一种灰霉病病原菌灰葡萄孢菌间接elisa检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物制品检测
技术领域
，具体涉及一种灰霉病病原菌灰葡萄孢菌间接ELISA检测试剂盒。背景技术
子囊菌门孢盘菌属真菌灰葡萄孢菌Botrytis cinerea是众多农作物贝母灰霉病的病原真菌之一。病菌以菌丝随病残组织遗落在土中越冬，第二年再次侵染贝母，每年给农业生产造成严重损失。而孢盘菌属真菌种类繁多，近缘种的菌落、菌丝和孢子形态相似，难以依靠病原菌的形态学特征加以区分。为应对灰葡萄孢菌危害大且鉴别难度高的问题，本发明建立了一种快速方便、灵敏度高、特异性强、适于田间大量样品检测的间接酶联免疫吸附(ELISA)法，通过早鉴定实现早防治，通过精确鉴定实现对症下药，为田间灰霉病的防治提供了切实可靠的依据。
发明内容
为了对灰霉病的早诊断和精确诊断，对灰霉病的防治提供依据，本发明提供了一种灰霉病病原菌灰葡萄孢菌间接ELISA检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种灰霉病病原菌灰葡萄孢菌间接ELISA检测试剂盒，该试剂盒包括：酶标板、10×样品包被液、10×PBST、脱脂奶粉、抗原标准溶液、10×灰葡萄孢菌单抗、10×酶标二抗、TMB底物液、终止液、研磨棒、离心管；所述灰葡萄孢菌单抗由一种杂交瘤细胞株分泌形成，该杂交瘤细胞株命名为BcE4，于2021年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC No：C2021116。
进一步地，所述样品包被液优选浓度为0.5mol/L的碳酸盐包被缓冲液。
进一步地，所述10×PBST的配置过程为准确称取NaCl 80.00g，KH2PO4 2.40g，Na2HPO4·12H2O 14.40g，KCl 2.00g，加超纯水800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.2，加入Tween-20 5.00mL，定容至1000mL。
进一步地，所述抗原标准溶液的配置过程具体为：挑取灰葡萄孢菌菌株接种于PDA培养基，25℃振荡培养4～5d后，6000rpm离心20min收集菌丝和孢子，并用PBS洗涤两次，冰浴条件下超声破碎至无明显沉淀，6000rpm离心20min，收集含有抗原的上清液，多功能酶标仪测定抗原蛋白含量，调整蛋白浓度为1mg/mL，得到抗原标准溶液。
与现有灰葡萄孢菌检测技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)ELISA试剂盒的特异性强：该ELISA试剂盒与灰葡萄孢菌抗原反应强，且不与链格孢菌、细极链格孢菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、木贼镰刀菌、半裸镰刀菌、茎点霉菌、拟茎点霉菌的抗原发生反应，可用于灰葡萄孢菌及其引发的灰霉病的检测。
(2)ELISA试剂盒的检测灵敏度高：检测结果表明，该试剂盒的检测单抗对灰葡萄孢菌菌丝及孢子制备的抗原的检测灵敏度为312.5ng/mL(即每孔31.25ng)，应用于间接ELISA检测试剂盒具有良好的检测效果。
(3)ELISA试剂盒中的单抗类型为Igκ和IgG2A。
(4)ELISA试剂盒中单抗结合的目标蛋白稳定：该单抗与灰葡萄孢菌约35kDa、47kDa的抗原蛋白结合。
附图说明
图1为试剂盒单抗的效价检测图；
图2为试剂盒单抗与不同真菌抗原的反应图；
图3为试剂盒单抗的检测灵敏度测定图；
图4为试剂盒单抗的类型及亚类鉴定图；
图5为试剂盒单抗结合的灰葡萄孢菌目标蛋白图；
具体实施方式
下面将结合附图和实例对本发明的具体实施方式和技术效果进行进一步的说明，但本发明的实施和保护范围并不仅限于此。
ELISA试剂盒内容物中主要溶液配制方法：
