一种靶向B7H3共表达IL-21的全人源嵌合抗原受体、iNKT细胞及其用途
技术领域
本发明属于免疫学与分子生物学
技术领域
，具体地，涉及一种靶向B7H3共表达IL-21的全人源嵌合抗原受体，其包含B7H3抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞内信号结构域以及IL-21，更具体地，涉及一种靶向B7H3共表达IL-21的全人源嵌合抗原受体、iNKT细胞及其用途。背景技术
肿瘤细胞免疫治疗(Tumor cell immunotherapy)是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术，是一种运用生物技术和生物制剂分离体外激活并回输患者自身或同种异体的肿瘤特异性或非特异性杀伤细胞的新型治疗方法。肿瘤的传统疗法包括手术、化疗和放疗都具有局限性：手术常因癌细胞浸润到邻近或转移到远端组织而不能根除；化疗、放疗则受限于对体内其他正常组织的毒性及伤害。近年来流行的靶向疗法可在细胞分子水平上针对已经明确的致癌位点来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点相结合并发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，但是分子靶向药物只能对特定基因突变型肿瘤产生作用，若靶点肿瘤基因突变就会产生药物耐受性，导致疗效下降，甚至发生严重的不良反应等问题。肿瘤细胞免疫治疗不同于传统的疗法，正常人体的免疫系统能够识别和清除肿瘤细胞，但癌症病人特别是晚期癌症病人往往伴有免疫系统受损，从而失去了清除肿瘤细胞的能力，在这种情况下，可以通过激发和增强机体的免疫功能，达到控制和杀伤肿瘤细胞的目的，这种治疗方法就是肿瘤细胞免疫治疗。
在肿瘤细胞免疫治疗中，嵌合抗原受体修饰T细胞(Chimeric antigen receptormodification T cells，CAR-T)和嵌合抗原受体修饰NK细胞(Chimeric antigen receptormodification NK cells，CAR-NK)免疫疗法是目前研究进展最迅速两种疗法，其原理在于经嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)修饰的T细胞或NK细胞，可以特异性地识别肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原，使效应T细胞或NK细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境并打破宿主免疫耐受状态。同为免疫细胞的自然杀伤T细胞(Natural killer T cell，NKT)不同于传统的T细胞或NK细胞，而是一种具有先天性免疫应答功能的特殊T细胞，兼具NK细胞功能和T细胞特点，其分为I型NKT细胞、II型NKT细胞和III型NKT细胞，其中，I型NKT细胞又称恒定自然杀伤T细胞(Invariant nature killer T cell，iNKT)，是目前研究最为广泛也是最深入的一类NKT细胞，大量的研究表明，iNKT细胞有较好的抗肿瘤效果，在肿瘤免疫治疗中具有巨大的潜在应用价值。
B7H3(CD276)属于B7超家族，是一种跨膜糖蛋白，其胞外区结构分为2种，一种是单价的2Ig-B7-H3，一种是由2个重复单元结构组成的双价的4Ig-B7-H3。相关研究表明B7H3通过与一种结构未知的受体作用，能够抑制T细胞增殖及细胞因子释放(Suh W K,Gajewska BU,Okada H,et al.The B7 family member B7-H3 preferentially down-regulates Thelper type 1–mediated immune responses[J].Nature immunology,2003,4(9):899-906.)，虽然B7H3的受体未知，但是近年来关于B7H3与受体作用在肿瘤免疫中的负调控的报道越来越多，肿瘤细胞表达B7H3，使其规避CD8+T细胞的免疫监视，相关研究表明了B7H3基因敲除的小鼠或使用抗B7H3的抗体均能显著抑制肿瘤的生长，这种抑制作用依赖于CD8+T和NK细胞的功能(Lee Y,Martin-Orozco N,Zheng P,et al.Inhibition of the B7-H3immune checkpoint limits tumor growth by enhancing cytotoxic lymphocytefunction[J].Cell research,2017,27(8):1034-1045.)，以上研究均表明了B7H3可作为肿瘤免疫治疗的有效治疗靶标。
鉴于此，本发明基于B7H3在肿瘤细胞中的高表达特性及其对免疫细胞的抑制活性特点，提供了一种靶向B7H3的全人源嵌合抗原受体及其iNKT细胞，在肿瘤细胞免疫治疗领域具有重要的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于一种靶向B7H3共表达IL-21的全人源嵌合抗原受体、iNKT细胞及其用途。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种靶向B7H3的全人源嵌合抗原受体。
进一步，所述嵌合抗原受体包括与B7H3特异性结合抗体scFv；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括跨膜结构域、胞内信号传导结构域；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括铰链区；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括共刺激信号结构域；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括自裂解肽；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括免疫调节分子或细胞因子；
更优选地，所述scFv的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、与SEQID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
最优选地，所述scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
更优选地，所述跨膜结构域和铰链区包括下列分子的跨膜结构域和铰链区：CD8α，CD28，IgG1、IgG4、4-1BB，PD-1、CD34、OX40，CD3ε；
最优选地，所述跨膜结构域和铰链区为CD8α跨膜结构域和CD8α铰链区；
