发明内容

本发明的目的就是针对目前卡那霉素等抗生素的色谱及异相生物传感等检测方法存在操作繁琐、分析效率低、分析成本较高、重复性不好等问题，而基于金纳米粒子聚集所构建的均相比色生物传感方法灵敏度不高，且通常面临着复杂的核酸设计及其与各种蛋白质酶共存引起的背景信号干扰等挑战，提供一种简单的新型金纳米粒子聚集体系，并将该体系应用于卡那霉素等抗生素的检测中，该方法具有操作简单、灵敏度高、线性范围宽、检测时间较短、检测成本低廉等优点，可以广泛地应用于食品或水体等复杂基质中的抗生素残留现场快速筛查。

为实现上述发明目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一种基于纳米金聚集的卡那霉素均相生物传感方法，包括以下步骤：

（1）DNA链的预处理

取3个PV管并分别编号为#1、#2、#3，向#1 PV管中加入80 µL浓度为10 mM pH=7.4的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液，所述缓冲溶液中含有100 mM NaCl、40 mM KCl、10 mMMgCl₂；

向#1 PV管中加入10 µL 浓度为10 µM卡那霉素核酸适配体溶液S1和10 µL 浓度为10 µM Mg²⁺核酸酶链S2；所述卡那霉素核酸适配体S1的碱基序列为5’-ACGTAA CAT GGGGGT TGA GGC TAA GCC GAC TAG T-3’，所述Mg²⁺核酸酶链S2的碱基序列为5’-ACT AGT CAGCGA TCA CCC ATG TTA CGT AA-3’；

向#2 PV管中加入10 µL浓度为40 µM的发夹探针H1，所述发夹探针H1的碱基序列为5’-SH-(CH₂)₆-TTT TTT TTT TGG GTA GGG TCT TAC GTAT (rA) GGA CTA GTC AGC GATCGG GAC CCT ACC-3’，其中H1中的rA表示该位置的腺苷核糖核酸，其余均为脱氧核糖核酸；

向#3 PV管中加入10 µL浓度为40 µM的发夹探针H2，所述发夹探针H2的碱基序列为5’- GGT AGG GTC CCG CAC CCA TGT TAC GTAT (rA) GGA CTA GTG GTG CGG GTT GGGTTT TTT TTT T- SH-(CH₂)₆ -3’，其中H2中的rA表示该位置的腺苷核糖核酸，其余均为脱氧核糖核酸；

将#1 PV管中的溶液加热至95 ^oC，保持5 min后缓慢降温2 h至室温，得到稳定的杂交双链S1/ S2溶液；再将#2、#3 PV管中的溶液均加热至95 ^oC，保持5 min后缓慢降温2 h至室温，分别得到稳定的发夹茎环结构H1溶液和发夹茎环结构H2溶液；

（2）功能化金纳米粒子的制备

取2支PV管并分别编号为#4、#5，向每个PV管中加入1.0 mL 粒径为13 nm 金纳米粒子(Au NPs)，离心弃去上层清液后重新分散于装有1.0 mL 浓度为10 mM pH=7.4 的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液和质量分数为0.01 % 吐温-20的混合溶液中，再用浓度为0.1M K₂CO₃调至溶液的pH=8；

向#4管中加入10 μL步骤（1）中得到的浓度为40 µM稳定的发夹茎环结构H1溶液，向#5 PV中加入10 μL步骤（1）中得到的浓度为40 µM稳定的发夹茎环结构H2溶液，将#4和#5管在室温缓慢搅拌反应12 h之后，再分别往#4和#5 PV管中逐滴加入浓度为1.0 M的NaCl溶液，至PV管中NaCl浓度为0.1 M，每次加入NaCl溶液的时间间隔大于0.5 h；再于37 ^oC条件下继续涡旋反应24 h以促进Au NP/H1和Au NP/H2的形成；最后，于10000 rpm转速条件下离心15 min弃去上层清液，将收集所得到的Au NP/H1和Au NP/H2产物用浓度为10 mM pH=7.4的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液反复离心洗涤三次后分散至1 mL含有质量分数为0.5 %BSA、100 mM NaCl、40 mM KCl 和10 mM MgCl₂的10 mM pH=7.4的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液中，于4 ^oC保存待用；

（3）均相反应测定标准溶液中卡那霉素的含量

取7支PV管，向每支PV管中加入40 μL含有100 mM NaCl、40 mM KCl 和10 mMMgCl₂的10 mM pH=7.4的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液；接着向每支PV管中加入经步骤（1）退火处理后的10 μL 浓度为1 μM杂交双链S1/ S2溶液，再向每个PV管中分别加入50 µL含有卡那霉素的浓度梯度为0、0.0001 ng/mL、0.001 ng/mL、0.01 ng/mL、0.1 ng/mL、1 ng/mL和10 ng/mL 10 mM pH=7.4的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液，最后向每个PV管中加入50 µLAu NP/H1和50 µL Au NP/H2，于37 ^oC涡旋混匀反应120 min后利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，以建立吸光度与卡那霉素浓度之间的定量关系；

