细胞因子联合嵌合抗原受体的融合蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种细胞因子联合嵌合抗原受体的融合蛋白及其应用。
背景技术
恶性肿瘤已经成为全世界最主要的死亡原因之一。随着科学技术的不断发展，通过对癌症早期的诊断和治疗，已经能够较大幅度地提高癌症的治愈率，改善患者的生活质量。但大多数恶性肿瘤仍存在预后差，易复发等问题。在所有的肿瘤治疗手段中，免疫疗法受到研究者们的不断关注和期待。免疫疗法最大的特点在于利用免疫系统自身去对抗癌症，包括抗体治疗、细胞治疗和免疫调节剂治疗。其中尤为引人关注的细胞治疗是指将细胞制剂回输到患者体内，从而激活患者自身的免疫应答以达到抗肿瘤的目的。而在细胞免疫治疗中，嵌合抗原受体（Chimerica antigen recptor，CAR）修饰T细胞（CAR-modified Tcell，CAR T）疗法被证实能够有效治疗血液系统的恶性肿瘤，成为癌症治疗领域中的热点。随着2017年美国食品药品监督管理局(FDA)正式批准了诺华公司及吉利德公司的两款CART细胞产品（Kymriah和Yescarta）上市，用于急性B淋巴细胞白血病以及弥漫性大B细胞淋巴瘤的治疗，开创了CAR T疗法的新纪元。基于CAR T在血液瘤治疗中的突破，进一步将CAR T疗法拓展到了实体瘤的治疗，并在包括乳腺癌、肝癌、结直肠癌和肺癌等多种实体肿瘤中进行了探索，但是由于实体瘤与血液瘤不同，其缺乏安全且特意的靶点，而且实体瘤存在复杂的肿瘤免疫微环境，最终导致治疗效果不佳。因此，急需发现特异且安全的实体瘤治疗靶点、优化CAR的结构、改善肿瘤微环境，从而提高CAR T细胞的抗肿瘤效应。
滋养层细胞表面抗原2（Trophoblast cell-surface antigen 2，Trop2）是由TACSTD2基因编码表达的Ⅰ型跨膜糖蛋白，是TACSTD基因家族中的一员，人TASTD2基因位于1号染色体短臂的3区2带（1p32）。Trop2在人的胚胎滋养层细胞和绒毛膜癌细胞中高表达，在正常组织和癌旁组织中不表达或低表达，在上皮细胞癌组织中高表达。相关研究表明，Trop2与肿瘤的转移与侵袭程度正相关，影响肿瘤患者的预后。靶向Trop2的单抗偶联药物（Antibody-drug conjugate，ADC）在临床治疗中具有出色的安全性和有效性，在难治性复发的三阴乳腺癌的治疗上取得令人鼓舞的结果，Trop2作为肿瘤靶向的治疗靶点受到越来越多的关注。
发明内容
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及融合蛋白，其包括依次串联的嵌合抗原受体、2A肽、IL-7、2A肽、CCL3；
所述嵌合抗原受体包含scFv区，铰链区，跨膜域和胞内信号传导区；
所述scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
所述IL-7的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；
所述CCL3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
根据本发明的第二方面，还涉及一种分离的核酸，其表达得到如上所述的融合蛋白。
根据本发明的第三方面，还涉及一种载体，其含有如上所述的核酸。
根据本发明的第四方面，还涉及T细胞，其含有如上所述的核酸，或被如上所述的载体所转化。
根据本发明的第五方面，还涉及组合物，其包含在药学上可接受的载体以及如上所述的T细胞。
根据本发明的第六方面，还涉及如上所述的T细胞或如上所述的组合物在制备用于预防和/或治疗实体瘤的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
相对于常规CAR T细胞技术，本发明在CAR载体构建时加入了两个细胞因子IL-7和CCL-3，两个细胞因子可以增强CAR T细胞的抗凋亡作用和降低其免疫抑制效应，进而帮助CAR T细胞增强抗肿瘤效应。通过对比实验，运用本发明制备的CAR T细胞在多种肿瘤中都有比较好的抗肿瘤作用，其治疗效果优于现在临床应用的正常治疗方案和已经发表的另外一个类似的应用细胞因子治疗方案，因此本发明具有较好的临床应用潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中CAR的结构示意图；显示了靶向Trop2的小鼠二代CAR（T2-m28z）和细胞因子融合表达mCAR（T2-m28z IL-7 CCL3）的逆转录载体构建示意图；
图2为本发明一个实施例中小鼠CAR T细胞的制备；使用逆转录病毒感染小鼠CD3+T细胞，用流式细胞检测小鼠T细胞的转导效率（A）阴性对照无处理细胞；（B）正常对照mCART细胞；（C）本案设计mCAR T细胞；
图3为本发明一个实施例中T2-mCAR T对肿瘤细胞的体外裂解作用；通过测定LDH释放来评估T2-mCAR T细胞对Trop2阳性小鼠肿瘤细胞的细胞毒作用；（A） MC38-Trop2+；（B） 4T1-Trop2+；实验数据的结果以mean ± SEM 表示，通过单因素方差分析计算p值，ns：p > 0.05；