最优选地，所述CD8α跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
最优选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
更优选地，所述胞内信号传导结构域包括下列分子的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD79a、CD79b、CD278、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d、DAP10、DAP12、FYN；
最优选地，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域；
最优选地，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
更优选地，所述共刺激信号结构域包括下列分子的共刺激信号结构域：CD28、ICOS、CD27、CD19、CD4、CD8α、CD8β、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、CD278；
最优选地，所述共刺激信号结构域为CD28共刺激信号结构域；
最优选地，所述CD28共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
更优选地，所述信号肽包括下列分子的信号肽：T细胞受体的α链及β链、CD3ζ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD28、CD16、CD22、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、GITR、ICOS、IgG6；
最优选地，所述信号肽为IgG6信号肽；
最优选地，所述IgG6信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
更优选地，所述自裂解肽为T2A；
最优选地，所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
更优选地，所述免疫调节分子或细胞因子包括：B7.1、CCL19、CCL21、CD40L、CD137L、GITRL、GM-CSF、IL-12、IL-2、IL-18、IL-21、LEC、OX40L；
最优选地，所述免疫调节分子或细胞因子为IL-21；
最优选地，所述IL-21的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
最优选地，所述嵌合抗原受体选自以下组中的任一种：
(1)含有依次连接的IgG6信号肽、scFv、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、CD28共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、IL-21的融合蛋白；
(2)在(1)中的融合蛋白的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸后形成的衍生融合蛋白；
最优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
本发明的第二方面提供了一种多核苷酸。
所述多核苷酸的序列为含依次连接的靶向B7H3的嵌合抗原受体的编码序列、或其互补序列；
优选地，所述靶向B7H3的嵌合抗原受体的编码序列包含依次连接的IgG6信号肽的编码序列、scFv的编码序列、CD8α铰链区的编码序列、CD8α跨膜结构域的编码序列CD28共刺激信号结构域的编码序列、CD3ζ胞内信号传导结构域的编码序列、T2A的编码序列、IL-21的编码序列；
优选地，所述IgG6信号肽的编码序列如SEQ ID NO:10所示；
优选地，所述scFv的编码序列如SEQ ID NO:11所示；
优选地，所述CD8α铰链区的编码序列如SEQ ID NO:12所示；
优选地，所述CD8α跨膜结构域的编码序列如SEQ ID NO:13所示；
优选地，所述CD28共刺激信号结构域的编码序列如SEQ ID NO:14所示；
优选地，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的编码序列如SEQ ID NO:15所示；
优选地，所述T2A的编码序列如SEQ ID NO:16所示；
优选地，所述IL-21的编码序列如SEQ ID NO:17所示；
优选地，所述靶向B7H3的嵌合抗原受体的编码序列如SEQ ID NO:18所示。
本发明的第三方面提供了一种含有本发明第二方面所述多核苷酸的载体。
进一步，所述载体包括克隆载体、表达载体；
优选地，所述载体包括DNA载体、RNA载体、质粒、病毒来源的载体；
更优选地，所述病毒来源的载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体；
最优选地，所述载体为逆转录病毒载体。
本发明的第四方面提供了一种经工程改造的宿主细胞。
进一步，所述经工程改造的宿主细胞含有本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体；
优选地，所述宿主细胞包括真核细胞、原核细胞；
更优选地，所述宿主细胞为真核细胞；
最优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞；
最优选地，所述真核细胞为免疫细胞；
最优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞或其任意组合；
最优选地，所述免疫细胞为iNKT细胞。
进一步，所述宿主细胞可从受试者或可商购的培养物(例如美国典型培养物保藏中心(ATCC))中获得；
优选地，所述宿主细胞可以从受试者中的许多来源获得，所述来源包括受试者的外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾组织、肿瘤。
本发明的第五方面提供了一种衍生物。
进一步，所述衍生物包括可检测标记的本发明第一方面所述的嵌合抗原受体和/或本发明第二方面所述的多核苷酸、赋予抗生素抗性的本发明第一方面所述的嵌合抗原受体和/或本发明第二方面所述的多核苷酸、与治疗剂结合或偶联的本发明第一方面所述的嵌合抗原受体和/或本发明第二方面所述的多核苷酸；
优选地，所述可检测标记包括荧光染料、胶体金、化学发光标记物、化学发光催化剂；
更优选地，所述化学发光标记物包括鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、金刚烷、稀土元素、联吡啶钌配合物；
更优选地，所述化学发光催化剂包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶；
