血小板生成素拟肽融合蛋白(fc-tmp)编码基因与应用
技术领域
本发明涉及生物技术制药领域的
技术领域
，特别是涉及一种血小板生成素拟肽融合蛋白(FC-TMP)编码基因与应用。背景技术
血小板生成素拟肽融合蛋白(FC-TMP)编码基因与应用是一种FC- TMP的融合蛋白及其编码基因与应用，其在生物技术制药领域的领域中得到了广泛的使用；现有的血小板生成素拟肽融合蛋白(FC-TMP) 编码基因与应用使用中发现，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，也称为原发免疫性血小板减少症，是一种获得性自身免疫性出血性疾病，现有的治疗手段通常有：肾上腺糖皮质激素、静脉输注丙种球蛋白、脾切除术等，治疗血小板减少性紫癜的药物主要有以下几类：泼尼松、地塞米松、硫唑嘌呤、环孢素、达那唑、环磷酰胺、长春新碱等，在上述的已有治疗ITP患者的药物中，皮质激素类药物会引起行为改变、继发严重感染、体重增加、骨质疏松和尿糖阳性等不良反应或副作用；免疫制剂抑制细胞和体液免疫反应，不良反应较多，不适宜长期使用，综合分析现有的治疗情况，对于新诊断、急性的ITP患者目前已经有标准的治疗方案和药物，但对于慢性难治的ITP，即经糖皮质激素、免疫球蛋白或脾切除术的ITP患者，目前在国内还没有良好的治疗药物，可供患者选择的药物较少。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种促进血小板的生成，显著提高血小板的水平，降低出血风险，另外，由于含有人IgG1Fc片段，可延长其在体内的半衰期的血小板生成素拟肽融合蛋白(FC-TMP)编码基因与应用。
本发明的血小板生成素拟肽融合蛋白(FC-TMP)编码基因与应用，第一个目的提供编码融合蛋白FC-TMP的核苷酸序列，编码该融合蛋白的核苷酸分子为序列2。
上述核苷酸分子为如下1)-3)中任一所述的核苷酸分子：
1)编码区为序列表中序列1所示的核苷酸分子；
2)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交且具有相同功能的核苷酸分子。
3)与1)或2)限定的核苷酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的核苷酸分子。
上述严格条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
上述序列2中自5’末端第1-668bp的核苷酸序列为IgG1Fc基因，序列2中自5’末端第669-789bp的核苷酸序列为2个串联的TMP基因(包含连接子)。
上述序列2所示的核苷酸分子均可编码序列表中序列1的氨基酸残基所示的蛋白。
上述重组载体为将上述核苷酸分子插入表达载体中得到的重组载体，在本发明菌株的实施例中，表达载体为pET22b，重组载体为将序列表中序列2所示的核苷酸分子插入pET22b载体的NheI和Xho I酶切位点间得到的载体，命名为pET22b/FC-TMP。
上述重组菌株为将上述重组载体导入宿主细胞得到的转基因重组菌株；在本发明的实施例中宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)plys S。
本发明的血小板生成素拟肽融合蛋白(FC-TMP)编码基因与应用，第二个目的提供一种升血小板的产品。
本发明提供的产品，其活性成分为如下1)-3)中任一种：1)上述的蛋白；2)上述核苷酸分子；3)上述的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。
与现有技术相比本发明的有益效果为：本发明的实验证明，本发明通过优化密码子，得到新的融合蛋白FC-TMP，将融合蛋白FC-TMP 的核苷酸分子，将其通过载体导入细胞中，表达纯化出适合商业化生产的融合蛋白FC-TMP；FC-TMP是一种血小板生成素(TPO)受体激动剂，通过与TPO受体(c-Mpl)特异性结合，活化细胞通路，刺激巨核细胞的增殖、分化和成熟，促进血小板的生成，显著提高血小板的水平，降低出血风险。另外，由于含有人IgG1Fc片段，可延长其在体内的半衰期。
