一种非洲猪瘟病毒抗体的血清学检测方法
技术领域
本发明涉及生物
技术领域
，尤其涉及病毒检测技术领域
。背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus, ASFV)引起猪的一种急性、烈性和高度传染性疾病，目前尚未有商品化预防用疫苗和有效的治疗性药物。非洲猪瘟病毒属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，是该属目前的唯一成员。ASFV主要感染家猪、野猪，临床症状与经典猪瘟(Classical swine fever,CSF)相似，以持续性发热为主，猪只表现为食欲减退或消失，呼吸困难。猪只感染ASFV后通常会急性死亡，死亡率高达100％。2016年至2020年，全球共发生14327起ASF疫情，损失820万头猪。据不完全统计，自2018年疫情在我国爆发以来，国内报道的ASF疫情已达188起，扑杀生猪超过120万头，给我国养猪业造成了严重的损失。如今ASF严重威胁到了我国乃至世界的猪肉生产和粮食安全，是世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties,OIE)高度关注与持续监控的传染病，中国将其列为一类动物疫病。
ASFV是目前唯一发现的通过节肢动物作为媒介传播的一种双链核质大DNA病毒(nucleocytoplasmic large DNA viruses,NCLDV)。其病毒粒子呈正20面体的多层结构，由内到外分别是核仁、蛋白质核壳、脂质包膜以及最外层的蛋白质衣壳。通过冷冻电子显微镜对ASFV进行结构分析，表明ASFV粒子直径在260-300纳米之间，其蛋白质外壳由主要衣壳蛋白(p72)和四种次要衣壳蛋白(M1249,P17,P49和H240R)构成。ASFV基因组长度约为170-190Kbp，可以编码151-167个开放阅读框(Opening Reading Frames，ORF)。
常用的非洲猪瘟病毒的检测方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、血清中和试验、免疫荧光技术、聚合酶链式反应(PCR)、核酸探针和基因芯片等。这些方法具有很好的特异性、灵敏性和高效性，但其费用相对高，设备要求也较高，不利于基层和临床推广。
血清学方法是流行病学监测的重要内容和防控策略制定的重要依据，特别是对ASF耐过猪、ASF弱毒株感染猪(临床症状轻微，不易被发现)的检测具有重要意义，同时一旦商品化的ASF疫苗投入市场，还会成为免疫监测的强有力手段。同时免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidasemonolayerassay，IPMA)具有快速、敏感、特异的特点。在光学显微镜下即可观察并判定结果。另外，IPMA反应板可提前制备，4℃长期保存；IPMA的反应结果可长期保存，便于观察和分析。
我国生猪饲养大致分为散养和规模化养殖两种类型，它们在饲养管理、实验室检测能力和防疫水平上存在差异。对于散养的农户和饲养管理水平较低的中小企业来讲，疫病防控体系往往不健全，检测设备也相对落后或匮乏，因此在非洲猪瘟疫病传播期间，IPMA检测方法是一种不错的选择。
但是IPMA检测对于抗原的安全性要求，是我国非洲猪瘟病毒流行分离株(PIG/HLJ/18) 所不能满足的，其次针对ASF耐过猪、ASF弱毒株感染猪，抗体反应不明显，这时会影响IPMA 的检出率。国外ASF-IPT(ASF-IPMA)检测方法中采用的病毒是ASF细胞适应株，采用的细胞为MS或Vero细胞，适应后的毒株突变较多，可能存在未知的抗原性变化。
因此，构建与遴选出安全有效的非洲猪瘟减毒株是非洲猪瘟IPMA方法建立的基础，同时进一步提高抗原抗体反应结果的呈现度将进一步提高IPMA检测结果的准确性。
发明内容
