后室温静止5min；

5)将三个EP管B分别缓慢滴入对应的三个EP管A中，移液枪吹匀混合，避免产生气泡，然后室温静置20min；

6)每个EP管A和B的3mL混合液，分别缓慢滴加入10cm培养皿中的293FT细胞中，终体积12ml，摇8字混匀；

7)12-16h后分别用12mL DMEM+10％FBS的含抗生素新鲜复温的培养基换液。沿培养皿壁缓慢加入。放入培养箱中继续培养。此时开始计算时间。

第三天：

1)48h后分别进行第一次收集，小心收集上清12ml，并换上12mL DMEM+10％FBS的含抗生素新鲜复温的培养基换液。沿培养皿壁缓慢加入。放入培养箱中继续培养；

2)收集的上清1500g离心30min，取上清，用0.45μm滤器过滤后4℃待用。

第四天：

1)72h后分别进行第二次收集，小心收集上清12ml，并换上12mL DMEM+10％FBS的含抗生素新鲜复温的培养基换液。沿培养皿壁缓慢加入。放入培养箱中继续培养；

2)收集的上清1500g离心30min，取上清，用0.45um滤器过滤后4℃待用。

3)合并第一、二次收集的上清，Amicon Ultra-15 100k超滤管超滤浓缩，5000g1h。收集慢病毒浓缩液(根据第一天步骤3)中的三个EP管A，本步骤所获得的慢病毒浓缩液相应分为三种，分别为空载慢病毒浓缩液，TIGIT-SWITCH慢病毒浓缩液，以及TIGIT-SWITCH-link慢病毒浓缩液)。小量分装后-80℃保存。

1.2TIL细胞慢病毒感染

1)将三种慢病毒浓缩液从-80℃冰箱拿出，放在冰上使其缓慢融化；

2)将肺癌、黑色素瘤、宫颈癌病人的肿瘤组织块酶解分离，并采用IL-2进行初培扩增放大，初培后获得的TIL细胞离心计数，用AIM-V+10％AB血清+双抗的完全培养基重悬并调整细胞密度为1×10⁶/mL，于24孔板每孔铺1mL细胞悬液；

3)三种慢病毒分别以MOI＝10的比例感染TIL细胞，即每个细胞对应10个慢病毒，则每孔慢病毒需要1×10⁷IU。根据病毒滴度计算出每种病毒所需要的体积，分别加到TIL细胞中，留出一孔不加病毒的TIL细胞作为对照，然后每孔加入1μL polybrene(10mg/mL)储存液(polybrene终浓度为10μg/mL)，吹打混匀；

4)用封口膜将24孔板封口，置于水平离心机中，32℃1800rpm离心1h，以促进感染效率。离心后撕掉封口膜，在37℃细胞培养箱培养；

5)24h后进行换液，收集细胞离心，病毒上清可回收再次使用，使用1mL的AIM-V+10％AB血清+P/S完全培养基重悬细胞，放置24孔板中继续培养；

6)感染48h后取少量细胞，流式检测感染效率，其余细胞可用于后继实验。

1.3转病毒后的TIL细胞的扩增及培养

1)TIL细胞完成慢病毒转导后，分别于第3、5天更换含有IL-2 3000U/mL的新鲜培养基，扩大培养调整细胞浓度为1×10⁶/mL，分别培养转入病毒的TIL及对照TIL细胞；

2)第6天时，更换为新鲜AIM-V+10％AB血清+双抗的完全培养基，使T细胞静息24h；

3)第7天时，流式检测过表达细胞的过表达蛋白表达水平，以及转导效率，结果如图2所示。

通过图2可以看出，所获得的TIGIT-Switch细胞分别占CD3+T细胞的36.4％，以及占CD3+CD8+ T细胞的41.92％。

实施例2 TIL标本(LA20201222-2-LC)switch TIL细胞效果验证试验

1)将初培获得的TIL细胞离心计数，用AIM-V+10％AB血清+P/S完全培养基重悬并调整细胞密度为1×10⁶/mL，于24孔板每孔铺1mL细胞悬液；添加CD3单抗100ng/mL，IL-23000U/mL；