附图说明
图1 FC-TMP表达载体构建示意图；
图2 FC-TMP基因工程菌的表达分析；
图3 FC-TMP基因工程菌表达产物免疫印迹；
图4 FC-TMP质粒酶切图谱分析；
图5 各代FC-TMP工程菌质粒酶切结果；
图6 各代工程菌F-TMP表达情况；
图7 FC-TMP给药前(0d)、给药后不同时间对脾切除小鼠PLT的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1、融合蛋白FC-TMP基因工程菌的构建
1、FC-TMP核苷酸序列优化、设计：
对序列表1中FC-TMP氨基酸序列进行密码子进行优化，同时根据表达系统的克隆位点要求，在核苷酸5′端和3′端分别添加Nde I(CATATG)和Xho I(CTCGAG)酶切位点，其中内切酶Nde I (CATATG)中的ATG为起始密码子，3′端内切酶Xho I(CTCGAG)前加入终止密码子TAA。具体见序列表2。
2、FC-TMP基因的合成：
将优化设计的序列表2的核苷酸序列委托英捷基(上海)贸易有限公司完成，根据序列表2的核苷酸序列两端添加Nde I和Xho I酶切位点，进行单链oligo合成，利用PCR对合成的oligo进行拼接反应，将拼接的PCR产物连接到T载体上，将载体转入宿主菌中，通过菌落PCR获得阳性克隆。对阳性克隆测序验证，如有突变，进行突变修复后，再次验证直到序列正确无误。
3、含有FC-TMP基因的重组载体的构建及转化：
FC-TMP表达载体构建示意图见图1。
将合成的序列表2的核苷酸序列用Nde I和Xho I双酶切后，经琼脂糖电泳回收目的基因，与用Nde I和Xho I双酶切后的 pET22b质粒大片段相连接，转化到BL21(DE3)plysS中，获得阳性克隆，并通过对阳性克隆菌株进行核苷酸测序得以确证。我们将获得的血小板生成素拟肽cDNA表达质粒命名为pET22b/FC- TMP。基因工程菌为pET22b/FC-TMP/BL21。
4、FC-TMP基因工程菌的表达分析：
接种工程菌pET22b/TMP/BL21的单菌落于ALB培养液，在37℃培养过夜作为种子，按1∶10接种到ALB培养基中，37℃振荡培养，至OD600＝0.4～0.7，加入终浓度为1mM IPTG，诱导表达4h后，4℃， 10000rpm，离心5min，收获菌体。取样品裂解后做SDS-PAGE电泳分析(见图2)，在分子量约29.5KD处可见明显的血小板生成素拟肽的蛋白条带，与理论相符。经光密度扫描计算，表达的血小板生成素拟肽约占菌体总蛋白的30％以上，表明我们获得了血小板生成素拟肽的高效表达。
5、FC-TMP的Western Blot分析：
将pET22b/TMP/BL21表达产物与阴性对照及阳性对照(阴性对照为重组人粒细胞刺激因子原液，阳性对照为国外同类产品 Nplate药品)做SDS-PAGE电泳后转移至硝酸纤维素膜上，将硝酸纤维素膜放在一平板上，加入封闭液，37℃下轻轻震荡1小时。封闭结束后用PBS洗3次，将硝酸纤维素膜浸泡在一抗溶液中，室温下过夜。将硝酸纤维素膜用PBS洗3次，每次8分钟。将膜浸泡在二抗溶液中，在室温下轻轻震荡40min。取出硝酸纤维素膜，用PBS洗3次，每次8分钟，将膜放入显色液中，室温下轻轻摇动，观察显色反应，当条带达到所需深度时，立刻用水终止显色，然后将膜转入PBS中保存。
一抗为鼠抗血小板生成素拟肽多克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白质抗体，以底物DAB显色，进行 Western-blot试验，免疫杂交分析见图3。
6、FC-TMP高效表达工程菌的特性鉴定：
6.1细菌形态、生化反应与抗生素抗性的检测：