优选地，所述抗生素抗性的基因包括青霉素抗性基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因；
优选地，所述治疗剂包括放射性核素、细胞因子、金纳米颗粒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶、化疗剂；
更优选地，所述细胞因子包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IFN-γ、TNF-β、TNF-α、G-CSF、M-CSF；
更优选地，所述化疗剂包括顺铂、紫杉醇、长春新碱、门冬酰胺酶、奥沙利铂、草酸铂、乐沙定。
本发明的第六方面提供了一种药物组合物。
进一步，所述药物组合物包含本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的经工程改造的宿主细胞；
优选地，所述药物组合物还包括一种或多种药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。
进一步，这样的组合可以包含：缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。
本发明公开的药物组合物可根据实际需求被配制用于口服、静脉内、局部、肠内和/或肠胃外施用的药物。
本发明第七方面提供了一种试剂盒。
进一步，所述试剂盒包含本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体；
优选地，所述试剂盒还包括将所述多核苷酸、载体引入到宿主细胞中的试剂；
优选地，所述试剂盒还包括将所述多核苷酸、载体引入到宿主细胞中的说明书。
本发明的第八方面提供了一种含有本发明第四方面所述经工程改造的宿主细胞的生物制剂。
进一步，所述生物制剂可与其他治疗药物联合应用。
本发明的第九方面提供了如下任一种方法：
(1)一种刺激对哺乳动物中靶细胞群或组织的免疫应答的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：给哺乳动物施用有效量的本发明第四方面所述的经工程改造的宿主细胞；
(2)一种制备本发明第四方面所述经工程改造的宿主细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体引入到宿主细胞中；
优选地，所述引入的方法包括脂质转染法、微注射、电穿孔、DNA载体、RNA载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体；
更优选地，所述引入的方法为使用逆转录病毒载体。
本发明还提供了一种治疗患有表达B7H3的癌症的受试者的方法。
进一步，所述方法包括给有需要的受试者施用本发明第四方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第六方面所述的药物组合物、本发明第八方面所述的生物制剂。
本发明的第十方面提供了如下任一方面的应用：
(1)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第五方面所述的衍生物、本发明第六方面所述的药物组合物、本发明第七方面所述的试剂盒、本发明第八方面所述的生物制剂在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；
(2)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第五方面所述的衍生物在制备用于制备预防和/或治疗肿瘤的免疫细胞的试剂盒中的应用；
(3)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第五方面所述的衍生物、本发明第六方面所述的药物组合物、本发明第七方面所述的试剂盒在制备用于预防和/或治疗肿瘤的生物制剂中的应用；
(4)本发明第六方面所述的药物组合物在预防和/或治疗肿瘤中的应用；
(5)本发明第七方面所述的试剂盒在制备用于预防和/或治疗肿瘤的免疫细胞中的应用；
(6)本发明第八方面所述的生物制剂在预防和/或治疗肿瘤中的应用；
(7)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体在制备多核苷酸、载体、经工程改造的宿主细胞、衍生物中的应用；
(8)本发明第二方面所述的多核苷酸在制备载体、经工程改造的宿主细胞、衍生物中的应用；
(9)本发明第三方面所述的载体在制备经工程改造的宿主细胞、衍生物中的应用；
(10)本发明第四方面所述的经工程改造的宿主细胞在制备衍生物中的应用；
(11)IL-21在制备用于预防和/或治疗肿瘤的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞中的应用；
优选地，所述肿瘤为表达B7H3的肿瘤；
更优选地，所述肿瘤包括卵巢癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、食管癌、前列腺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌、肝癌、膀胱癌、骨肉瘤、神经胶质瘤、髓系白血病；
最优选地，所述肿瘤为肾癌。
本发明的优点和有益效果如下：
本发明基于B7H3在肿瘤细胞中的高表达特性及其对免疫细胞的抑制活性特点，提供了一种靶向B7H3的全人源嵌合抗原受体及其iNKT细胞，经实验验证本发明制备得到的靶向B7H3的B7H3.CAR/IL-21-iNKT细胞具有较强细胞因子释放能力和肿瘤细胞杀伤能力，能够有效清除肿瘤细胞，在肿瘤细胞免疫治疗领域具有重要的应用前景。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示利用流式细胞仪检测CAR阳性率的结果图，其中，A图：UT-iNKT，B图：B7H3.CAR-iNKT，C图：B7H3.CAR/IL-21-iNKT；
图2显示利用流式细胞仪检测CAR转导率的统计结果图；
图3显示检测B7H3.CAR/IL-21-iNKT细胞与不同的肾癌细胞共培养时细胞因子释放能力的结果图，其中，A图：IFN-γ，B图：IL-2；
图4显示流式细胞仪检测B7H3.CAR/IL-21-iNKT细胞凋亡的结果图；
图5显示RTCA实验检测B7H3.CAR/IL-21-iNKT细胞对肾癌细胞786-O杀伤效果的结果图，其中，A：E/T＝2/1，B：E/T＝1/1，C：E/T＝1/2；
图6显示RTCA实验检测B7H3.CAR/IL-21-iNKT细胞对肾癌细胞OSRC-2杀伤效果的结果图，其中，A：E/T＝5/1，B：E/T＝1/1，C：E/T＝1/5；