2)待其扩增翻倍2次，处于对数生长期时，用AIM-V+10％AB血清不含P/S调整细胞密度到2×10⁶/mL，铺种1个24孔板，每孔0.5mL；

3)将依照实施例1方案获得的三种慢病毒浓缩液从-80℃冰箱拿出，放在冰上使其缓慢融化；

4)慢病毒以MOI＝20的比例感染T细胞，即每个细胞对应20个慢病毒，则每孔慢病毒需要2×10⁷个。根据病毒滴度计算出每种病毒所需要的体积，分别加到T细胞中，每孔加入0.5μL polybrene(10mg/mL)储存液，2小时后每孔补加0.5mlAIM-V+10％AB血清不含双抗的培养基，并补加0.5μL polybrene(10mg/mL)储存液，吹打混匀；在37℃细胞培养箱培养；

5)感染48h后取少量细胞，流式检测GFP表达评价感染效率，其余细胞可用于后继实验；

6)非小细胞肺癌细胞株HCC827细胞(采购自ATCC)提前24h以3×10⁵/孔或3×10⁴/孔铺种6孔板，培养基采用1640+10％FBS+1％P/S+1％Glu；

7)将病毒感染后的TIL细胞3×10⁵与铺种的HCC827细胞进行混合，3×10⁵/孔/HCC827组的即1:1效靶比，3×10⁴/孔/HCC827组的即10:1效靶比。设置未感染的TIL细胞对照组、不添加TIL细胞的空白组。培养基采用AIM-V+10％AB血清+P/S完全培养基。添加IL-23000U/ml；

8)混合后24h和48h收集上清，ELISA检测IFN-γ浓度。分组情况以及细胞密度设置如表1所示，IFN-γ浓度检测结果如图3所示。

表1

实施例3 TIL样本(LA2021011901)的TIL细胞SWITCH和SWITCH-link效果验证实验

1)将肺癌病人(LA2021011901)的肿瘤组织块酶解分离，并采用IL-2进行初培扩增放大，初培后获得的TIL细胞离心计数，用AIM-V+10％AB血清+P/S完全培养基重悬并调整细胞密度为1×10⁶/mL，于24孔板每孔铺1mL细胞悬液；添加CD3单抗100ng/mL，IL-23000U/mL；

2)待其扩增翻倍2次，处于对数生长期时，调整细胞密度到1×10⁶/mL，铺种1个24孔板，每孔1mL；

3)将依照实施例1方案获得的三种慢病毒浓缩液从-80℃冰箱拿出，放在冰上使其缓慢融化；

4)慢病毒以MOI＝10的比例感染TIL细胞，即每个细胞对应10个慢病毒，则每孔慢病毒需要2×10⁷个。根据病毒滴度计算出每种病毒所需要的体积，分别加到TIL细胞中，留出一孔不加病毒的TIL细胞作为对照，用AIM-V+10％AB血清+P/S完全培养基补至1mL，然后每孔加入1μL polybrene(10mg/mL)储存液，吹打混匀；在37℃细胞培养箱培养，各组病毒的感染复数如表2所示；

表2

5)感染48h后取少量细胞，流式检测GFP表达评价感染效率，其余细胞可用于后继实验；

6)非小细胞肺癌细胞株HCC827细胞(采购自ATCC)提前24h以3×10⁵/孔或3×10⁴/孔铺种6孔板，培养基采用1640+10％FBS+1％P/S+1％Glu；

7)将病毒感染后的TIL细胞3×10⁵与铺种的HCC827细胞进行混合，3×10⁵/孔/HCC827组的即1:1效靶比，3×10⁴/孔/HCC827组的即10:1效靶比。设置未感染的TIL细胞对照组、不添加TIL细胞的空白组。培养基采用AIM-V+10％AB血清+P/S完全培养基。添加IL-23000U/ml，Polybrene 10ug/ml；

8)混合后24h和48h收集上清，ELISA检测IFN-γ浓度。分组情况以及细胞密度设置如表3所示，IFN-γ浓度检测结果如图4所示；

表3

9)继续培养在混合4天后1:1补液，只添加IL-2 3000U/mL，以后根据细胞密度，调整补液，培养到第7天，全部收获计数。流式分析：GFP、CD45、CD4、CD8、CD95、CD45RO、CD62L、7-AAD表达变化情况。评价各组CD45-细胞各群比例评价杀伤效果，分析记忆表型，结果如图5和图6所示。