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步志高首席的重要人兽共患与烈性外来病团队通过对我国非洲猪瘟病毒流行分离株(PIG/HLJ/18)进行了部分基因敲除，构建与遴选出安全有效的非洲猪瘟减毒株(HLJ/18-7GD)，为非洲猪瘟IPMA方法的建立奠定了基础。同时遴选出PK15细胞作为非洲猪瘟减毒株(HLJ/18-7GD)的接种细胞，获得了形态均一、着色特异的感染细胞，降低了IPMA的结果误判率。
在以上科学发现的基础上，完成了本发明。
首先，本发明提供一种非洲猪瘟血清抗体IPMA检测试剂，所述检测试剂中非洲猪瘟病毒为非洲猪瘟减毒株(HLJ/18-7GD)(保藏号：CCTCC NO：V201925和CCTCC NO：V201924。)。
进一步，所述检测试剂中以PK15细胞作为非洲猪瘟减毒株(HLJ/18-7GD)的接种细胞。
其次，本发明提供一种非洲猪瘟血清抗体IPMA检测试剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1、种毒的选择：选择以非洲猪瘟减毒株(HLJ/18-7GD株)作为种毒；
2、反应板的制备：在细胞板中培养PK15细胞，待细胞密度为80-90％时将培养液弃去，接种HLJ/18-7GD毒株，置于培养箱中培养，制得反应板。
3、结果的观察：采用1:10—1:50的稀释倍数孵育ASFV高免猪阳性血清，1:1000-1:5000 的比例稀释抗猪二抗并进行孵育，用显色液显色后，于普通光学显微镜下观察显色结果。
进一步，优选病毒感染剂量为5×106TCID50/mL-2×107TCID50/mL，更优选为 1×107TCID50/mL。优选病毒复制时间为60h-80h时，更优选为72h。
进一步，血清稀释倍数为1:80-1:160，更优选血清稀释倍数为1:100。
进一步，二抗稀释度为1：1000-1：2000倍稀释，更优选1:2000倍稀释。
本发明的非洲猪瘟血清抗体IPMA检测试剂以HLJ/18-7GD病毒为种毒，以PK15细胞为感染细胞，染色后，感染HLJ/18-7GD病毒细胞均着色均匀，形态均一，均为小而规则的深玫瑰红色圆形着色，阴性对照细胞孔背景干净，无非特异性着色。
检测用抗原是感染细胞的全病毒，所以检测出的抗体能够较真实地体现抗体本身或接近抗体本身的血清反应，因此在非洲猪瘟缺乏针对所有毒株有效中和抗体的条件下，IPMA具备成为ASF血清学检测“金标准”的潜在价值。在检测的敏感性上比ELISA更高，在特异性和检测时间上与ELISA检测相当，但对仪器设备要求较低，只需借助普通光学显微镜进行观察和判定，同时，IPMA检测结果可长期保存，便于后期实验结果整理与档案调取。
附图说明
：图1：rASFV△360和HLJ/18-7GD感染PK15与Vero细胞荧光与IPMA结果(箭头与圆圈所示位置为Vero细胞染色后部分细胞着色较浅，容易被视为无着色而造成误判)
图2：不同剂量HLJ/18-7GD病毒感染PK15细胞后不同时间荧光结果(箭头与圆圈所示位置为形成的良好荧光克隆灶)
图3：ASFV阳性血清与病毒感染细胞呈玫瑰红色阴性血清与细胞对照无着色
具体实施方式
通过以下实施例，来进一步示例性说明本发明的非洲猪瘟血清抗体IPMA检测试剂的显著效果以及制备方法。
实施例1：材料与方法
1.1种毒和血清安全有效的7基因缺失非洲猪瘟减毒株(HLJ/18-7GD株，同时表达红色和绿色荧光蛋白)、MGF360-505R缺失的非洲猪瘟减毒株(rASFV△360株，表达绿色荧光蛋白)减毒株，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所制备、鉴定和保存。
1.2细胞非洲绿猴肾(African green monkey kidney,Vero)细胞、猪肾(PorcineKidney,PK15) 细胞，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究保存。
1.3培养基Vero细胞的培养液为含有10％FBS的DMEM；PK15细胞的培养液为含有5％FBS的DMEM。