图4为本发明一个实施例中T2-mCAR T细胞胞内IFN-γ的表达水平；采用流式细胞术的方法检测与MC38-Trop2+细胞共培养后，CAR 阳性的CD8阳性细胞和CD4阳性细胞中IFN-γ表达阳性的细胞比例；实验数据的结果以mean ± SEM 表示，通过单因素方分析计算 p 值，*p< 0.05，***p< 0.001；
图5为本发明一个实施例中T2-mCAR T细胞的凋亡蛋白FAS水平表达变化；CAR T细胞与MC38-Trop2+共培养48小时后，通过流式细胞术测定FAS在不同T细胞上的表达情况；A正常对照，B 本案设计，C 统计三次实验数据后分析结果做图；实验数据的结果以mean ±SEM 表示，通过单因素方差分析计算p值，**** p< 0.0001；
图6为本发明一个实施例中T2-mCAR T细胞的免疫抑制因子PD1水平表达变化；采用流式细胞术的方法检测PD-1在体外与MC38-Trop2+共培养12小时后mCAR T细胞的PD-1的表达；A 正常对照，B 本案设计，C统计三次实验数据后分析结果做图；实验数据的结果以mean ± SEM 表示，通过单因素方差分析计算p值，** p< 0.01；
图7为本发明一个实施例中C57B6小鼠体内抗肿瘤实验过程流程示意图；
图8为本发明一个实施例中CAR T细胞对小鼠结肠癌的体内抗肿瘤作用；C57BL/6小鼠背部皮下接种MC38-Trop2+小鼠肿瘤细胞，接种后第11天后腹腔注射80毫克/公斤的环磷酰胺（CY），接种后第14天后经尾静脉回输不同T细胞，图为小鼠生存曲线；实验数据的结果以mean ± SEM 表示，小鼠数量在不同组均有标注，*p< 0.05，***p< 0.001，**** p<0.0001；
图9为本发明一个实施例中更换共刺激信号后的CAR T细胞对小鼠结肠癌的体内抗肿瘤作用；C57BL/6小鼠背部皮下接种MC38-Trop2+小鼠肿瘤细胞，接种后第11天后腹腔注射80毫克/公斤的环磷酰胺（CY），接种后第14天后经尾静脉回输不同T细胞，并定期测量肿瘤的大小和小鼠生存情况；实验数据的结果以mean ± SEM 表示，小鼠数量在不同组均有标注，*p< 0.05；
图10为本发明一个实施例中不同细胞因子组合对CAR T细胞对小鼠结肠癌的体内抗肿瘤作用；C57BL/6小鼠背部皮下接种MC38-Trop2+小鼠肿瘤细胞，接种后第11天后腹腔注射80毫克/公斤的环磷酰胺（CY），接种后第14天后经尾静脉回输不同T细胞，并定期测量肿瘤的大小和小鼠生存情况；实验数据的结果以mean ± SEM 表示，统计学标注，*p<0.05，**p< 0.01；
图11为本发明一个实施例中利用不同的肿瘤模型验证本案设计的体内抗肿瘤活性；BALB/C小鼠背部皮下接种CT26-Trop2+小鼠肿瘤细胞，接种后第7天后腹腔注射80毫克/公斤的环磷酰胺（CY），接种后第11天后经尾静脉回输不同T细胞，并定期测量肿瘤的大小和小鼠生存情况；实验数据的结果以mean ± SEM 表示，小鼠数量n=5，统计学标注p值： ns p> 0.05, **p< 0.01；
图12为本发明一个实施例中验证不同肿瘤模型中本案设计的体内抗肿瘤治疗方案；C57BL/6小鼠背部皮下接种2×106个LLC-Trop2+小鼠肿瘤细胞，接种后第7天后腹腔注射80毫克/公斤的环磷酰胺（CY），接种后第11天后经尾静脉回输不同T细胞，并定期测量肿瘤的大小和小鼠生存情况；实验数据的结果以mean ± SEM 表示，小鼠数量n=6，统计学标注p值：**p< 0.01；
图13为本发明一个实施例中在人源肿瘤模型中验证本案设计的体内抗肿瘤治疗效果；NCG小鼠背部皮下接种5×105个colo-205人结直肠癌细胞，接种后第7天后经尾静脉回输不同T细胞，并定期测量肿瘤的大小和小鼠生存情况；在第24天处死动物取材比较肿瘤大小；阴性对照为没有转导的人T细胞，正常对照是T2-28z的CAR T细胞，本案设计是转导7P3的CAR T细胞；实验数据的结果以mean ± SEM 表示，小鼠数量n=6，统计学标注p值：*p<0.05， **p< 0.01。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明涉及融合蛋白，包括依次串联的嵌合抗原受体、2A肽、IL-7、2A肽、CCL3；
所述嵌合抗原受体包含scFv区，铰链区，跨膜域和胞内信号传导区；
所述scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
所述IL-7的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；
所述CCL3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