通过图5所示结果表明，SWITCH-TIL比较空载组或对照TIL组都显示出更好的肿瘤杀伤效果。通过图6所示结果表明，SWITCH-TIL比较空载组显示出具有更高的Tcm比例，并且在处理肿瘤细胞后GFP⁺细胞(含有switch分子)中Tcm的比例比对照组高，且在10:1效靶比下最为明显。

实施例4代号NL样本CD8⁺T细胞SWITCH和SWITCH-link效果验证

1)代号NL供者的HLA*A分型结果为A*11:01/A*33:03，HCC827为HLA*A位点A*11:01/A*11:01纯合子。NL外周血分离获得的PBMC，磁珠分选CD8+细胞。同时冻存阳选和阴选细胞(1×10⁷/mL密度)；

2)将NL分选获得的CD8⁺T细胞细胞离心计数，用AIM-V+10％AB血清+P/S完全培养基重悬并调整细胞密度为1×10⁶/mL，于24孔板每孔铺1mL细胞悬液；添加CD3单抗100ng/mL，IL-2 3000U/mL；

3)待其扩增翻倍2次，处于对数生长期时，调整细胞密度到1×10⁶/mL，铺种1个24孔板，每孔1mL；

4)将实施例1所得三种慢病毒浓缩液从-80℃冰箱拿出，放在冰上使其缓慢融化；

5)慢病毒以MOI＝10的比例感染TIL细胞，即每个细胞对应10个慢病毒，则每孔慢病毒需要2×10⁷个。根据病毒滴度计算出每种病毒所需要的体积，分别加到TIL细胞中，留出一孔不加病毒的TIL细胞作为对照，用AIM-V+10％AB血清+P/S完全培养基补至1mL，然后每孔加入1μL polybrene(10mg/mL)储存液，吹打混匀；在37℃细胞培养箱培养，各组病毒的感染复数如表4所示；

表4

6)感染48h后取少量细胞，流式检测GFP表达评价感染效率，其余细胞可用于后继实验；

7)HCC827细胞提前24h以3×10⁵/孔或3×10⁴/孔铺种6孔板，培养基采用1640+10％FBS+1％P/S+1％Glu；

8)将慢病毒感染后的CD8⁺ T细胞3×10⁵与铺种的HCC827细胞进行混合，3×10⁵/孔/HCC827组的即1:1效靶比，3×10⁴/孔/HCC827组的即10:1效靶比。设置未感染的CD8⁺ T细胞对照组、不添加CD8⁺ T细胞的空白组。培养基采用AIM-V+10％AB血清+P/S完全培养基。添加IL-2 3000U/ml，Polybrene(又名：聚凝胺，采购自Sigma-Aldrich)10ug/ml。分组情况以及细胞密度设置如表5所示；

表5

9)混合后24h和48h收集上清，ELISA检测IFN-γ浓度，IFN-γ浓度检测结果如图7所示；

10)继续培养以后根据细胞密度，调整补液，培养到第5天，全部收获计数。流式分析：GFP、CD45、CD4、CD8、CD95、CD45RO、CD62L、7-AAD表达变化情况。评价各组CD45^-细胞各群比例评价杀伤效果，分析记忆表型，结果如图8和图9所示。

通过图8所示结果表明，SWITCH-CD8⁺ T比较空载组或对照CD8⁺ T组都显示出更好的肿瘤杀伤效果。通过图9所示结果表明，SWITCH-CD8⁺ T比较空载组显示出具有更高的Tcm比例，并且在处理肿瘤细胞后GFP⁺细胞(含有switch分子)，4、5中Tcm的比例比对照组6高。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 青岛华赛伯曼医学细胞生物有限公司