1.4主要材料与试剂AEC显色液购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司；HRP标记的鼠抗猪IgG(H+L)二抗购自福因德(Frdbio)科技(武汉)有限公司；MEM液体培养基购自Hyclone(GE)公司；8％多聚甲醛购自白鲨生物科技(Biosharp Life Sciences)有限公司；选择性稳定剂购自英国苏莫迪奇(Surmodics)公司；ASF-P30-iELISA抗体检测试剂盒购自洛阳普泰生物技术有限公司；ASF-VP72-阻断ELISA抗体检测试剂盒购自Ingenasa公司；ASF-P54-i-ELISA抗体检测试剂盒购自荷兰百测(Biochek)公司。
1.5毒株与细胞的筛选选择PK15和Vero两种备选细胞用5％DMEM培养液培养至细胞长满整个单层后，用胰酶消化，以1:5的比例将细胞铺于96孔细胞板，待细胞密度为80-90％时将培养液弃去，将rASFV△360与HLJ/18-7GD两种ASFV毒株用2％DMEM稀释至病毒含量为3×107或3×106TCID50/mL接种于细胞(rASFV△360感染能力强，以病毒含量为3×106TCID50/mL接种；HLJ/18-7GD感染能力较弱，以病毒含量为3×107TCID50/mL接种)，置于 37℃CO2培养箱中培养72小时，将rASFV△360接种的细胞置于倒置荧光显微镜绿色荧光、 HLJ/18-7GD接种的细胞置于红色荧光下观察结果。接种后的细胞与不接毒的空细胞对照板一起于37℃CO2培养箱中培养72小时后，进行反应板的制备，采用1:50的稀释倍数孵育 ASFV高免猪阳性血清，1:2000的比例稀释抗猪二抗并进行孵育，用30ul显色液37℃显色 30min后，于普通光学显微镜下观察显色结果。
1.6病毒感染剂量与复制时间的确定以病毒含量为3×107、1×107、3×106TCID50/mL三个感染梯度的HLJ/18-7GD接种细胞，置于37℃CO2培养，分别在24h、48h、72h三个感染时间于倒置荧光显微镜下进行观察。
1.7IPMA反应板的制备与保存接种后的PK15细胞与不接毒的空细胞对照板一起于37℃ CO2培养箱中培养72小时，弃去培养液，以96孔板每孔100ul的体积加入4％多聚甲醛组织固定液。PBST洗板5次后加入0.04％Triton-X100透膜液静置透膜15min，继续洗板5次，鱼皮胶封闭液于37℃温箱封闭2h。封闭完成后弃去封闭液，晾干反应板后置于4℃封闭保存。
1.8二抗稀释度的确定将ASFV标准阳性血清与标准阴性血清按照0、1:100、1:300、1:1000 四个浓度梯度进行稀释每个浓度孵育为一列(1、2、3、4)；二抗用二抗保存液以1:1000、 1:2000、1:4000、1:8000四个浓度梯度进行稀释，每个浓度孵育为一行(A、B、C、D)以此来进行标准阳性血清与标准阴性血清与二抗稀释度的棋盘试验，AEC显色后于普通光学显微镜下观察阳性细胞着色深浅情况、非特异性着色与背景着色深浅，通过标准阴性、标准阳性血清的着色情况判断二抗最终稀释倍数。
1.9血清稀释度的确定选取两个不同地区采样的、溶血程度不同的、日龄大小不一的26 份已知阴性血清与四份弱阳性血清进行血清稀释倍数的确定。将30份血清以0、1:10、1:20、 1:40、1:80、1:160四个浓度进行梯度稀释，标准阳性血清与标准阴性血清进行1:100倍稀释；将抗猪二抗用二抗保存液以1:2000进行稀释，以此来进行血清稀释倍数确定试验，AEC 显色后于普通光学显微镜下观察细胞的非特异性着色与背景着色深浅，通过30份血清的着色情况判断血清最终稀释倍数。
1.10特异性试验选用中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存的猪瘟病毒(CSFV)、蓝耳病病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PPRSV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus,PCV2)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、猪口蹄疫病毒(Porcine foot-and-mouth disease