本发明将两个细胞因子IL-7和CCL3通过连接肽2A和CAR受体串联在同一个CAR受体载体上，利用这种载体制备的CAR T细胞除了能正常识别对应的肿瘤抗原激活抗肿瘤效应外，还可以表达上述两个细胞因子，激活和增强CAR T细胞和其他效应免疫细胞，增强其治疗效果。从发明人验证结果看这种设计和正常对照CAR T细胞治疗相比有更强的抗肿瘤效果。
其中，本发明的各段多肽（例如信号肽、嵌合抗原受体的各部分）可以独立地选自相同或者不同的种属来源，例如鼠（小鼠、大鼠）、兔、绵羊、山羊、马、鸡、牛、犬以及人。
在一些实施方式中，所述2A肽为P2A肽。
在一些实施方式中，所述P2A肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
在一些实施方式中，所述铰链区选自CD8α的hinge区。
在一些实施方式中，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示。
在一些实施方式中，所述跨膜域选自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160( BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、和NKG2C中的一种。
在一些实施方式中，所述跨膜域的为CD28跨膜区，进一步优选其氨基酸序列如SEQID NO: 7所示。
在一些实施方式中，所述跨膜域的为CD27跨膜区，进一步优选其氨基酸序列如SEQID NO: 8所示。
在一些实施方式中，所述胞内信号传导区选自CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83 的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、 HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、 ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226 )、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、 Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100( SEMA4D )、CD69、SLAMF6( NTB-A、Ly108 )、SLAM( SLAMF1、CD150、IPO-3 )、BLAME( SLAMF8)、SELPLG( CD162 )、 LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、PKCθ、FcεRIγ、ZAP70和CD3胞内域中的至少一种。
在一些实施方式中，所述胞内信号传导区选自CD28和CD3胞内结构域；
在一些实施方式中，所述胞内信号传导区选自CD27和CD3胞内结构域；
优选CD28胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示。
优选CD27胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
优选CD3胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
在一些实施方式中，所述融合蛋白的N端还具有信号肽。
在一些实施方式中，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。
在一些实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO:13所示。
本发明还涉及分离的核酸，其表达得到如上所述的融合蛋白。
核酸可为DNA或RNA。
本发明还涉及含有如上所述核酸的载体。
在本公开的一些具体的实施方式中，所述载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒、腺病毒相关病毒或CRISPR/CAS质粒。
本发明还涉及T细胞，其含有如上所述的核酸或被如上所述的载体所转化。
在本公开的一些具体的实施方式中，所述 T 细胞为辅助 T 细胞、细胞毒性 T 细胞、记忆 T 细胞、调节性 T 细胞、MAIT细胞、γδT细胞中的任意一种。
在一些实施方式中，所述T细胞是CD3+T细胞；
在一些实施方式中，所述T细胞是CD3+CD4+T细胞和/或CD3+CD8+T细胞。
根据本发明的再一方面，还涉及组合物，其包含在药学上可接受的载体以及如上所述的T细胞。
本发明还涉及如上所述的T细胞或如上所述的组合物在制备用于预防和/或治疗实体瘤的药物中的应用。