图7显示B7H3.CAR/IL-21-iNKT对小鼠肾癌皮下移植瘤的清除能力的结果图，其中，A图：实验流程图，B图：小鼠肿瘤体积统计图，C图：外周血中CAR-iNKT细胞数的统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1靶向B7H3共表达IL-21的全人源B7H3.CAR/IL-21-iNKT的制备
1、实验方法
(1)iNKT的制备
1)分离PBMCs：采集供者外周血，用等量生理盐水稀释全血，将淋巴细胞分离液与稀释血按1:2比例加入离心管中，2000rpm/min离心20分钟，收集白膜层细胞，生理盐水清洗两次，1500rpm/min离心8分钟，获得外周血单个核细胞PBMCs；
2)诱导iNKT细胞：用淋巴细胞培养基重悬PBMCs，调整浓度为2×106/mL，加入α-Galcer、IL-2、IL-21、IL-4和GM-CSF，将细胞接种于24孔板，置于37℃、5％CO2培养箱，每日观察细胞状态，隔天半量换液；
3)磁珠分选iNKT细胞：第10天收集诱导后细胞，用500μL MACS buffer重悬，按照说明书用量加入Anti-iNKT MicroBeads，混匀置于4℃孵育30分钟，加入5mL MACS buffer清洗，400×g离心5分钟，弃上清；用500μL MACS buffer重悬，上样LS分选柱，MACS buffer清洗3次，每次3mL；最后将分选柱置于收集管，加500μL MACS buffer洗脱获得iNKT阳性细胞；
4)活化扩增iNKT细胞：第10天用含有IL-7和IL-15的淋巴细胞培养基重悬上一步纯化所得细胞，接种于CD3Ab和CD28Ab预包被板，置于37℃、5％CO2培养箱进行大量扩增。
(2)CAR表达载体的构建
1)合成靶向人B7H3的scFv编码序列，所述scFv包括重链VH和轻链VL，二者之间由G4S短肽连接；
2)将逆转录毒载体MSCV和合成的靶向人B7H3的scFv经Nco I和Mlu I双酶切，进行片段回收，回收的目的片段用T4连接酶连接，然后转化Stbl3感受态细胞；
3)挑取单克隆进行质粒提取，经酶切鉴定后送测序确认，正确的质粒即为B7H3.CAR；
上述构建方法中，所述靶向B7H3共表达IL-21的全人源嵌合抗原受体的编码序列如SEQ ID NO:18所示。
(3)逆转录病毒包装
将含有CAR结构的穿梭质粒MSCV-B7H3.CAR 6μg、辅助质粒pCL-Ampho 4μg混合在300μL opti-MEM培养基中，在另一300μL opti-MEM培养基中逐滴加入30μL Genejuice转染试剂，轻弹混匀，室温静置5分钟，将含有转染试剂的混合物逐滴加入到质粒混合物中，震荡混匀，室温静置15分钟，然后将PEI与质粒混合物逐滴加入预先铺好的293T细胞培养皿中，轻摇混匀，48-72小时后，收集上清，经0.45μm针头滤器过滤，超低温冰箱保存备用。
(4)病毒感染iNKT细胞
将B7H3.CAR病毒液加入10μM HEPES和6-8μg/mL polybrene，混匀，用该病毒液重悬活化的iNKT细胞，然后加入RetroNectin预包被的24孔板中，1500g、30℃离心2小时后去上清，补加含有5％胎牛血清、200U/mL IL-2、10ng/mL IL-7和5ng/mL IL-15的X-Vivo培养基，继续扩增培养，即可得到靶向B7H3共表达IL-21的全人源B7H3.CAR-iNKT细胞B7H3.CAR/IL-21-iNKT。
(5)CAR表达效率的检测
待病毒感染后48-72小时，取2×105细胞进行染色，首先加入1μg/mL B7H3-Fc蛋白(R&D，1027-B3-100)4℃孵育30分钟，清洗细胞再加入AF647-anti-human IgG抗体(Jackson，109-606-088)4℃避光孵育30分钟，清洗细胞最后加入PerCP/Cy5.5-CD3(Biolegend，317336)、PE-iNKT(BD，#552825)、抗体4℃避光孵育30分钟，清洗后上机检测。
2、实验结果
利用流式检测上述制备的B7H3.CAR/IL-21-iNKT细胞CAR转染效率的结果见图1A-C和图2，结果显示：B7H3.CAR/IL-21-iNKT细胞CAR转染效率高达75-92％，显著高于B7H3.CAR-iNKT和iNKT，表明了本发明制备的B7H3.CAR/IL-21-iNKT细胞CAR转染效率高。
实施例2靶向B7H3共表达IL-21的全人源B7H3.CAR/IL-21-iNKT细胞因子释放能力、凋亡情况的检测
1、实验方法
(1)利用ELISA试剂盒检测细胞因子释放能力
收集2×105个B7H3.CAR/IL-21-iNKT细胞分别与2×105个肾癌细胞786-O、OSRC-2混匀加入24孔板中共孵育，设复孔，24h后收集培养上清；用ELISA试剂盒检测IFN-γ、IL-2的含量。
(2)利用流式细胞仪检测B7H3.CAR-iNKT细胞凋亡情况
收集本实施例制备的B7H3.CAR-iNKT和B7H3.CAR/IL-21-iNKT细胞，用不含细胞因子(IL-2/IL-7/IL-15)的T细胞培养基重悬，置于CO2培养箱。分别于0小时、72小时收集清洗细胞，用1×Annexin V Binding Buffer重悬，加入FITC-Annexin V和PI室温避光孵育15分钟，清洗重悬上机检测，分析共表达IL-21对B7H3.CAR-iNKT细胞凋亡的影响。
2、实验结果
实验结果见图3A和B，结果显示：与iNKT和B7H3.CAR-iNKT相比，本发明制备得到的B7H3.CAR/IL-21-iNKT细胞能分泌更高水平的细胞因子IL-2，细胞因子IFN-γ的分泌无显著差异，表明了本发明制备得到的B7H3.CAR/IL-21-iNKT细胞具有更强的扩增能力和存活能力。
图4的结果显示：饥饿培养72小时后，B7H3.CAR-iNKT细胞大量凋亡，而B7H3.CAR/IL-21-iNKT细胞凋亡比例明显少于B7H3.CAR-iNKT细胞，表明了本发明制备得到的B7H3.CAR/IL21-iNKT细胞抗凋亡能力增强。
实施例3 B7H3.CAR/IL-21-iNKT细胞体外杀伤肾癌细胞的能力验证
1、实验方法
首先在xCELLigence细胞功能分析仪的E-Plate检测板中加入50μL DMEM完全培养基，测定背景阻抗值；收集处于对数期的肾癌细胞786-O、OSRC-2，调整细胞悬液浓度至1×105/mL，向E-Plate检测板中加入100μL细胞悬液，室温静置30分钟后置于检测台上；实时动态观察待靶细胞增殖处于平台期时，实验孔按照效靶比5/1、1/1、1/5加入50μL效应细胞iNKT、B7H3.CAR-iNKT和B7H3.CAR/IL-21-iNKT，同时设单独肿瘤细胞为对照组，实时观察细胞介导的细胞杀伤效应曲线。
2、实验结果
实验结果见图5A-C和图6A-C，结果显示：B7H3.CAR/IL-21-iNKT和B7H3.CAR-iNKT细胞均能够高效杀伤B7H3高表达肿瘤靶细胞，二者体外杀伤活性无明显差异。