virus,FMDV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine Delta Coronavirus,PDCoV)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PrV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒 (Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)11种猪只常见病毒的标准阳性血清，以及猪ASFV标准阴性血清、猪ASFV高免阳性血清共13 份血清样品，进行特异性试验，其中待检样品与ASFV高免阳性血清、ASFV标准阴性血清均采用1:100的比例进行稀释，抗猪二抗采用1:2000的比例进行稀释。AEC显色后与普通光学显微镜下观察实验结果。
1.11与现有ASFV-ELISA试剂盒符合率比较选取哈尔滨兽医研究所保存的68份临床试验猪血清(其中36份为免疫后一个月血清)、41份临床样品共计109份猪血清。选取ASFV-ELISA抗体检测试剂盒(针对P30蛋白)、Biochek公司ASFV-ELISA检测试剂盒(针对P54蛋白)、INGENASE公司ASFV阻断ELISA抗体检测试剂盒(针对VP72蛋白)，共三种ASFV诊断试剂盒，与ASF-IPMA方法同时进行血清学检测。分析ASF-IPMA与三种 ASFV-ELISA试剂盒的试验结果，并进行ASF-IPMA与各试剂盒的符合率结果比较。
实施例2：实验结果
1.12毒株和细胞的筛选PK15细胞AEC染色后，感染rASFV△360和HLJ/18-7GD病毒细胞均着色均匀，形态均一，均为小而规则的深玫瑰红色圆形着色，阴性对照细胞孔背景干净，无非特异性着色。Vero细胞AEC染色后感染rASFV△360和HLJ/18-7GD病毒的细胞着色均不均匀，形态大小不一，感染时间长的细胞圆缩后着色较深；后感染的细胞因病毒粒子含量少，对细胞的损伤小因此形态良好，呈不规则梭型，着色较浅，干扰观察和判断，着色较浅的细胞有被误判为背景着色的可能性；阴性对照细胞AEC显色后背景干净，无非特异性着色，因此，在保证细胞感染率和AEC显色后细胞着色情况不受影响的前提下选用安全性更强的HLJ/18-7GD病毒作为最终接种抗原；同时选用细胞形态与着色更为一致的PK15细胞作为抗原接种细胞。如图1所示。
1.13感染剂量与复制时间优化选用病毒含量为3×107、1×107、3×106TCID50/mL三个感染梯度感染细胞，并于24h、48h、72h三个感染时间观察结果，由于三个感染剂量的PK15细胞均在感染72小时之后细胞状态开始变差，易脱落，因此未继续培养至96h。结果显示，在病毒感染剂量为1×107TCID50/mL以及病毒复制时间为72h时，荧光灶含量适中，且病毒开始扩散，出现明显克隆灶。综上，选择72h便于进行下一步的IPMA试验。如图2所示。
1.14二抗稀释度的确定将ASFV标准阳性与标准阴性血清用血清稀释液以0、1:100、1:300、 1:1000四个浓度进行稀释，同时将抗猪二抗用二抗保存液以0、1:1000、1:2000、1:4000、 1:8000五个浓度进行稀释，进行ASF-IPMA的二抗稀释度确定试验，结果显示ASFV标准阳性血清在1:100倍稀释，抗猪二抗在稀释度在4000倍及以上时细胞着色稍浅，相较于此，二抗稀释度在1000倍、2000倍稀释时细胞着色更深，观察效果更好。但抗猪二抗1:1000 倍稀释时细胞反应孔有背景着色，会影响观察与判定，因此将抗猪二抗稀释范围定为1:2000 倍稀释。如表1所示。
表1：血清与二抗稀释度的棋盘试验
注：“－”为细胞无显色反应；
“++++”为细胞有显色反应，且着色为深玫瑰红色偏深棕色；
“+++”为细胞有显色反应，且着色为较深的玫瑰红色；
“++”为细胞有显色反应，且着色为玫瑰红色；“+”为细胞有显色反应，且着色为浅玫瑰红色；
“*”为该稀释度有背景色，会影响观察
