一种s形光纤锥免疫传感器、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于光纤生物传感器领域，具体涉及一种S形光纤锥免疫传感器、制备方法及其应用。
背景技术
肿瘤标志物检测是恶性肿瘤疾病诊断过程中不可或缺的一项操作，可以提高肿瘤疾病诊断的准确性。癌胚抗原作为常见的肿瘤标志物之一，在许多人类癌症中过表达，并在恶性肿瘤的鉴别诊断、疗效评价以及病情监测等方面具有十分重要的临床价值。光纤生物传感技术是一种将光纤传感技术与生物特异性识别技术相融合而得到的多学科交叉的光学检测技术，可用于生化分子检测领域。作为一种常用的光纤结构，基于光纤模间干涉原理的传感器件近年来得到了广泛的研究与应用。光纤生物传感器因其具有体积小、灵敏度高、免标记、可在线、生物兼容性好、抗电磁干扰等特点，可应用于免疫检测、基因诊断、癌症筛查、药物研发、环境监测、食品安全等生物化学检测领域。光纤生物传感器的工作原理为：通过对光纤的表面进行功能化修饰与处理，绑定探针生物分子，使光纤生物传感器具有特异性识别的能力，从而能够实现对特定生物分子的低浓度特异性检测。
目前，研究较热门的光纤生物传感器有长周期光纤光栅生物传感、光纤布拉格光栅生物传感器，倾斜光纤光栅生物传感器和D型光纤生物传感。目前为止，其中光纤免疫传感器中用到的生物敏感材料多数为单纯的氧化石墨烯或金纳米粒子等，生物探针分子多数为传统的单克隆抗体。虽然上述几种光纤生物传感器结构比较简单，易操作，但是其折射率灵敏度、特异性等并不高。为了提高光纤生物传感器的灵敏度、特异性以及使器件更加小型化，许多新的微结构光纤及敏化材料不断被提出，他们在生物医疗诊断、食品监测、药物研发、环境监测等领域已凸显了潜在的应用价值。S形光纤锥结构是一种马赫-曾德尔模间干涉结构，制作简单、鲁棒性强、灵敏度高，基于该结构的光纤生物传感器在生物分子的检测方面具有较大的研究潜力。氧化石墨烯与金纳米粒子均具有较高的稳定性、比表面积、光学性能、生物亲和性，将二者结合可以用作较好的敏化材料。随着抗体技术的不断发展，人们已研究出与传统抗体相比体积小、亲和力更高、特异性更强的纳米抗体。另外，纳米抗体还具有稳定、制备简单、周期短、耐酸碱等特性。因此，纳米抗体更适合作为探针分子用于生物传感器以提高生物传感器的特异性、灵敏度及稳定性等特性。因此，开发一种结构紧凑、制作简单、灵敏度及特异性高、稳定性好的光纤免疫传感器具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明目的是：提供一种氧化石墨烯/金纳米粒子复合膜功能化的S形光纤锥免疫传感器的制备方法及应用。首先利用熔接机制备S形光纤锥作为传感平台，可以提高对环境折射率响应的灵敏度；然后将氧化石墨烯和金纳米粒子分别自组装至S形光纤锥表面用作复合生物敏感膜，其中氧化石墨烯是片状结构，因其具有较大的比表面积、光学透过性和生物亲和性，可以与光纤表面充分连接，起到了加大生物传感支撑面和方便后续生化分子连接的作用，金纳米粒子是类似椭圆球状的结构因其具有较大的比表面积、优于氧化石墨烯的生物亲和性，既可以与氧化石墨烯结合又可以与纳米抗体牢固结合，起到了生物连接及信号放大的作用，因此将这两种材料结合制备成复合敏感膜的特性优于单个成分组成的敏感膜；最后再连接体积小、亲和力高、特异性强的纳米抗体以实现对癌胚抗原的特异性识别与结合，起到了提高抗原检测特异性、稳定性和灵敏度的作用。因此，利用上述方法制备光学免疫传感器，其制备工艺简单、成本低、周期短，且该免疫传感器极大的提高了灵敏度、特异性和稳定性，并且响应快，可无标签在线检测。