实施例4 B7H3.CAR/IL-21-iNKT细胞体内清除肾癌移植瘤的验证
1、实验方法
购买6周龄雄性NCG小鼠，通过皮下注射4×106 786-O-Luc-GFP细胞构建小鼠肾癌皮下移植瘤模型，第10天小鼠成瘤后随机分组为Blank组、B7H3.CAR-iNKT组和B7H3.CAR/IL-21-iNKT组，每组5只，共3组；第11和18天分别通过尾静脉输注B7H3.CAR-iNKT和B7H3.CAR/IL-21-iNKT细胞进行治疗，5×106/只；每周2次通过测量肿瘤体积观察治疗效果，并通过颌下静脉采血检测CAR-iNKT在体内的存活情况，记录小鼠的生存期。
2、实验结果
实验结果见图7A-C，图7A结果显示：NCG小鼠肾癌皮下移植瘤模型的建立和利用B7H3.CAR-iNKT和B7H3.CAR/IL-21-iNKT细胞治疗模式图；图7B结果显示：与Blank组和B7H3.CAR-iNKT组相比，B7H3.CAR/IL-21-iNKT细胞具有更好的抑制肿瘤生长的能力；图7C结果显示：治疗后14、21天，B7H3.CAR/IL-21-iNKT组小鼠外周血中CAR-iNKT细胞数显著高于Blank组和B7H3.CAR-iNKT组，表明了B7H3.CAR/IL-21-iNKT细胞的体内存活能力更强。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 徐州医科大学
<120> 一种靶向B7H3共表达IL-21的全人源嵌合抗原受体、iNKT细胞及其用途
<141> 2021-07-12
<150> 2021107393054
<151> 2021-06-30
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Phe Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
130 135 140
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
145 150 155 160
Ile Ser Ile Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro
165 170 175
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
195 200 205
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Tyr
210 215 220
Ser Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
225 230 235 240
<210> 2
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 3
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
35 40 45
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 5
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 8
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met
1 5 10 15
Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln
20 25 30
Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln
35 40 45
Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro
50 55 60
Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln
65 70 75 80
Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile
85 90 95
Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala
100 105 110
Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr
115 120 125
Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu
130 135 140
Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu
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Asp Ser
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<211> 670
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Phe Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Val Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser
145 150 155 160
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
165 170 175
Ser Gln Ser Ile Ser Ile Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly
180 185 190
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly
195 200 205
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
210 215 220
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln
225 230 235 240
Gln Thr Tyr Ser Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
245 250 255
Asp Ile Lys Thr Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
275 280 285