1.15血清稀释度的确定选取26份阴性血清(SPF未免疫猪血清)与4份弱阳性血清(OD 值为0.56、0.81、0.97、0.73)分别按照1:10、1:20、1:40、1:80、1:160进行梯度稀释。当血清采用1:80倍稀释时，阴性血清检测均为阴性，4份弱阳性血清均可被检测为阳性，四份血清中1份有影响观察的背景着色；30份血清中3份血清有会影响判断的背景色。当血清采用1:160倍稀释时，阴性血清检测均为阴性，4份弱阳性血清均可被检测为阳性，且30 份血清均无会影响结果判断的背景色，最终选用介于1:80-1:160之间的1:100倍作为血清的最终稀释倍数，如表2所示。ASF-IPMA试验中血清稀释度最终定为1:100倍，抗猪二抗稀释度最终定为1:2000，如图3所示。
表2ASF-IPMA血清稀释度试验
注：a：“－”表示该稀释度下无细胞着色，呈阴性反应；
b:“√”表示该稀释度下细胞孔无背景色；
c：“+”表示该稀释度下有细胞着色，呈阳性反应；
d：“×”表示该稀释度下细胞孔有背景色，且影响结果判断
1.16特异性试验将制备好的细胞反应板与中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存的猪只常见病毒的阳性血清进行反应(包括PPRSV、PrV、SIV、PCV2、FMDV、TGEV、CSFV、BVDV、PDCoV、PPV)，同时采用ASF猪标准阳性和猪阴性血清进行对照，检测IPMA反应板的特异性。结果显示上述病毒阳性血清检测均为阴性，证明ASF-IPMA特异性良好。如表3所示。
表3ASF-IPMA特异性试验
注：“+”表示阳性，“－”表示阴性
1.17符合率比较试验分别采用ASF-P30-iELISA抗体检测试剂盒、Biochek公司ASF-P54-iELISA检测试剂盒、INGENASE公司ASF-VP72-阻断ELISA抗体检测试剂盒与本研究制备的ASF-IPMA细胞反应板对实验室获取的109份猪源血清进行抗体检测试验，实验结果显示ASF-IPMA与P30蛋白iELISA检测试剂盒相比，符合率为99.08％，与P54蛋白iELISA检测试剂盒相比符合率为98.17％，与阻断性ELISA检测试剂盒(VP72蛋白)相比符合率为100％。表明ASF-IPMA试剂盒检测结果与三种ELISA检测试剂盒均有很高的符合率，符合率均达到98％以上，如表4所示。
表4ASF-IPMA与3种ELISA检测试剂盒比较
注：符合率＝(两种检测方法同时检出的阳性样本数+两种检测方法同时检出的阴性样本数)/样本总数
由上述实验可见，本发明使用在我国流行的、基因缺失的非洲猪瘟弱毒，适合我国的流行情况，既具备良好的安全性，也具备良好的天然免疫原性。本发明比较了rASFV△360和 HLJ/18-7GD两个基因缺失减毒毒株，虽然rASFV△360感染Vero和PK15的能力比HLJ/18-7GD 高约10倍，但在IPMA检测中，显色后两者无明显差别。由于rASFV△360仍然在猪体内连续传代后发生毒力返强，因此HLJ/18-7GD毒株安全性更高。
对于被感染细胞，Vero细胞是ASFV用来驯化和适应的常用细胞系，但我们在研究中发现PK15也可以较好地感染ASFV病毒，其贴壁性强不易脱落，细胞生长更快，培养需要的血清含量比Vero低，可降低成本，本研究对两种细胞进行比较。结果显示，Vero细胞着色与PK15细胞相比，感染细胞着色深浅不均，大小不一，着色较浅和较大的细胞容易与背景着色连成一片，不易区分；而PK15细胞由于细胞体积小，着色细胞颜色更均匀、大小均一，更易观察，并可以有效降低误判的情况。
在此基础上本研究进行了病原感染剂量、感染时间、血清稀释度与二抗稀释度的进一步优化实验，确定了着色良好，检测方法敏感的检测试剂的参数。
本研究通过将IPMA方法与三种ELISA试剂盒(针对P54蛋白的iELISA方法、针对P30蛋白的iELISA和针对VP72的阻断ELISA)进行了对比。结果显示ASF-IPMA与P54-iELISA 方法、P30-iELISA方法(针对P30蛋白)和VP72阻断ELISA方法(针对VP72蛋白)的符合率均在98％以上，说明ASF-IPMA方法表现出良好的检测性能(特异性、敏感性)，其结果稳定可靠。
