一种基于智能手机快速检测草甘膦的方法
技术领域
本发明涉及化学分析检测
技术领域
，具体为一种基于智能手机快速检测草甘膦的方法。背景技术
草甘膦(glyphosate)， 又称镇草宁、农达、草干膦、膦甘酸，化学名称为Ｎ-（磷酸甲基） 甘氨酸，由美国孟山都公司开发，是一种内吸传导型广谱灭生性除草剂。草甘膦可以除去一年生或多年生恶性杂草，因具有髙效、低毒、廉价等特点而广泛应用于很多领域，尤其是农业领域，现已成为全球生产和使用量最大的除草剂。我国颁布的《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》（GB2763-2019）中规定茶叶中草甘膦最大残留限量为1mg/kg。草甘隣属氨基酸类除草剂，具有强极性，不溶于一般有机溶剂，缺少发色和荧光基团，与植物中的有机物有很强结合能力，使其直接分析难度较大。目前草甘膦检测方法包括液相色谱-质谱法、离子色谱法，方法检测复杂，时间长，需要大型仪器设备及专业人员。
纳米酶是一类既有纳米材料的独特性能，又有催化功能的模拟酶，纳米酶作为一类新型的模拟酶，它具有许多其他传统模拟酶所无法企及的优点，人们可以根据纳米材料模拟酶的特性进行研究并加以利用，让纳米酶具有更大的应用前景；Fe3O4纳米材料是最早发现的模拟纳米酶，通过修饰得到的Fe3O4模拟纳米酶具有更高的酶活及应用。
数字图像比色法(Digital Image Colorimetry，DIC)作为一种新型的比色分析方法，主要是通过使用智能手机对检测区拍照，然后对图像中的检测区域通过颜色模型转化为待测物的颜色值，从而实现目标物的定量检测。基于RGB（其中R代表红色，G代表绿色，B代表蓝色）检测方法是以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量生成的有色物质溶液颜色RGB值来确定待测组分含量的方法，具有快速、准确、简便和稳定等特点，可以在现场快速定性定量检测中发挥重要作用。
发明内容
针对草甘隣检测现有技术的不足，本发明提供了一种基于智能手机快速检测草甘膦的方法，本方法基于草甘膦特异性地抑制庚酸包覆四氧化三铁（Fe3O4@C7）拟过氧化物酶模拟催化活性，通过区分所建立的纳米酶颜色强度的变化，实现草甘膦的可视化检测，具体涉及Fe3O4@C7纳米酶催化氧化2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS），在H2O2存在下，产生蓝绿色，草甘膦存在抑制了酶的催化氧化反应，颜色随草甘膦浓度增加而变浅，用智能手机拍照得到图像，通过测量生成的有色物质溶液颜色RGB值确定草甘膦含量，由此建立了草甘膦检测新方法，检出限为0.1mg/kg，反应仅在10分钟以内完成，体系稳定性超过30分钟，其他农药存在不干扰此反应，检测方法具有特异性；将本方法应用于样品中草甘膦的检测分析，结果与相关国家标准测定方法相符；方法具有操作简单、灵敏度高、快速等特点。
本发明建立快速检测草甘膦的方法如下：
（1）草甘膦工作曲线制作
在5mL具塞比色管中加入50~100µL Fe3O4@C7纳米粒子、浓度范围在10~100mg/L草甘膦标准溶液、10mM ABTS，40 mM H2O2，用pH 2.0醋酸-醋酸钠缓冲液稀释至4mL，于室温下放置5-10 min，用磁铁分离Fe3O4@C7纳米粒子，溶液倒入1 cm比色皿中，将其放置在自制的智能手机可见光光谱分析装置内，拍照采集图片，利用图像处理软件Adobe photoshop CC2015.5处理，读取手机拍摄图像的RGB值，将其转化为灰度值Gr，建立灰度值与草甘膦浓度的定量关系，绘制标准曲线，得到回归方程；
（2）样品测定
草甘膦的提取
准确的称取试样1.00 g（精确至0.01 g）置于50 mL具塞聚乙烯离心管中，加入1 M的 NaOH 1 mL和去离子水30 mL，超声处理15 - 30min，8000 rpm离心5 min，上清液移于另一离心管中，即得黄色提取液，待净化。
净化