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
290 295 300
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
305 310 315 320
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser Arg
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
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Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
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Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
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Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
435 440 445
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
450 455 460
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
465 470 475 480
Pro Pro Arg Ala Cys Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr
485 490 495
Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Thr Met Arg Ser Ser
500 505 510
Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met Val Ile Phe Leu
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Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met
530 535 540
Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr
545 550 555 560
Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu
565 570 575
Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu
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Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile
595 600 605
Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln
610 615 620
Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro
625 630 635 640
Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile
645 650 655
His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser
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<210> 10
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atggaatttg gcctgagctg gctgtttctg gtggcgattc tgaaaggcgt gcagtgc 57
<210> 11
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaggtgcagc tgttccagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc caggggtgtt 300
ggccggggct ttgactactg gggccagggg accacggtca ccgtctcctc aagtggcggt 360
ggctctggcg gtggtgggtc gggtggcggc ggatcagaca tccagttgac ccagtctcca 420
tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc 480
attagcatct atttaaattg gtatcggcag caaccaggga aagcccctaa gctcctgatc 540
tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg 600
acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgcaac ttacttctgt 660
caacagactt acagtacccc tccgtggacg ttcggccaag ggaccaaagt ggatatcaaa 720
<210> 12
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgatatcta c 141
<210> 13
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 60
tactgc 66
<210> 14
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 15
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 16
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggatctggag agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc 60
cct 63
<210> 17
<211> 489
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atgagatcca gtcctggcaa catggagagg attgtcatct gtctgatggt catcttcttg 60