本发明通过以下方案实现:
一种S形光纤锥免疫传感器的制备方法，具体步骤如下：
(1)、S形光纤锥的制备：
取一段30-60cm长的光纤，然后用光纤钳剥去中间2-4cm的涂覆层，最后用酒精棉沿着光纤轴向的同一方向将剥去涂覆层部分的光纤擦拭干净即完成光纤预处理；调整熔接机两端光纤夹具，使其在轴向错开100-250μm的距离，然后将预处理好的光纤平直地放置在熔接机的槽里，调整光纤的放置位置，使熔接机的放电电极正对着剥去涂覆层光纤的中间部位，最后用两端的光纤夹具将其固定；设置熔接机拉锥的放电时间和放电电流，分为两个阶段：第一阶段放电时间为7-15ms，放电电流为8-16mA；第二阶段放电时间为6-12ms，放电电流为6-10mA；最后按下熔接机上的“Fuse”按键，熔接机开始放电拉锥；
(2)、氧化石墨烯和金纳米粒子修饰S形光纤锥：
将步骤(1)中制备的S形光纤锥进行生物功能化，具体步骤如下：将S形光纤锥浸入丙酮静置10-60min，清洗干净后再浸入浓度为0.5-2M的NaOH水溶液中静置1-4h；然后用体积浓度为1％-10％的3-氨丙基三乙氧基硅烷-水溶液浸泡1-6h，清洗后在50℃-150℃条件下加热5-20min，接着用氧化石墨烯乙醇溶液浸泡1-6h；再用体积浓度为0.01-1％的3-巯丙基三乙氧基硅烷-苯溶液浸泡2-10h，最后再用胶体金溶液浸泡5-30h；
(3)、纳米抗体的绑定：
对步骤(2)中制备的氧化石墨烯/金纳米粒子功能化的S形光纤锥进一步修饰生物探针分子以实现对癌胚抗原特异性识别，步骤如下：将氧化石墨烯/金纳米粒子功能化的S形光纤锥浸入浓度为10-40mM的11-巯基十一烷酸乙醇溶液中静置10-60min；在浓度为10-40mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液中浸泡19-50min，随后在浓度为30-90mM N-羟基丁二酰亚胺的磷酸缓冲盐溶液中浸泡10-50min；浸入含0.1-3mg/mL纳米抗体的磷酸缓冲盐溶液中浸泡10-60min，然后浸入0.2-2mg/mL的牛血清白蛋白溶液中温育0.5-2h，再用磷酸缓冲盐溶液清洗以去除未结合的蛋白。
进一步地，步骤(1)中所用的光纤为单模光纤(SMF-28e)。
进一步地，所使用单模光纤的纤芯直径为9μm，包层直径为125μm，涂覆层直径为250μm。
进一步地，步骤(1)中所使用的光纤熔接机的型号为：爱立信FSU 995PM。
进一步地，步骤(1)中所制备的S形光纤锥结构，其锥腰直径为30-60μm，锥长为600-900μm。
进一步地，所使用氧化石墨烯溶液(NO:XF2241,Nanjing XFNANO)浓度为2mg/mL，氧化石墨烯纳米片直径大于500nm。
进一步地，所使用金纳米粒子是用柠檬酸还原法制备得到，其直径为10-60nm。
进一步地，所使用的纳米抗体为来源于羊驼的纳米抗体，对应检测的抗原是癌胚抗原蛋白。
本发明的另一目的在于提供了一种S形光纤锥免疫传感器在检测方面的应用。
与现有的光纤免疫传感器制备方法相比，本发明具有以下优点：
(1)、用S形光纤锥结构作为传感平台，其制备工艺简单，小巧，成本低，对环境折射率灵敏度高。
(2)、该光纤免疫传感器特异性强，灵敏度高，稳定性好，重复性好，在实际中有广泛的应用前景。
附图说明