该净化过程经两位次沉淀处理，具体步骤为：取上述提取液2 mL，加入0.33 M硝酸铝300 μL，混合均匀，加入1 M的 NaOH 300 μL，溶液变浑浊并有沉淀生成，涡旋30-60秒，4000 rpm离心5 min之后，下层为黄色沉淀物质，上层溶液澄清透明，将上清液移于另一离心管中；加入去离子水1 mL至黄色沉淀中，并加入1 M的HCl 300 μL，涡旋30-60秒至沉淀溶解，再加入1 M的 NaOH 300 μL，涡旋30-60秒，4000 rpm离心5 min之后，下层为黄色沉淀物质，上层溶液澄清透明，取上清液与第一次处理上清液合并，为样品净化液。
样品中草甘膦测定
在5mL具塞比色管中加入50~100µL Fe3O4@C7纳米粒子、样品净化液、10mM ABTS，40mM H2O2，用pH 2.0醋酸-醋酸钠缓冲液稀释至4mL，于室温下放置5-10 min，用磁铁分离Fe3O4@C7纳米粒子，溶液倒入1 cm比色皿中，将其放置在自制的智能手机可见光光谱分析装置内，拍照采集图片，利用图像处理软件Image J读取手机拍摄图像的RGB值，将其转化为灰度值Gr，代入步骤（1）回归方程，计算样品草甘膦含量。
Fe3O4@C7制备方法包括以下步骤：称取2.05 g硫酸亚铁铵和1.41 g三氯化铁溶于50 mL去离子水中，将混合液转移至250 mL三口烧瓶中，氮气保护下机械搅拌并水浴加热，当反应液加热至80℃时，加入5 mL含有100 mg庚酸的乙腈溶液。混合液剧烈搅拌5 min后，加入5 mL氨水（w/v，28%），接着再缓慢加入1g庚酸。最后，反应液在80 ℃搅拌30 min后，冷却至室温。所得悬浮液经甲醇沉淀后用钕铁硼（Nd-Fe-B）强磁性磁铁收集，并用去离子水/甲醇洗涤4-6遍以除去过量的庚酸，最后将制得的庚酸包覆的Fe3O4置于60 ℃真空干燥12h。
灰度值通过以下公式进行转换：Gr=0.299 R+0.587 G+0.114 B。
自制的智能手机可见光光谱分析装置为一纸盒或木盒，其内部用白纸做内衬，底部有一比色皿固定槽，正面尺寸与手机大小一致，拍照时开启闪光灯模式作为光源，摄像头对准比色皿溶液进行拍照。
检测样品包括茶叶、烟草、土壤、环境水样。
本发明的优点在于：
1、本发明利用庚酸包覆四氧化三铁（Fe3O4@C7）拟过氧化物酶模拟催化活性，在H2O2存在下，催化氧化2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS），产生蓝绿色，草甘膦存在抑制了酶的催化氧化反应，颜色随草甘膦浓度增加而变浅，用智能手机进行比色检测，实现了草甘膦快速、可靠、简便检测，检出限为0. 1mg/kg。
2、本发明建立的检测方法检测时间不超过10分钟，体系稳定性超过30分钟，其他农药存在不干扰此反应，检测方法具有特异性。
3、在用于烟草样品测定时，由于基体干扰，本发明采用了共沉淀法进行两次净化处理，降低了干扰，提高了回收率，经处理后的样品加标回收率达92.6-98.5%，同时该方法精密度和准确度良好，测定结果与国标法大致相同，且与国标法相比，该方法成本低廉、操作简单、用手机即可完成检测，在现场监测和应急监测领域中有一定应用前景。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细地描述说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：茶叶样品中草甘膦的测定
（1）Fe3O4@C7制备：称取2.05 g硫酸亚铁铵和1.41 g三氯化铁溶于50 mL去离子水中，将混合液转移至250 mL三口烧瓶中，氮气保护下机械搅拌并水浴加热，当反应液加热至80℃时，加入5 mL含有100 mg庚酸的乙腈溶液。混合液剧烈搅拌5 min后，加入5 mL氨水（w/v，28%），接着再缓慢加入1g庚酸。最后，反应液在80 ℃搅拌30 min后，冷却至室温。所得悬浮液经甲醇沉淀后用钕铁硼（Nd-Fe-B）强磁性磁铁收集，并用去离子水/甲醇洗涤4-6遍以除去过量的庚酸，最后将制得的庚酸包覆的Fe3O4置于60 ℃真空干燥12 h。