在本发明中，“实体瘤”包括：骨、骨连接、肌肉、肺、气管、心脏、脾脏、动脉、静脉、毛细血管、淋巴结、淋巴管、淋巴液、口腔、咽、食管、胃、十二指肠、小肠、结肠、直肠、肛门、阑尾、肝、胆、胰腺、腮腺、舌下腺、泌尿肾、输尿管、膀胱、尿道、卵巢、输卵管、子宫、阴道、外阴部、阴囊、睾丸、输精管、阴茎、眼、耳、鼻、舌、皮肤、脑、脑干、延髓、脊髓、脑脊液、神经、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体、松果体、胰岛、胸腺、性腺、舌下腺以及腮腺中任一处病变生成的肿瘤。特别地，优选预期的肿瘤可被靶向，例如胆管癌、乳腺癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓源性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈部癌、霍奇金氏淋巴瘤、肺癌、甲状腺髓样癌、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌和尿路膀胱癌。
在一些实施方式中，实体瘤包括结直肠癌、肺癌。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例
1构建共表达IL-7和CCL3的T2-mCAR分子
基于逆转录病毒载体骨架构建的小鼠CAR基因能够被高效的转导到小鼠的T细胞内，我们在原有的小鼠二代CAR分子T2-m28z的基础上，构建共表达小鼠蛋白IL-7和CCL3的mCAR融合蛋白。小鼠的IL-7和CCL3蛋白利用可剪切的融合蛋白接头衔接序列（2A peptide，P2A）连接在无终止密码子的CAR基因的3’端，由于P2A能够不依赖蛋白酶而发生自行切割，使得其两个结构域断裂而达到三种分子共表达的结果。至此，我们构建了T2-m28z IL7CCL3( 7P3)的鼠源CAR结构，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示，结构如图1所示。
2 制备共表达IL-7和CCL3的CAR T细胞
本发明根据现有文献实验流程制备mCAR T细胞，通过流式细胞术检测了不同mCAR的转导效率。实验结果显示（图2），T2-m28z和本案设计的CAR T的制备效率比较接近，都在65%左右，表明制备成功。
3. （7P3）与正常对照（T2-m28z) CAR-T细胞在体外肿瘤杀伤活性比较
CAR T细胞的首要功能就是识别并杀伤肿瘤细胞，通过LDH释放的检测方法，比较T2-m28z和本案设计（7P3）CAR T细胞裂解肿瘤细胞MC38-Trop2+和4T1-Trop2+的能力。实验结果显示（图3），7P3与T2-m28z的CAR T细胞与靶细胞在共培养条件下，均能够有效裂解肿瘤细胞，并且CAR T细胞对肿瘤的杀伤能力随着效应细胞比例的升高而增强，这表明7P3CAR T细胞具有肿瘤杀伤活性。但是比较7P3与T2-m28z之间的裂解肿瘤能力没有差异。
4. 本发明设计的CAR T细胞具有更高的IFN-γ表达水平
IFN-γ是重要的抗肿瘤因子，因此我们进一步通过流式细胞术的方法检测CAR T细胞与MC38- Trop2+肿瘤细胞共培养后IFN-γ的表达情况。实验结果显示（图4），相比于正常对照T2-m28z组，本案设计的7P3组的CAR T细胞表达IFN-γ阳性细胞比例高，无论是在CD8阳性和CD4阳性的CAR T细胞中都表达高。以上实验结果说明，分泌表达的IL-7和CCL3可以增强CAR T细胞IFN-γ的表达。
5. IL-7和CCL3蛋白对CAR T细胞活化诱导的FAS蛋白表达有抑制作用
CAR T细胞在识别肿瘤细胞表面的相关抗原后，会触发CAR胞内信号，从而激活CART细胞，激活的T细胞将诱导凋亡蛋白FAS的高表达，进而诱导AICD效应，抑制T细胞的持续活化能力，这种效应对于控制T细胞的过度活化导致的自免疫疾病有好处，但将抑制需要持续T细胞激活的肿瘤免疫反应，降低CAR T细胞的抗肿瘤活性。为了验证IL-7和CCL3蛋白对CART细胞活化诱导的FAS蛋白表达的影响，我们检测了与肿瘤细胞共培养48 小时后CAR T细胞的FAS表达水平。实验结果发现（图5），和正常对照T2-m28z CAR T细胞相比较，本案设计7P3与肿瘤细胞共培养后表达FAS蛋白的比例下降，说明IL-7和CCL3蛋白对FAS蛋白的表达有抑制，进而可以抑制激活的CAR T细胞凋亡，增强 CAR T相比的持续激活能力和抗肿瘤活性。
6. IL-7和CCL3蛋白能够降低CAR T细胞中PD-1阳性的细胞比例
PD-1是癌症免疫治疗中的明星分子，阻断和下调PD-1分子能够显著增强CAR T细胞的抗肿瘤功能。体外实验结果发现（图6），与肿瘤细胞共培养后的CAR T细胞中PD-1阳性的细胞比例会增多。但是对比正常对照T2-m28z CAR T细胞组，本案设计7P3 CAR T细胞中PD-1阳性的细胞比例明显下降，结果说明IL-7和CCL3蛋白能够降低CAR T细胞中PD-1阳性的细胞比例，进而增加其抗肿瘤活性。
7.体内杀瘤实验
本发明的所有CAR T细胞对小鼠结肠癌的体内抗肿瘤作用实验的过程见图7；C57BL/6小鼠背部皮下接种MC38-Trop2+小鼠肿瘤细胞，接种后第11天后腹腔注射80毫克/公斤的环磷酰胺（CY），接种后第14天后经尾静脉回输不同T细胞，并每周两次定期测量肿瘤的大小和小鼠生存情况。