(1)10×样品包被液(即浓度为0.5mol/L，10×碳酸盐包被缓冲液，pH值为9.6)：准确称取Na2CO315.90 g，NaHCO3 29.3g，超纯水溶解，定容至1000mL；
(2)10×PBST：准确称取NaCl 80.00g，KH2PO4 2.40g，Na2HPO4·12H2O 14.40g，KCl2.00g，加超纯水800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.2，加入Tween-205.00mL，定容至1000mL；
(3)抗原标准溶液：挑取灰葡萄孢菌菌株接种于PDA培养基，25℃振荡培养4～5d后，6000rpm离心20min收集菌丝和孢子，并用PBS洗涤两次，冰浴条件下超声破碎(功率200W，破碎2s，间歇2s)至无明显沉淀，6000rpm离心20min，收集含有抗原的上清液，多功能酶标仪测定抗原蛋白含量，调整蛋白浓度为1mg/mL，以作为抗原标准溶液。
(4)10×灰葡萄孢菌单抗：自制的针对灰葡萄孢菌的单抗。由自制的一种杂交瘤细胞株分泌，该杂交瘤细胞株命名为BcE4，该杂交瘤细胞于2021年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中国武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC No：C2021116。
(5)10×酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(Biosharp公司)；
(6)TMB底物液：优选上海碧云天生物技术有限公司生产的TMB底物溶液，但不限于此。
(7)终止液：准确量取浓硫酸100mL，缓慢滴加到800mL超纯水。
本试剂盒储藏温度为4℃，有效期限为6个月。
基于上述ELISA试剂盒用于检测植物组织研磨液中的灰葡萄孢菌抗原的方法，具体如下：
(1)溶液的配制：ELISA试剂盒先置于室温平衡30min，取出10×的样品包被液2mL加纯净水至20mL备用，取出10×PBST 60mL加纯净水至600mL配制成1×PBST备用，取出脱脂奶粉0.6g加入20mL 1×PBST配制成3％脱脂奶溶液备用，取出10×灰葡萄孢菌单抗1mL加1×PBST稀释至10mL备用，取出10×酶标二抗1mL加1×PBST稀释至10mL备用。
(2)采样与处理：采摘植物病组织，迅速带回实验室，每一样品取组织1cm2，加入1mL的样品包被液于离心管，用研磨棒研磨充分。
(3)加样与包被：96孔酶标板的A1～H1为质检孔，将质控检测的阳性抗原标准溶液加入到质控孔；加入抗原标准溶液并留空白孔，每孔100μL；取步骤(2)中的样品研磨液加入到B2～H12检测孔，每孔100μL；让酶标板于4℃包被过夜。
(4)洗板：每孔加入250μL的1×PBST，静置3～5min后拍干，重复洗涤三次。
(5)非特异性结合封闭：将包被过夜的酶标板每孔中加入150μL3％脱脂奶溶液，37℃下封闭30min，重复步骤(4)洗板。
(6)孵育灰葡萄孢菌单抗：每孔加入稀释的灰葡萄孢菌单抗溶液(由10×灰葡萄孢菌单抗经过稀释得到)100μL和用1×PBST稀释的3％脱脂奶100μL，37℃下温育1.5h，重复步骤(4)洗板。
(7)孵育酶标二抗：每孔加入稀释的1×酶标二抗溶液100μL(由10×酶标二抗经过稀释得到)，既HRP标记的羊抗鼠的二抗100μL/孔，于37℃下温育1h，重复步骤(4)洗板。
(8)显色及终止判断：每孔加入100μL TMB底物液，于37℃避光条件下显色15-20min直至质控显色明显，之后每孔加入50μL终止液终止显色反应，由于抗原抗体特异性结合以及酶标记放大的原理，将有明显颜色反应(显示出区别于空白孔的亮黄色)的孔视为阳性孔，即证明所测样品中含有灰葡萄孢菌抗原，含量≥31.25ng，否则为阴性反应。
表1试剂盒内容
材料
数量
材料
数量
酶标板
12孔×8条
10×酶标二抗
1mL
10×样品包被液
2mL
TMB底物液
10mL