挑取FC-TMP工程菌菌落，接种在含氨苄青霉素的LB培养液中， 37℃振荡培养20h后，按1∶10的比例转种到含氨苄青霉素的LB培养液中，扩大培养3h。其中一部分用于提取质粒，做酶切图谱鉴定；另一部分分别接种于含或不含氨苄青霉素的两种LB培养基以及各种特定的培养基上，观察抗生素的抗性及菌落、菌型及生化反应。
启开冻干的BL21(DE3)plys S菌种一支，接种在不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养20h后，按1∶10的比例扩大培养，然后接种在含与不含氨苄青霉素的培养基以及各种特定的培养基中，观察抗生素抗性、菌落及生化反应。实验参照《中国药典》三部(2015年版)附录X IV细菌生化反应培养基。将上述实验结果归纳见表1、表2、表3。
表1 细菌形态
表2 细菌对氨苄青霉素的抗性
表3 菌种的生化反应
注：表示产气产酸；+表示阳性；-表示阴性
以上检查说明FV-TMP工程菌是具有氨苄青霉素抗性的大肠杆菌。
6.2质粒酶切图谱分析：
用碱裂解法快速提取质粒DNA，酚/氯仿抽提后乙醇沉淀，真空干燥回溶于含有RNase的TE缓冲液中，37℃作用30min后做酶切鉴定。分别用Nde I，Nde I/Xho I，Pst I/BglII，Mlu I/Xho I进行酶切分析，1％琼脂糖电泳后，在凝胶成像紫外分析仪中成像观察(见图4)，从图上可见pET22b/TMP用Nde I切成一条带大小为6170bp，而Nde I /Xho I，Pst I/Bgl II，Mlu I/Xho I分别切出两条带，其中大小分别为807bp和5363bp，3961bp和2209bp，1633bp和4537bp，酶切的实际情况与预期相符，说明pET22b/TMP符合构建成功。
7.工程菌传代遗传稳定性资料
将原始菌种扩大培养后接种于LB斜面无选择压力培养基，此为F1 代，再由F1代接种另一斜面，此为F2代，依次类推传至F100代。间隔选取F1、F10、F20、F40、F80、F100各一支菌种扩大培养，并作以下检查(结果见表4)。
A、划LB脂平板。
B、涂片作革兰氏染色。
C、氨苄青霉素抗性检测。
D、提取质粒用Nde I/Xho I双酶切，电泳检查是否为大 (5363bp)和小(807bp)两条带，结果见图5。
E、摇床培养FC-TMP的表达量见图5。
表4 传代稳定性观察
8.工程菌质粒遗传稳定性检测：
利用重组质粒含有氨苄抗性基因的特点，在不含氨苄青霉素的LB培养基中连续培养，检测工程菌传代过程中的质粒丢失情况。具体操作如下：
从原始菌株平板中接种单菌落于LB液体培养基中，37℃培养过夜，此为F2代，依次类推，培养至F100代。间隔选取F1、F10、 F20、F40、F80、F100代培养物，用LB培养基稀释至103，取100μ l涂LB平板，37℃培养过夜，次日随机挑选100个菌落对应接种于ALB、LB平板上，37℃培养过夜，比较两者的差异，并计算丢失质粒的百分数(见表5)。
表5 血小板生成素拟肽工程菌传代过程中的质粒丢失情况
由表可见，工程菌在LB培养基中传代100代后，质粒丢失的百分数为0％，说明工程菌的质粒遗传是稳定的。
本发明的血小板生成素拟肽融合蛋白(FC-TMP)编码基因与应用，其在工作时，首先合成出两端携带Nde I和Xho I酶切位点的FC-TMP全长cDNA，经Nde I和Xho I酶切后，经琼脂糖电泳回收，与经Nde I和Xho I双酶切后的pET22b质粒大片段相连接，转化到 BL21(DE3)plys S，获得阳性克隆，并通过对阳性克隆菌株进行 DNA测序。经测序证实：所合成的cDNA与优化设计的FC-TMP序列一致，该序列中包含807bp的FC-TMP cDNA，共编码269个氨基酸残基，证明我们所合成的F-TMP cDNA是正确的。该工程菌在LB液体培养基中摇床培养，用IPTG诱导表达，离心培养液获得菌体裂解做SDS-PAGE电泳，获得分子量约为29.5KD的蛋白表达带，表达水平为30％以上。用质粒酶切图谱证实构建的表达质粒符合设计要求。经Westeron blot分析，证实本产物与鼠抗FC-TMP多克隆抗体发生了免疫反应，说明表达产物正确。工程菌传代/遗传稳定。由此可见，我们获得FC-TMP高效表达且遗传稳定的基因工程菌株。