评估肿瘤临床疗效的重要指标包括患者体内肿瘤大小和患者的生存率。因此，7P3CAR T细胞的抗肿瘤功能需要在小鼠体内进行进一步验证从而确定其对实体瘤的实际治疗效果。在体外实验中，7P3与T2-m28z杀伤肿瘤细胞的功能没有差异，但是CAR T细胞在体内会受到免疫微环境以及免疫系统的影响，各种免疫细胞之间也会发生相互作用，从而可能展现出不同的疗效。因此，为了更好的评估7P3 CAR T细胞的体内抗肿瘤功能，我们选择在免疫健全的同种移植瘤小鼠模型中，验证7P3 CAR T细胞在完整免疫系统和肿瘤免疫微环境的条件下，是否能够发挥更好的抗肿瘤作用。
首先，我们选择在免疫健全的C57BL/6小鼠右侧皮下荷瘤MC38-Trop2+的肿瘤细胞后，第11天后腹腔注射80毫克/公斤的环磷酰胺（CY），第十四天经尾静脉回输不同组别的1×106个mCAR T细胞，一周两次进行荷瘤小鼠的肿瘤大小测量。实验结果显示（图8），回输本案设计7P3 CAR T细胞组的小鼠肿瘤生长明显受到抑制，在荷瘤100天后还没有动物死亡的情况，同比其他各组组有明显统计学差异。同时对比不同时间点的肿瘤大小，本案设计7P3CAR T细胞组的肿瘤生长也明显慢于其他组。以上实验结果说明，在体内实验的小鼠结直肠模型中，本案设计7P3 CAR T细胞相比于正常对照T2-m28z CAR T细胞具有更强的抗肿瘤功能。
8.胞内共刺激信号由CD28更换为CD27
CD27也是一个重要的T细胞活化共刺激信号分子，现有研究表明其胞内信号段可以和CD28的对应区段互换，同样具有激活CAR T细胞的功能。构建得到的替换胞内共刺激信号为CD27的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。按照上述实验方案回输不同的CART细胞后，结果表明（图9）CCL3和IL-7蛋白表达对包含CD27胞内信号的CAR T细胞和CD28一样，都有明显的抗肿瘤活性增益作用。表明CCL3和IL-7蛋白对包含不同种共刺激信号的CART细胞有类似的作用。
9. 联合CCL3和IL-7的设计与单独细胞因子的比较
CCL3和IL-7对于T细胞的功能有不同的影响，为了观察两个因子在CAR T细胞中的协同效益，我们分别构建了只含有一个因子的CAR T细胞（3 CAR 为共表达CCL3的 CAR T细胞，7 CAR为共表达IL-7的CAR T细胞），通过回输只有单因子的CAR T细胞或者共表达双因子的本案设计CAR T细胞，并以共同回输两种单因子CAR T细胞比较不同组合的抗肿瘤效应。C57BL/6小鼠背部皮下接种MC38-Trop2+小鼠肿瘤细胞，接种后第11天后腹腔注射80毫克/公斤的环磷酰胺（CY），接种后第14天后经尾静脉回输不同T细胞，并定期测量肿瘤的大小和小鼠生存情况。实验结果表明（图10），和其他各组相比，本案设计（7P3）具有明显的抗肿瘤活性优势，表明CCL3和IL-7的联合应用优于任何一种单因子的应用，也优于两个单因子CAR T细胞的共同应用。
10.结直肠癌的CT-26肿瘤细胞系实验
为了验证本案设计在不同的结直肠癌肿瘤中同样有效，我们换用由另外一个肿瘤细胞CT-26成瘤模型测试本案设计的抗肿瘤效果，并同步比较其和已经报道的另外一个细胞因子联合应用方案（共表达细胞因子IL-7和CCL19， 7P19）的抗肿瘤活性差异。BALB/C小鼠背部皮下接种CT26-Trop2+小鼠肿瘤细胞，接种后第7天后腹腔注射80毫克/公斤的环磷酰胺（CY），接种后第11天后经尾静脉回输不同T细胞，并定期测量肿瘤的大小和小鼠生存情况。实验结果表明（图11），7P19和7P3都能能够有效抑制CT26肿瘤模型的生长。尽管本案设计（7P3）和对照的联合应用方案7P19没有统计学上的效果差异，但对比终末期的生存情况本案设计优于对照治疗方案7P19，表明本案设计仍然是最优的治疗方案。
11.肺癌细胞LLC肿瘤细胞系实验
为了验证本案设计在不同类型的肿瘤中同样有效，我们换用由另外一个肺癌肿瘤细胞LLC成瘤模型测试本案设计的抗肿瘤效果。C57BL/6小鼠背部皮下接种2×106个LLC-Trop2+小鼠肿瘤细胞，接种后第7天后腹腔注射80毫克/公斤的环磷酰胺（CY），接种后第11天后经尾静脉回输不同T细胞，并定期测量肿瘤的大小和小鼠生存情况。实验结果表明（图12），和正常对照（T2-m28z）以及未处理组相比，本案设计（7P3）具有明显的抗肿瘤活性优势。
12. 利用NCG小鼠验证本案设计对人源肿瘤细胞的抗肿瘤活性
为了验证本案设计在人源肿瘤模型中的抗肿瘤活性，利用免疫缺陷的NCG小鼠建立colo-205人结直肠癌模型，然后回输不同的CAR T细胞，观察其对肿瘤生长的影响。NCG小鼠背部皮下接种5×105个colo-205人结直肠癌细胞，接种后第7天后经尾静脉回输不同T细胞，并定期测量肿瘤的大小和小鼠生存情况。在第24天处死动物取材比较肿瘤大小。阴性对照为没有转导的人T细胞，正常对照是T2-28z的CAR T细胞，本案设计是转导7P3的CAR T细胞。实验结果表明（图13），本案设计在人源肿瘤模型中同样有更好的抗肿瘤活性，优于其他对照组的治疗效果。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中山大学
<120> 细胞因子联合嵌合抗原受体的融合蛋白及其应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 243
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 1
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln
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Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys
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Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys
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Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr
165 170 175
Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe
180 185 190
Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu
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Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Phe Gly
210 215 220
Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr
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Val Ser Ser
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Leu Val Leu Leu Pro Val Thr Ser Ser Glu Cys His Ile Lys Asp Lys
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Glu Gly Lys Ala Tyr Glu Ser Val Leu Met Ile Ser Ile Asp Glu Leu
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50 55 60
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65 70 75 80
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Gly Ala Tyr Gly
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Ile Leu Phe Phe His
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Ile Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
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Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val
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50 55 60
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530 535 540
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740 745 750
Ile Val Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Gly Val
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770 775 780
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785 790 795
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