（2）草甘膦工作曲线制作：在5mL具塞比色管中加入100µL Fe3O4@C7纳米粒子、浓度范围在10~100mg/L草甘膦标准溶液、10mM ABTS，40 mM H2O2，用pH 2.0醋酸-醋酸钠缓冲液稀释至4mL，于室温下放置5-10 min，用磁铁分离Fe3O4@C7纳米粒子，溶液倒入1 cm比色皿中，将其放置在自制的智能手机可见光光谱分析装置内，拍照采集图片，利用图像处理软件Adobe photoshop CC 2015.5处理，读取手机拍摄图像的RGB值，将其转化为灰度值Gr，建立灰度值与草甘膦浓度的定量关系，得到回归方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围等见表1。
表1线性方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围
；
（3）茶叶样品中草甘膦的测定
草甘膦的提取
准确的称取茶叶试样1.00 g（精确至0.01 g）置于50 mL具塞聚乙烯离心管中，加入1 M的 NaOH 1 mL和去离子水30 mL，超声处理15 - 30min，8000 rpm离心5 min，上清液移于另一离心管中，即得黄色提取液，待净化。
净化
该净化过程经两位次沉淀处理，具体步骤为：取上述提取液2 mL，加入0.33 M硝酸铝300 μL，混合均匀，加入1 M的 NaOH 300 μL，溶液变浑浊并有沉淀生成，涡旋30-60秒，4000 rpm离心5 min之后，下层为黄色沉淀物质，上层溶液澄清透明，将上清液移于另一离心管中；加入去离子水1 mL至黄色沉淀中，并加入1 M的HCl 300 μL，涡旋30-60秒至沉淀溶解，再加入1 M的 NaOH 300 μL，涡旋30-60秒，4000 rpm离心5 min之后，下层为黄色沉淀物质，上层溶液澄清透明，取上清液与第一次处理上清液合并，为样品净化液。
茶叶样品中草甘膦测定：在5mL具塞比色管中加入50~100µL Fe3O4@C7纳米粒子、样品净化液2 mL、10mM ABTS，40 mM H2O2，用pH 2.0醋酸-醋酸钠缓冲液稀释至4mL，于室温下放置5-10 min，用磁铁分离Fe3O4@C7纳米粒子，溶液倒入1 cm比色皿中，将其放置在自制的智能手机可见光光谱分析装置内，拍照采集图片，利用图像处理软件Image J读取手机拍摄图像的RGB值，将其转化为灰度值Gr，代入步骤（1）回归方程，样品草甘膦未检出。
（4）回收率与精密度实验：在茶叶样品中分别添加3个不同浓度的草甘膦标准溶液；每个浓度平行测定3次，计算加标回收率，并计算出相对标准偏差RSD，结果见表2；测得草甘膦的加标回收率在97.5％～102.1％，RSD在1.11％～2.25％，本方法有好的的准确性和精密度。
表2 样品草甘膦加标回收率及RSD（n = 3）
。
实施例2：烟草样品中草甘膦含量的测定
（1）Fe3O4@C7制备：同实施例1；
（2）草甘膦工作曲线制作：同实施例1；
（3）烟草样品中草甘膦含量的测定
草甘膦的提取：同实施例1；
净化：同实施例1；
样品中草甘膦测定：样品草甘膦含量为2.1 mg/kg。
实施例3：土壤样品中草甘膦含量的测定
（1）Fe3O4@C7制备：同实施例1；
（2）草甘膦工作曲线制作：同实施例1；
（3）土壤样品中草甘膦含量的测定
草甘膦的提取：同实施例1；
净化：同实施例1；
样品中草甘膦测定：样品草甘膦未检出。
实施例4：环境水样中草甘膦含量的测定
（1）Fe3O4@C7制备：同实施例1；
（2）草甘膦工作曲线制作：同实施例1；
（3）环境水样中草甘膦含量的测定，该样品不需要提取与净化，直接按测定实施例1
样品中草甘膦测定，样品未检出。
将本发明建立的方法与GC-MS方法进行比对，检测误差在±3%以内，检测结果一致性较好，但本发明所用时间短，成本低，操作简便，不需要大型仪器设备，只需配备一部智能手机，即可完成，在实际检测中具有较强优势。