实施例2、融合蛋白FC-TMP的体内药效学试验
2.1注射用FC-TMP对脾切除小鼠血小板数量(PLT)的影响：
试验采用小鼠脾切除模型[4]。将脾切除小鼠随机分为注射用FCT-MP高剂量组(100μg/kg)、中剂量组(50μg/kg)、低剂量组(10μg/kg)、阳性对照组(100μg/kg)和模型对照组(0μ g/kg)，每组20只小鼠。小鼠脾切除后48h，颈背部皮下注射给药一次，给药体积为0.1ml/10g。
小鼠脾切除后单次皮下注射给予注射用FC-TMP，给药后PLT 高剂量组＞阳性对照组＞中剂量组＞低剂量组＞模型对照组；脾切除小鼠给药后第3天PLT开始上升，第5天高剂量达到最高值 (5430×109/L)，与阳性对照组药效相当。结果见图6。
2.2注射用血小板生成素拟肽对正常大鼠血小板数量(PLT) 及骨髓细胞分类的影响：
将70只大鼠按血小板数量(PLT)分为注射用FC-TMP高剂量组(100μg/kg)、中剂量组(30μg/kg)、低剂量组(10μg/kg)、阳性对照组(100μg/kg)和辅料对照组，每组10只动物。颈背部皮下注射，给药体积为0.5ml/200g；每周给药3次，连续给药10 次。
大鼠皮下注射不同剂量的FC-TMP后各组大鼠体重呈明显增长趋势；大鼠给药3次(每周给药3次，连续给药10次)后检测血小板数量即呈上升趋势，连续给药10次后血小板继续上升，且呈明显的剂量相关性；给药后第25d血小板数量升至最高：阳性对照组＞高剂量组＞中剂量组＞低剂量组＞辅料对照组；给药后第 27天血小板数量开始下降，至给药后33天各给药组血小板数量基本恢复正常；试验结束时各组大鼠解剖取胸骨骨髓作涂片、分类计数。结果显示，FC-TMP各剂量组骨髓增生活跃，说明血小板生成素拟肽有促进骨髓细胞分裂增殖作用。具体结果见表6和表7。
表7 血小板生成素拟肽对正常大鼠骨髓细胞分类计数的影响
n＝10， *p＜0.05，**p＜0.01与模型对照组比较；★p＜0.05，★★p＜0.01与阳性对照组比较
本实验通过大鼠皮下注射不同剂量的FC-TMP，观察FC-TMP对正常大鼠血小板数量及骨髓细胞分类计数的影响。结果显示，大鼠皮下注射不同剂量的FC-TMP肽后各组大鼠体重呈明显增长趋势，说明其对大鼠体重无明显影响。大鼠给药3次(每周给药3次，连续给药10次)后检测血小板数量即呈上升趋势，连续给药10次后血小板继续上升，且呈明显的剂量相关性。给药后第25d血小板数量升至最高：阳性对照组＞高剂量组＞中剂量组＞低剂量组＞辅料对照组；给药后第27天血小板数量开始下降，至给药后33 天各给药组血小板数量基本恢复正常。血小板生成素拟肽各剂量组大鼠随着给药次数的增加，血小板数量不断增加，停药后血小板数量逐渐下降，说明FC-TMP有一定的剂量依赖性。
试验结束时各组大鼠解剖取胸骨骨髓作涂片、分类计数。结果显示，血小板生成素拟肽各剂量组骨髓增生活跃，说明血小板生成素拟肽有促进骨髓细胞分裂增值作用。
序列1
FC-TMP氨基酸序列
序列2
FC-TMP优化设计核苷酸序列
注：红色表示为Nde I酶切位点，
绿色表示为Xho I酶切位点，
双划线位置为起始子，
单划线位置为终止子，
加粗部分为FC-TMP基因序列。
本发明的血小板生成素拟肽融合蛋白(FC-TMP)编码基因与应用，其下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，只要能够达成其有益效果的均可进行实施。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
