基于谱效相关性的裸花紫珠收敛作用物质评价方法
技术领域
本发明涉及到一种评价中药化学成分药效活性的方法，具体涉及一种基于降低血管通透性收敛作用谱效关系的裸花紫珠化学成分评价方法。
背景技术
裸花紫珠(Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.)为马鞭草科紫珠属植物，裸花紫珠叶为药用，全年均可采收，是一种常用的海南地区的传统民族药，由于其生长在海南黎族地区，故也称为黎药。裸花紫珠是2015版药典唯一新增补药材，其化学成分主要为黄酮类、苯乙醇苷类、萜类及挥发油类等，具有消炎、解毒、收敛、止血的功能，用于化脓性炎症、急性传染性肝炎、呼吸道及消化道出血、创伤出血等。据《本草拾遗》记载裸花紫珠能解诸毒物，痈疽，喉痹，毒肿，下瘘，蛇虺虫螫，狂犬毒，并煮汁服；亦煮汁洗疮肿，除血长肤。
中药谱效关系是在中医理论指导下，将中药指纹图谱和药效学通过化学计量学模型进行关联，建立以化学分析与生物活性评价相结合的综合评价体系，有助于揭示中药药效的物质基础，已成为中药有效成分预测和质量评价的方法之一。中药指纹图谱能够揭示中药的化学成分，在整体上评价中药的质量，具有特征性、专属性、稳定性和完整性等特点。但指纹图谱的研究与建立只是对中药化学成分的稳定性和可控性实现改进，而没有与中药的药效建立直接的内在联系。谱效关系的研究建立在指纹图谱的基础上，指纹图谱提供了复杂体系的化学成分信息，药理学研究提供了其活性信息，谱效关系的研究使二者有效结合，更可靠地揭示中药药效的物质基础。目前谱效关系的研究方法有相关性分析、回归分析、主成分分析、灰色关联度分析、聚类分析和典型相关分析。大量药理研究表明，裸花紫珠正丁醇提取部位具有止血凝血作用，总黄酮具有抗炎作用等。因此本发明以裸花紫珠不同提取部位的HPLC指纹图谱为基础，通过双变量相关分析和回归分析，考察裸花紫珠降低血管通透性收敛药效活性的谱效关系，建立裸花紫珠收敛作用物质评价方法。
发明内容
本发明的目的在于针对目前缺乏的有效高效的评价裸花紫珠收敛效果的方法，提供一种基于降低血管通透性谱效相关性的裸花紫珠收敛作用物质评价方法，可以快速、准确地评价裸花紫珠中具有收敛作用的化学成分，进行活性成分筛选，为裸花紫珠的药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于降低血管通透性谱效相关性的裸花紫珠收敛作用物质评价方法，通过建立裸花紫珠不同极性提取物的HPLC指纹图谱，标定特征峰通过相似度评价软件筛选出匹配数大于2的特征峰为相关峰，并根据HPLC指纹图谱的特征相关峰的峰面积和收敛效果建立相应的谱效关系，然后利用所建立的谱效关系直接评价裸花紫珠的收敛效果。
一种基于降低血管通透性谱效相关性的裸花紫珠收敛作用物质评价方法，含以下步骤：
(1)取裸花紫珠药材粉碎成粗粉，称取3份，分别加入10倍量水、60％乙醇、95％乙醇；回流提取2h，提取两次；过滤，合并滤液，滤液进行溶剂回收；减压干燥，制得水提取物、60％醇提取物、95％醇提取部位干燥提取物；称取部分60％乙醇提取物，用水溶解后过AB-8大孔吸附树脂柱，用水洗脱至洗脱液澄清，洗脱液减压回收干燥得60％醇提-水洗提取物；再用40％乙醇洗脱至洗脱液澄清，洗脱液减压回收干燥得60％醇提-40％醇洗提取物；再用60％乙醇洗脱至洗脱液澄清，洗脱液减压回收干燥得60％醇提-60％醇洗提取物。