gggacactgg tccacaaatc aagctcccaa ggtcaagatc gccacatgat tagaatgcgt 120
caacttatag atattgttga tcagctgaaa aattatgtga atgacttggt ccctgaattt 180
ctgccagctc cagaagatgt agagacaaac tgtgagtggt cagctttttc ctgctttcag 240
aaggcccaac taaagtcagc aaatacagga aacaatgaaa ggataatcaa tgtatcaatt 300
aaaaagctga agaggaaacc accttccaca aatgcaggga gaagacagaa acacagacta 360
acatgccctt catgtgattc ttatgagaaa aaaccaccca aagaattcct agaaagattc 420
aaatcacttc tccaaaagat gattcatcag catctgtcct ctagaacaca cggaagtgaa 480
gattcctga 489
<210> 18
<211> 2013
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atggaatttg gcctgagctg gctgtttctg gtggcgattc tgaaaggcgt gcagtgcgag 60
gtgcagctgt tccagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcac ctttagcagc tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180
gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatt agtggtagtg gtggtagcac atactacgca 240
gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgccag gggtgttggc 360
cggggctttg actactgggg ccaggggacc acggtcaccg tctcctcaag tggcggtggc 420
tctggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga tcagacatcc agttgaccca gtctccatcc 480
tccctgtctg catctgtagg agacagagtc accatcactt gccgggcaag tcagagcatt 540
agcatctatt taaattggta tcggcagcaa ccagggaaag cccctaagct cctgatctat 600
gctgcatcca gtttgcaaag tggggtccca tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca 660
gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa cctgaagatt ttgcaactta cttctgtcaa 720
cagacttaca gtacccctcc gtggacgttc ggccaaggga ccaaagtgga tatcaaaacg 780
cgtaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 840
ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 900
ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 960
ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt 1020
gactacatga acatgactcc ccgccgcccc gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat 1080
gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc tccagagtga agttcagcag gagcgcagac 1140
gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1200
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1260
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1320
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1380
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1440
ccccctcgcg catgcggatc tggagagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg 1500
gaggagaatc ccggccctcg tacgatgaga tccagtcctg gcaacatgga gaggattgtc 1560
atctgtctga tggtcatctt cttggggaca ctggtccaca aatcaagctc ccaaggtcaa 1620
gatcgccaca tgattagaat gcgtcaactt atagatattg ttgatcagct gaaaaattat 1680
gtgaatgact tggtccctga atttctgcca gctccagaag atgtagagac aaactgtgag 1740
tggtcagctt tttcctgctt tcagaaggcc caactaaagt cagcaaatac aggaaacaat 1800
gaaaggataa tcaatgtatc aattaaaaag ctgaagagga aaccaccttc cacaaatgca 1860
gggagaagac agaaacacag actaacatgc ccttcatgtg attcttatga gaaaaaacca 1920
cccaaagaat tcctagaaag attcaaatca cttctccaaa agatgattca tcagcatctg 1980
tcctctagaa cacacggaag tgaagattcc tga 2013