（4）样品中卡那霉素含量的检测

取处理后的样品溶液50 µL，加入40 μL含有100 mM NaCl、40 mM KCl 和10 mMMgCl₂的10 mM pH=7.4的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液；接着往其中加入经步骤（1）退火处理后的10 μL 1 μM杂交双链S1/ S2溶液，再加入50 µL Au NP/H1和50 µL Au NP/H2，于37^oC涡旋混匀反应120 min后利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，根据步骤（2）中得到的吸光度与卡那霉素浓度之间的定量关系，计算出样品溶液中卡那霉素的含量。

本发明还提供了一种基于纳米金聚集的卡那霉素均相生物传感方法在检测样品中卡那霉素含量中的应用。

本发明的工作原理是：通过卡那霉素（Kana）核酸适配体（S1）与Mg²⁺核酸酶的功能核酸结构（S2）的双链杂交反应可以很好抑制核酸酶活性，利用目标物卡那霉素Kana与其核酸适配体（S1）之间的特异性结合释放可以引发Cycle I反应的Mg²⁺核酸酶的功能核酸结构（S2）。接下来，通过引入两种由发夹H1和H2修饰的金纳米粒子Au NP/H1和Au NP/H2，发夹H1由Mg²⁺核酸酶的1/2劈开碱基序列M1和修饰在Au NP上的G-四链体1/2碱基序列（Au NP/G1）组成，发夹H2由Mg²⁺核酸酶的1/2劈开碱基序列M2和修饰在Au NP上的G-四链体1/2碱基序列（Au NP/G2）组成，同时发夹H1和H2在环部区域均修饰有一个Mg²⁺核酸酶的识别位点(rA)以及用于识别Mg²⁺核酸酶的底物序列。当释放出来的S2特异性识别剪切修饰在Au NPs上的发夹H1和H2后，Mg²⁺核酸酶的酶促反应将引发发夹H1和H2中G-四链体1/2碱基序列的释放，同时S2链被释放参与下一组反应来实现循环信号放大，由于G-四链体1/2碱基序列可以在K⁺存在下通过自身折叠形成G-四链体，因而标记有G-四链体1/2碱基序列的两种金纳米粒子（Au NP/G1和Au NP/G2）将从分散状态转变为聚集状态，从而引起金纳米粒子吸光度信号的降低，达到降低的S_a吸光度响应。此外，Mg²⁺核酸酶的酶促反应还引发了发夹H1和H2中Mg²⁺核酸酶的1/2劈开碱基序列（M1、M2）的释放，两段1/2劈开碱基序列可以进行杂交反应形成一个新的复合Mg²⁺核酸酶二级结构，从而引发Cycle II的反应，当复合Mg²⁺核酸酶作用于修饰在Au NPs上的发夹H1和H2后，Mg²⁺核酸酶的酶促反应将引发发夹H1和H2中G-四链体1/2碱基序列的释放，同时复合Mg²⁺核酸酶二级结构被释放参与下一组反应来实现循环信号放大，在K⁺存在下G-四链体1/2碱基序列通过自身折叠形成G-四链体引发金纳米粒子聚集，进一步引起金纳米粒子吸光度信号的降低，达到更低的S_b吸光度响应。基于该Kana高特异性核酸适配体识别，以及Mg²⁺核酸酶催化剪切作用引起的双重信号放大作用构建的上述金纳米粒子聚集反应显色体系，即可成功建立均相检测产物吸光度信号与卡那霉素分析物浓度之间的定量关系。

本发明所采用的核酸适配体不仅具有较传统抗体稳定性更好，成本更为低廉等优点，而且核酸适配体与卡那霉素分析物之间的特异性识别作用可以很好保证该方法在复杂基质分析中的优良选择性；基于简单的核酸碱基设计及Kana高特异性核酸适配体识别反应触发释放的Mg²⁺核酸酶在发夹DNA功能化Au NPs表面上的双重三维催化剪切作用引起的纳米金聚集反应不仅有效保证了该方法较高的分析灵敏度，而且很好避免了传统方法使用复杂的纳米材料来进行信号放大所面临的操作繁琐且容易引起非特异性吸附信号干扰的影响，以及复杂的核酸设计及其与各种蛋白质酶共存引起的背景信号干扰；此外，基于碱基设计的全部生物识别及核酸和核酸酶信号放大反应都在均相溶液中一步进行，操作十分方便，自动化程度高，完全排除了传统异相分析方法中繁琐的多步操作和较高的实验技术要求，比色信号检测不仅简单直观，不需要昂贵的信号标记和大型仪器，而且具有很好的重复性，因而较传统方法具有十分突出的性能优势，在食品、水体等复杂介质中卡那霉素残留的现场、快速检测领域具有很好的应用价值。

本发明构建的生物传感方法可以方便、简单地用于卡那霉素含量的高选择性检测，具有灵敏度高、线性范围宽、检测时间较短、检测成本低廉等优良性能，可在0.1 pg/mL~10 ng/mL浓度范围内实现对卡那霉素的定量响应和准确测定，很好克服了传统方法操作繁琐、成本较高、时间较长、重复性不好等缺陷。

本发明的基于纳米金聚集的卡那霉素均相生物传感方法也可以用于检测其它抗生素，只需要根据待测抗生素的相关性质选择相应的核酸适配体，并设计相应DNA单链的碱基系列，即可实现其它抗生素的检测。