<120> 蛋白复合物及其应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu Thr Arg

1

<210> 2

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgactaga 9

<210> 3

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln

20 25 30

Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys

35 40 45

Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val

50 55 60

Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn

65 70 75 80

Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr

85 90 95

Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu

100 105 110

His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro

115 120

<210> 4

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgatgacag gcacaataga aacaacgggg aacatttctg cagagaaagg tggctctatc 60

atcttacaat gtcacctctc ctccaccacg gcacaagtga cccaggtcaa ctgggagcag 120

caggaccagc ttctggccat ttgtaatgct gacttggggt ggcacatctc cccatccttc 180

aaggatcgag tggccccagg tcccggcctg ggcctcaccc tccagtcgct gaccgtgaac 240

gatacagggg agtacttctg catctatcac acctaccctg atgggacgta cactgggaga 300

atcttcctgg aggtcctaga aagctcagtg gctgagcacg gtgccaggtt ccagattcca 360

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Leu Leu Gly Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val

1 5 10 15

Ile Val Val Val Ala

20

<210> 6

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttgcttggag ccatggccgc gacgctggtg gtcatctgca cagcagtcat cgtggtggtc 60

gcg 63

<210> 7

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 8

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 9

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 10

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggtggaggtg gaggtggagg tggaggt 27

<210> 13

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala

1 5 10 15

Pro Leu Ala Ser Gly

20

<210> 14

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgcgctggt gtctcctcct gatctgggcc caggggctga ggcaggctcc cctcgcctca 60

gga 63

<210> 15

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala

1 5 10 15

Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn

20 25 30

Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser

35 40 45

Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln

50 55 60

Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser

65 70 75 80

Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln

85 90 95

Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr

100 105 110

Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu

115 120 125

Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly

130 135 140

Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val

145 150 155 160

Val Ala Leu Thr Arg Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp

165 170 175

Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr

180 185 190

Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg

195 200 205

Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro

210 215 220

Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu

225 230 235 240

Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

245

<210> 16

<211> 257

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala

1 5 10 15

Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn

20 25 30

Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser

35 40 45

Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln

50 55 60

Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser

65 70 75 80

Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln

85 90 95

Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr

100 105 110

Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu

115 120 125

Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly

130 135 140

Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val

145 150 155 160

Val Ala Leu Thr Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Ser

165 170 175

Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg

180 185 190

Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg

195 200 205

Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

210 215 220

Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

225 230 235 240

Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

245 250 255

Leu

<210> 17

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgcgctggt gtctcctcct gatctgggcc caggggctga ggcaggctcc cctcgcctca 60

ggaatgatga caggcacaat agaaacaacg gggaacattt ctgcagagaa aggtggctct 120

atcatcttac aatgtcacct ctcctccacc acggcacaag tgacccaggt caactgggag 180

cagcaggacc agcttctggc catttgtaat gctgacttgg ggtggcacat ctccccatcc 240

ttcaaggatc gagtggcccc aggtcccggc ctgggcctca ccctccagtc gctgaccgtg 300

aacgatacag gggagtactt ctgcatctat cacacctacc ctgatgggac gtacactggg 360

agaatcttcc tggaggtcct agaaagctca gtggctgagc acggtgccag gttccagatt 420

ccattgcttg gagccatggc cgcgacgctg gtggtcatct gcacagcagt catcgtggtg 480

gtcgcgttga ctagaaggag taagaggagc aggctcctgc acagtgacta catgaacatg 540

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ttcgcagcct atcgctccaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 660

tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 720

gaagaagaag gaggatgtga actgtaa 747

<210> 18

<211> 774

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atgcgctggt gtctcctcct gatctgggcc caggggctga ggcaggctcc cctcgcctca 60

ggaatgatga caggcacaat agaaacaacg gggaacattt ctgcagagaa aggtggctct 120

atcatcttac aatgtcacct ctcctccacc acggcacaag tgacccaggt caactgggag 180

cagcaggacc agcttctggc catttgtaat gctgacttgg ggtggcacat ctccccatcc 240

ttcaaggatc gagtggcccc aggtcccggc ctgggcctca ccctccagtc gctgaccgtg 300

aacgatacag gggagtactt ctgcatctat cacacctacc ctgatgggac gtacactggg 360

agaatcttcc tggaggtcct agaaagctca gtggctgagc acggtgccag gttccagatt 420

ccattgcttg gagccatggc cgcgacgctg gtggtcatct gcacagcagt catcgtggtg 480

gtcgcgttga ctagaggtgg aggtggaggt ggaggtggag gtaggagtaa gaggagcagg 540

ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact ccccgccgcc ccgggcccac ccgcaagcat 600

taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc gctccaaacg gggcagaaag 660

aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 720

gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gtaa 774