(2)取相当于生药量1g的上述提取物浸膏粉，精密称定，置具塞茄形瓶中，精密加入50％甲醇50mL，溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(3)色谱条件：色谱柱采用十八烷基键合硅胶填料；流动相为：A为0.5％磷酸溶液，B为乙腈；采用梯度洗脱：0min→10min→20min→30min，乙腈：82％→80％→76％→82％，0.5％磷酸溶液：18％→20％→24％→18％；流速：1.0mL/min；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：330nm；柱温：35℃；进样量：10μL；建立裸花紫珠供试品的HPLC指纹图谱；
(4)通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件分析得到匹配数据，选择匹配数大于2的特征峰，提取特征峰数据；
(5)对磷酸组胺制炎大鼠灌服步骤(1)中的各种提取物，检测对磷酸组胺制炎大鼠皮肤OD值和蓝斑面积的影响；
(6)将步骤(4)中所筛选的特征峰数据和药效活性数据经化学计量学方法进行统计分析并代入谱效数学模型中进行计算，并根据所得的结果评价裸花紫珠收敛作用的药效物质基础。
优选的，步骤(4)中筛选的特征相关峰的保留时间分别为：2.727min、2.911min、3.738min、5.246min、5.775min、6.137min、7.079min、8.363min、9.790min、11.586min、12.810min、13.717min、14.992min、17.755min、18.584min、19.705min、20.298min、21.021min、22.862min、24.218min、25.078min。
优选的，步骤(4)中所筛选的相关峰峰面积与收敛药效数据之间进行相关性分析，并通过多元线性回归建立谱效方程，从而判断裸花紫珠收敛作用的物质基础。其中相关色谱峰2、4、8、9、11、13、18和23与大鼠皮肤OD值和蓝斑面积呈现较好的相关性，即保留时间分别为2.911min、3.738min、5.775min、6.137min、7.079min、9.790min、14.992min、19.705min的色谱峰，并且指认峰8为原儿茶酸、峰11为原儿茶醛、峰13为芦丁、峰18为异毛蕊花糖苷、峰23为木犀草素；运用DAD图谱中化合物紫外吸收的特征可确认色谱峰2、4、9化合物类型苯乙醇苷类、黄酮类及酚酸类。
并且其中峰4和峰11分别以不同程度被引入谱效数学模型，如下：X4代表保留时间为3.738min色谱峰峰面积，X11代表保留时间为7.079min色谱峰峰面积；Y皮肤OD值、Y蓝斑面积代表裸花紫珠的收敛作用效率。
Y皮肤OD值＝0.027-0.00018*X4，P＝0.007<0.05，R2＝0.862；
Y蓝斑面积＝11.485-0.076*X4-0.006*X11，P＝0.001<0.05，R2＝0.994；
与现有的技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明利用化学模式识别方法将裸花紫珠提取物在指纹图谱上所体现的化学成分的变化和药效的变化建立了相关性，并明确裸花紫珠中对磷酸组胺至炎大鼠的收敛作用的药效物质基础是以苯乙醇苷类化合物和酚酸类小分子化合物为主，黄酮类化合物为辅。
(2)本发明建立了基于降低血管通透性收敛作用谱效关系的裸花紫珠化学成分评价方法，明确了裸花紫珠中与收敛药效活性较为密切的化学成分，为裸花紫珠的收敛作用药效物质基础研究提供依据，同时采用指纹图谱和数学模型结合的方式避免第三方因素的干扰，避免了动物个体偏差，能够快捷明确的确定裸花紫珠提取物的收敛效果评价。
(3)本发明可以快速、准确地评价裸花紫珠中具有改善血管通透性作用的化学成分及活性成分筛选，为裸花紫珠的药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明的裸花紫珠样品提取物HPLC指纹图谱；