10×PBST
60mL
终止液
6mL
脱脂奶粉
0.6g
研磨棒
1根
抗原标准溶液
1mL
1.5mL离心管
96个
10×灰葡萄孢菌单抗
1mL
注：10×样品包被液和10×PBST用纯净水稀释，脱脂奶粉和10×单抗用1×PBST稀释。
实施例1：杂交瘤细胞株制备
(1)抗原的准备：挑取灰葡萄孢菌的单菌落分别接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在25℃下振荡培养4～5d后，用50mL离心管收集孢子和菌丝，6000r/min离心20min，用PBS洗涤2次后，超声破碎(功率200W，破碎2s，间歇2s)，将破碎液在6000r/min离心20min，收集上清液，用考马斯亮蓝法测上清蛋白含量，调整蛋白浓度为1000μg/mL，作为免疫抗原及后期检测用初始抗原，将抗原液少量分装后-80℃冰冻保存。在临用前取少量于-20℃保存。
(2)选取6～8周龄的健康BaL b/c小鼠3只，采用腹腔注射法，每只注射用等量福氏完全佐剂乳化的抗原200μL。3周后免疫使用等量福氏不完全佐剂乳化抗原200μL。再过3周后用不加佐剂的抗原免疫。最后一次免疫后3天，收集抗血清(多克隆抗体)，在无菌条件下取小鼠脾淋巴细胞用于细胞融合。
(3)采用聚乙二醇(PEG-4000)作融合剂，小鼠骨髓瘤细胞系为SP 2/0。整个过程在无菌条件下操作。将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞放入50mL离心管中，混合离心(1200r/min，2min)后，吸尽上清液，以手指弹匀细胞。将离心管置于37℃水浴预温的盛水烧杯中，在1min内缓慢加入细胞融合剂(50％PEG，pH调制9.0)0.7mL。静止1min后，逐渐加入已经预温至37℃的RMPI-1640培养基40mL，使PEG稀释而失去作用。离心后(1000r/min，2min)弃上清液。将沉淀的细胞悬于40mL HAT培养基后，分装于事先加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，置于5％(V/V)CO2温箱中在37℃下培养。3天后换一半HAT培养基，5天后再换一半HAT培养基，再5天改用HT培养基继续培养，此时亲本均已死去，如有细胞生长即为杂交瘤细胞。
(4)当小孔中细胞生长到覆盖孔底四分之一面积时，即可吸取上清液用间接ELISA检测抗体。选出强阳性且不与木贼镰刀菌、半裸镰刀菌、链格孢菌、细极链格孢菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、茎点霉菌和拟茎点霉菌的抗原发生反应的细胞株，用有限稀释法进行多次克隆化培养，直至所有孔均为阳性为止，获得分泌单抗的细胞株BcE4，细胞株BcE4进一步扩大培养，用于制备单抗腹水和液氮冻存。该杂交瘤细胞于2021年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中国武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC No：C2021116。
实施例2：单抗的产生
取8周龄左右BaLb/c小鼠，腹腔注射0.2mL降植烷，7天后腹腔注射0.2mL含有5～10×105个杂交瘤细胞BcE4的细胞悬液，注射后7～10天可见小鼠腹腔明显膨胀，取腹水，2000r/min离心3min，收集上清液，即为腹水型单抗。Protein A柱层析纯化单抗，即为可专一识别灰葡萄孢菌的单抗，-80℃保存。
实施例3：单抗工作浓度确定
采用间接ELISA方法测定抗体的效价。将1000μg/mL的灰葡萄孢菌抗原用样品包被液稀释500倍后包被整块酶标板(即2μg/mL)，4℃过夜，PBST洗涤三次后用脱脂奶封闭60min。将单抗BcE4倍比稀释加入包被孔，每孔加100μL，37℃，1h，PBST洗涤三次后加入酶标二抗100μL孔，37℃1h，PBST洗涤后加OPD底物显色液显色，使用50μL终止液终止反应后，用酶标仪读取OD490nm，以与阴性对照比值大于2的样品为阳性测定单抗腹水效价。