图1：本发明的S形光纤锥免疫传感器的制备方法的实验装置示意图；
图2：本发明制备的S形光纤锥的光学显微镜图；
图3：本发明制备的生化分子修饰后的S形光纤锥表面扫描电镜光谱图；
图4：本发明制备的生化分子修饰后的S形光纤锥表面原子力显微镜光谱图；
图5：本发明制备的S形光纤锥免疫传感器的检测示意图；
图6：本发明制备的S形光纤锥免疫传感器检测癌胚抗原的透射光谱图；
图7：本发明制备的S形光纤锥免疫传感器的特异性检测分析图；
图8:本发明制备的S形光纤锥免疫传感器的重复性检测分析图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步详细的说明。
实施例1：
结合熔接机电弧放电技术和原位自组装技术制备基于单模光纤(SMF-28e)的氧化石墨烯/金纳米粒子功能化的S形光纤锥免疫传感器。该光学免疫传感器的制备工艺简单、成本低，特异性和灵敏度较高，具有广泛的应用前景。
S形光纤锥免疫传感器的具体制备步骤如下：
(1)、S形光纤锥的制备
具体制备步骤如下：①截取一段50cm长的单模光纤，其参数如下：纤芯直径为9μm，包层直径为125μm，涂覆层直径为250μm。然后用光纤钳在其中间部位剥去3cm的涂覆层，并用酒精棉沿着光纤轴向的同一方向将剥去涂覆层部分的光纤擦拭干净。②调整熔接机(爱立信FSU 995PM)两端光纤夹具，使其在轴向错开120μm的距离，再将步骤①中处理好的光纤平直地放置在熔接机的V形槽里，仔细调整光纤的放置位置，使熔接机的放电电极正对着剥去涂覆层光纤的中间部位，然后用两端的光纤夹具将其固定，使光纤处于自然平直状态。③设置熔接机拉锥的放电时间和放电电流，该拉锥过程一共分为两个阶段，每一阶段的放电时间和放电电流设置如下：放电时间1＝9ms，放电电流1＝10mA；放电时间2＝7ms，放电电流2＝10mA。最后按下熔接机上的“Fuse”按键，熔接机开始放电拉锥。放电时，电极放电区域温度瞬间可达2000℃左右，使电极附近的光纤呈熔融态，进而对其拉锥。所制备S形光纤锥的锥腰直径为46.8μm，锥长为859.3μm。
如图1所示，是制备S形光纤锥的实验装置示意图，具体的步骤如上所述。然后将制备好的S形光纤锥一端连接宽带光源(丹麦NKTPhotonics公司，Superk Compact)，另一端连接光谱分析仪(日本Yokogawa公司，AQ6370D)。宽带光源输出超连续光，经过S形光纤锥结构，进入光谱分析仪，由光谱分析仪对透射光谱进行实时的监测。图2是在单模光纤上制备的S形光纤锥的光学显微镜图，其锥腰直径为46.8μm，锥长为859.3μm。
(2)、氧化石墨烯和金纳米粒子修饰S形光纤锥；
对步骤(1)中所制备的S形光纤锥进行表面功能化，具体步骤如下：首先将S形光纤锥浸入丙酮中静置30min以去除有机杂质；清洗干净后再浸入1.0M的NaOH中静置2h；随后再用体积浓度为5％的3-氨丙基三乙氧基硅烷-水溶液将光纤锥浸泡3h，清洗后在95℃条件下加热10min，用氧化石墨烯溶液浸泡4h；接着再用体积浓度为0.1％的3-巯丙基三乙氧基硅烷-苯溶液浸泡6h，最后再在胶体金溶液内浸泡24h。即完成S形光纤锥表面的功能化。
(3)、纳米抗体的绑定；