图2为本发明的裸花紫珠不同极性提取物匹配后HPLC指纹图谱；
图3为保留时间为2.911min的色谱峰的紫外扫描图；
图4为保留时间为3.738min的色谱峰的紫外扫描图；
图5为保留时间为5.775min的色谱峰的紫外扫描图；
图6为保留时间为6.137min的色谱峰的紫外扫描图；
图7为保留时间为7.079min的色谱峰的紫外扫描图；
图8为保留时间为9.790min的色谱峰的紫外扫描图；
图9为保留时间为14.992min的色谱峰的紫外扫描图；
图10为保留时间为19.705min的色谱峰的紫外扫描图；
图11为保留时间为2.911min的色谱峰的峰面积与收敛效果的线性关系图；
图12为保留时间为3.738min的色谱峰的峰面积与收敛效果的线性关系图；
图13为保留时间为5.775min的色谱峰的峰面积与收敛效果的线性关系图；
图14为保留时间为6.137min的色谱峰的峰面积与收敛效果的线性关系图；
图15为保留时间为7.079min的色谱峰的峰面积与收敛效果的线性关系图；
图16为保留时间为9.790min的色谱峰的峰面积与收敛效果的线性关系图；
图17为保留时间为14.992min的色谱峰的峰面积与收敛效果的线性关系图；
图18为保留时间为19.705min的色谱峰的峰面积与收敛效果的线性关系图；
图19为保留时间为5.775min的色谱峰的二级质谱图；
图20为保留时间为7.079min的色谱峰的二级质谱图；
图21为保留时间为9.790min的色谱峰的二级质谱图；
图22为保留时间为19.705min的色谱峰的二级质谱图；
图23为裸花紫珠不同提取物的PCA主成分分析图；
图24为主成分的ward法聚类分析验证图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.试验仪器和材料
1.1仪器
美国Agilent1260型高效液相色谱仪；SPSS 22.0统计分析软件；FA1004电子天平；YXQ-2S-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器；SP-756PC型紫外可见分光光度计。
1.2材料
裸花紫珠叶样品：采自海南白沙。阿莫西林胶囊购自澳美制药厂；伊文思蓝购自上海惠诚生物科技有限公司。
对照品：毛蕊花糖苷和连翘脂苷B对照品购自成都瑞芬思生物科技有限公司；木犀草苷对照品购自成都普瑞法科技开发有限公司；异毛蕊花糖苷对照品上海医药工业研究院中药研究部实验室提供，所有对照品质量分数均≥98％。
HPLC用乙腈和磷酸为色谱纯，水为自制重蒸水，其余试剂为分析纯。
1.3实验动物
SD大鼠由南通大学实验动物中心提供，以全价营养颗粒饲料饲养，给药前后，各组大鼠均分笼饲养，喂饲全价营养颗粒饲料，自由饮水，室温22 2 2℃，湿度55％-65％。
2.制备裸花紫珠不同极性部位
2.1取裸花紫珠粉碎过4号筛，精密称取3份，每份2kg，置于圆底烧瓶中，分别加入10倍量体积的水、60％乙醇、95％乙醇，回流提取2h，提取两次，滤过，合并滤液，滤液经回收溶剂，减压干燥，制得干燥提取物1、2、3；。
2.2取部分提取物2加水溶解，过AB-8大孔吸附树脂柱，用水洗脱至洗脱液澄清，合并洗脱液，减压回收至干，即得60％醇提-水洗提取物，称为提取物4；再改以40％乙醇继续洗脱至洗脱液澄清，合并洗脱液减压回收至干，得60％醇提-40％醇洗提取物，称为提取物5；再改以60％乙醇继续洗脱至洗脱液澄清，合并洗脱液减压回收至干得60％醇提-60％醇洗提取物，称为提取物6。
3.建立裸花紫珠不同极性提取物的HPLC指纹图谱
3.1供试品溶液的制备