经检测，确定BcE4的效价为稀释2.56×104倍，确定BcE4稀释1000倍用于其他检测实验(如图1)。
实施例4：试剂盒特异性检测
检测对象分别是灰葡萄孢菌、木贼镰刀菌、半裸镰刀菌、链格孢菌、细极链格孢菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、茎点霉菌和拟茎点霉菌，将上述抗原(1000μg/mL)用样品包被液稀释至2μg/mL后包被酶标板。以样品包被液为空白对照，用间接ELISA法检测单抗的特异性。
经上述检测，该抗体和上述真菌的抗原均不发生交叉反应，但该抗体与灰葡萄孢菌抗原反应强烈，可以明显判别是否存在灰葡萄孢菌抗原(图2)。
实施例5：试剂盒检测灵敏度确定
将1000μg/mL的灰葡萄孢菌抗原用样品包被液倍比稀释为1:100×20～1:100×214，包被在酶标板上，浓度由上到下从高到低。重复8次，第12列为空白对照，仅用样品包被液包被。
通过检测得1000μg/mL的灰葡萄孢菌抗原的最大稀释倍数为3200倍，即检测灵敏度为：1000μg/mL÷3200＝312.5ng/mL，即每孔31.5ng(图3)。
实施例6：单抗的类型及亚类检测
采用小鼠单抗亚类鉴定试剂盒(佰奥通实验材料中心，批号：20200809)对单抗进行鉴定。取1000μg/mL的灰葡萄孢菌抗原用样品包被液稀释1000倍后包被酶标板，100μL/孔，重复16孔，置37℃温育2h或4℃放罝12h，甩去样品包被液后用PBST洗涤1次。取100μL用PBST稀释1000倍的单抗加入酶标板各孔，置37℃温育30min，用PBST洗涤5次，取试剂盒中8种检测抗体Ig类型及亚类的酶标抗体各100μL，分别加入各孔，每种酶标抗体设2个重复，置37℃温育30min，PBST洗涤5次，加TMB显色液避光显色15min，用50μL 2M的H2SO4终止反应。酶标仪检测OD450nm，阳性孔所对应的抗体Ig类型及亚类即为该单抗的抗体类型及亚类。
经检测，确定BCA4的抗体类型为Igκ和IgG2A(图4)。
实施例7：单抗结合蛋白的检测
采用SDS-PAGE及Western blot技术对抗体结合蛋白进行检测，步骤如下：
(1)制备5％(M/V)的浓缩胶和10％(M/V)的分离胶。
(2)取80μL灰葡萄孢菌抗原和20μL的5×样品缓冲液混合于1.5mL离心管中，99℃金属浴10min后立即放入冰浴中3min，然后10000r/min离心5min。
(3)用微量加样器将样品加入样品孔，每样加2个孔，同时加蛋白Marker。
(4)电泳：先80V恒压，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后，再改为120V恒压，当溴酚蓝指示剂移到凝胶板下口约1cm时停止电泳。
(5)将凝胶用半干转印法在25V恒压下转印30min，转移蛋白至硝酸纤维素膜上。
(6)转印后的膜用PBST洗涤4次，每次5min。
(7)将膜浸入3％脱脂奶中，室温封闭1h。
(8)将膜浸入用3％脱脂奶稀释2000倍的单抗溶液中，室温下75r/min摇动1h后，4℃孵育过夜。同(6)洗涤。
(9)将膜浸入用3％BSA稀释8000倍的辣根过氧化物酶标记抗体，室温75r/min摇动1h。同(6)洗涤。
(10)将膜浸入10mL新配制的DAB显色液中，避光缓慢摇动直到显色，用蒸馏水终止显色反应。膜上显色的条带即为抗体所结合的特异性蛋白，根据蛋白Marker计算结合蛋白的相对分子量。
经检测，该抗体与灰葡萄孢菌相对分子量约35kDa、47kDa的蛋白特异性结合(图5)。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上事实例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