将步骤(2)中表面功能化的S形光纤锥进一步绑定纳米抗体探针分子以实现对癌胚抗原的特异性结合，具体步骤如下：①浸入20mM的11-巯基十一烷酸-乙醇溶液中静置30min；②在25mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液(0.1M pH＝5.6,含0.9％NaCl)中浸泡20min，随后转移至60mM N-羟基丁二酰亚胺的磷酸缓冲盐溶液(0.1M磷酸缓冲盐溶液,pH＝7.4)中浸泡20min；③浸入含1mg/mL纳米抗体的磷酸缓冲盐溶液中浸泡20min，然后再浸入1mg/mL牛血清白蛋白溶液中温育1h以封闭多余结合位点，最后再用磷酸缓冲盐溶液洗涤以去除未结合的蛋白。
图3是所制备S形光纤锥免疫传感器表面扫描电镜光谱图。可以看到修饰氧化石墨烯、金纳米粒子和纳米抗体后凹凸不平的面貌。图4是所制备S形光纤锥免疫传感器表面原子力显微镜光谱图。可以更清晰地看出基于椭圆形金纳米粒子的表面形貌结构。由此可知上述纳米材料成功组装至S形光纤锥表面。
实施例2：癌胚抗原检测
步骤(1)→(3)同实施例1
步骤(4)、将S形光纤锥结构的一端连接宽带光源(丹麦NKTPhotonics公司，SuperkCompact)，另一端连接光谱分析仪(日本Yokogawa公司，AQ6370D)，并设置光谱分析仪的分辨率为0.02nm，波长扫描范围为1000nm-1700nm。其中宽带光源输出超连续光，光谱分析仪对抗原检测时的透射光谱进行实时监测。癌胚抗原浓度分别设置为0nM、0.2nM、0.4nM、0.6nM、0.8nM、1.0nM、1.2nM和1.4nM，检测时浓度由低到高检测。
图5是S形光纤锥免疫传感器检测示意图。
图6是所制备S形光纤锥免疫传感器的透射光谱图。在1000nm-1700nm的波长范围内，透射谱中存在多个干涉峰，在癌胚抗原检测实验中，选取其中一个峰监测其光谱的变化。从图中可以发现，抗原浓度从0.0nM增加至1.4nM时，透射光谱向长波方向移动，发生“红移”，共移动了33.6nm，经过线性拟合，得到对癌胚抗原检测的灵敏度为24nm/nM及最低检测线为0.015nM。可得出，本发明制备的S形光纤锥免疫传感器在对癌胚抗原的检测实验中抗原浓度和光谱漂移距离呈线性相关，且具有较高的灵敏度和较低的检测限。
实施例3：特异性检测及重复性检测
首先对S形光纤锥免疫传感器的特异性检测进行验证，具体实验步骤如下：
步骤(1)→(3)同实施例2。
步骤(4)、将S形光纤锥结构的一端连接宽带光源(丹麦NKTPhotonics公司，SuperkCompact)，另一端连接光谱分析仪(日本Yokogawa公司，AQ6370D)，并设置光谱分析仪的分辨率为0.02nm，波长扫描范围为1000nm-1700nm。其中宽带光源输出超连续光，光谱分析仪对抗原检测时的透射光谱进行实时监测。将待检测分析物依次换成磷酸缓冲盐溶液、牛血清白蛋白、羊血清白蛋白观察光谱变化，以验证实施例2中的光谱漂移是由癌胚抗原特异性结合导致。
图7是对S形光纤锥免疫传感器的特异性检测验证实验结果，可以看出几种不相关的分析物没有导致输出光谱明显漂移。可知，实施例2中的光谱漂移是由癌胚抗原特异性结合纳米抗体导致。
然后对S形光纤锥免疫传感器的重复性进行验证，具体实验步骤如下：
按照上述方法重新制备了一个S形光纤锥免疫传感器以验证本发明的传感器的重复性。重复性检测步骤(1)→(4)同实施例2。
图8是重新制备的S形光纤锥免疫传感器对癌胚抗原检测的线性拟合图。由图可以看出，重新制备的S形光纤锥免疫传感器在对癌胚抗原的检测实验中抗原浓度和光谱漂移距离呈线性相关，效果如同本发明第一次制备的S形光纤锥免疫传感器。可知，本发明制备的S形光纤锥免疫传感器具有很好的重复性。