取相当于生药量1g上述提取物1、2、3、4、5、6浸膏粉，精密称定，置具塞茄形瓶中，精密加入50％甲醇50mL，溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品1。
取裸花紫珠药材60℃真空干燥，粉碎过4号筛，粉末约1g，精密称定，置具塞茄形瓶中，精密加入50％甲醇50mL，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品2。
3.2裸花紫珠指纹图谱的建立：采用高效液相色谱法对以上所得样品进行指纹图谱测定；色谱条件：色谱柱采用十八烷基键合硅胶填料；流动相为：A为0.5％磷酸溶液，B为乙腈；采用梯度洗脱：0min→10min→20min→30min，乙腈：82％→80％→76％→82％，0.5％磷酸溶液：18％→20％→24％→18％；流速：1.0mL/min；检测器：UV-DAD；检测波长：330nm；柱温：35℃；进样量：10μL；
3.3通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件分析得到匹配数据，选择匹配数大于2的特征峰，提取特征峰数据：21个匹配数大于2的共有峰的保留时间分别为：2.727min、2.911min、3.738min、5.246min、5.775min、6.137min、7.079min、8.363min、9.790min、11.586min、12.810min、13.717min、14.992min、17.755min、18.584min、19.705min、20.298min、21.021min、22.862min、24.218min、25.078min。特征峰色谱图及匹配后色谱图见说明书附图1和2。
3.4方法学考察
3.4.1精密度考察：取裸花紫珠药材粉末1g，精密称定，按“3.1”中供试品溶液2的方法，制备供试品溶液，按“3.2”中色谱条件连续进样6次，测得各指纹峰的相对保留时间RSD<0.2％，相对峰面积RSD<1.8％，表明该方法的精密度良好。
3.4.2重复性考察：分别取6份裸花紫珠药材粉末各1g，精密称定，按“3.1”项中供试品溶液2的方法，制备供试品溶液6份，按“3.2”项色谱条件，依次进样，测得各指纹峰的相对保留时间RSD<0.2％，相对峰面积RSD<2.3％，表明该方法的重复性良好。
3.4.3稳定性考察：取裸花紫珠药材粉末1g，精密称定，按“3.1”项中供试品溶液2的方法，制备供试品溶液，按“3.2”项色谱条件，在0、2、4、6、12和24h分别进样，测得各指纹峰的相对保留时间RSD<0.2％，相对峰面积RSD<2.7％，表明供试品溶液在24h内稳定。
4.对不同极性提取物进行药效学实验
4.1取体重140～170g SD雄性大鼠100只，正常饲养3天后，随机分为10组，每组10只，分别编号称重。
4.2分组为：正常组、模型组、阿莫西林西组、裸花紫珠颗粒剂组、裸花紫珠提取物1组、裸花紫珠提取物2组、裸花紫珠提取物3组、裸花紫珠提取物4组、裸花紫珠提取物5组、裸花紫珠提取物6组。
4.3以上各组分别灌胃给药7天，末次给药1h后在大鼠背部脱毛处注入磷酸组胺2mg/mL，0.1mL/只致炎，即刻由尾静脉注入1％伊文思蓝50mg/kg，20min后处死动物，剪下各鼠背部致炎处蓝色皮肤2.5cm*2.5cm,测量色斑的面积；
4.4用10cm的打孔器将蓝色皮肤取下并剪碎，置于7:3的丙酮生理盐水混合液5mL中浸泡并置暗处48h，取出1500r/min离心10min，取上清液，用分光光度计620nm处测其滤液的光密度，并记录每组的光密度值，数据见下表1。
表1灌服不同裸花紫珠提取物对磷酸组胺致炎大鼠皮肤OD值、蓝斑面影响
ΔΔP<0.01与正常组比较；*P<0.05，**P<0.01与模型组比较。
5.谱效相关性分析
5.1方法
5.1.1双变量相关分析
以量化峰面积为自变量，药效指标为因变量，采用SPSS22.0统计软件的双变量相关分析方法进行数据处理，得到指纹图谱中各相关峰与药效的皮尔森相关系数。
5.1.2多元线性回归分析
以量化峰面积为自变量，药效指标为因变量，用SPSS 22.0对数据进行线性回归分析，采用逐步引入法进行模型拟合。
5.1.3 PCA分析及ward聚类分析
通过SPSS 22.0PCA分析对裸花紫珠的6种不同提取物的21个相关峰进行PCA分析，从而寻找出相关峰对6种提取物组分组间差异有较大影响且较大累计贡献率的指标，使谱效关系评价更准确，并且通过ward聚类分析验证PCA分析结果。
5.2结果
5.2.1双变量相关分析结果
如下表2，色谱峰2、4、8、9、11、13、18和23与大鼠皮肤OD值和蓝斑面积呈现较好的相关性，即保留时间分别为2.911min、3.738min、5.775min、6.137min、7.079min、9.790min、14.992min、19.705min的色谱峰，且为负相关关系，其中色谱峰4与皮肤OD值、蓝斑面积均呈现强相关性，色谱峰23与皮肤OD值呈现强相关性、而色谱峰2和11与蓝斑面积均呈现强相关性。结合对照品和相对保留时间比对，紫外可见图和谱质谱数据比对指认色谱峰8为原儿茶酸、色谱峰11为原儿茶醛、色谱峰13为芦丁、色谱峰23为木犀草素,质谱数据详见下表3。运用DAD图谱中化合物紫外吸收的特征初步确认色谱峰2、4、9化合物类型苯乙醇苷类、黄酮类及酚酸类。
表2相关峰峰面积及双变量相关性分析结果
*P<0.05，**P<0.01
表3鉴定出成分的质谱数据
5.2.2多元线性回归分析结果
如下表4，裸花紫珠相关色谱峰与其收敛作用的两个指标皮肤OD值及蓝斑面积二者所建立的模型相关系数较高，R2均大于0.85说明皮肤OD值及蓝斑面积的改变85％能够通过自变量解释，P值均小于0.05具有统计学意义，说明模型能较好的评价裸花紫珠色谱峰与收敛药理活性之间的关系。
表4数学模型建立结果
综合以上两种分析法的分析结果，基本能够确定裸花紫珠发挥收敛作用的成分为苯乙醇苷类化合物、黄酮类和酚酸类小分子化合物。色谱峰2、4、8(原儿茶酸)、9、11(原儿茶醛)、13(芦丁)、18(异毛蕊花糖苷)和23(木犀草素)可能是裸花紫珠发挥收敛作用的物质基础。
5.2.3 PCA分析及ward聚类分析结果
分析结果如表5所示，保留主成分个数累计贡献率>80％、特征值>1、经过KMO(越接近1越适合PCA分析)和Bartlett检验(P<0.01)的成分。
表5主成分分析结果
从上述主成分分析能够确定两个主要成分，其中第一主成分贡献率为64.85％，第二主成分贡献率为22.04％，两个主成分的累计贡献率为86.89％，符合要求。利用SPSS22.0主成分分析实现6种提取物的PCA荷载成分图分析，如附图19所示。从图中可以看到提取物4和6聚为一类，提取物1、3、2、5聚成一类，同时可明显看到提取物4、6对主成分2有显著影响，提取物2有略微影响；提取物1、3对主成分1有显著影响，提取物5有略微影响。
随后利用SPSS 22.0软件中的ward法聚类分析法对主成分分析进行验证，如附图20所示，提取物4和6聚为一类，提取物1、3、2、5聚成一类，图中显示结果与PCA分析结果基本一致，说明PCA分析结果可靠。结合各提取物的21个相关峰峰面积和pearson相关分析结果，可确认成分1是苯乙醇苷类化合物及黄酮类化合物，成分2是酚酸类化合物。提取物4、6及2中含有较多酚酸类成分，提取物1、3及5中含有较多黄酮类及苯乙醇苷类成分。
- 上一篇：石墨接头机器人自动装卡簧、装栓机
- 下一篇：一种在线监测GCMS设备的智能标定方法
