具体实施方式

下面将结合实施例对本发明作进一步说明，以便全面了解本发明。

实施例1

称取熊果酸500mg溶于50ml二甲基亚砜中，加入适量0.125g NHS和0.58gEDC，搅拌均匀，逐滴加入1mg/ml的壳聚糖溶液(1％醋酸水∶二甲基亚砜体积比1∶1)中，调节pH至5.0范围，室温反应48h，1000ml无水乙醇沉淀，抽滤，30ml二氯甲烷、30ml乙醇、30ml水充分洗涤沉淀3次，冻干即制得式II所示的N-熊果酰基-壳聚糖；称取500mgII所示的N-熊果酰基-壳聚糖，混悬于水中，加入1gNHS、0.11gDMAP和4.7gEDC，搅拌均匀，加入精氨酸1.5g，调节pH至5.0，室温反应48h，透析，抽滤，滤液冻干即制得式I所示的O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖；将100mg O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖溶于20ml水中，冰浴超声即得O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖纳米胶束(OAUCS)。

O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖载药胶束的制备：称取O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖，溶于去离子水中，探头超声30次，功率为200w，工作2s停3s，制备2mg/mL的胶束溶液。另取紫杉醇，加入二甲基亚砜，配成浓度为2mg/mL的溶液。按紫杉醇：O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖的质量比为25％的投药量加入含2mg/mL紫杉醇的二甲亚砜溶液，在室温下避光搅拌2小时，结束后转移到截留分子量为3500的透析袋中，纯水透析24小时，收集透析好的产物于8000r下低温离心10min，以除去未被胶束包封的紫杉醇，收集上清液，得O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖载药胶束(PTX-OAUCS)。

利用HPLC测定载药胶束中紫杉醇的载药量和包封率。取紫杉醇载药胶束，用流动相稀释，色谱柱为Supersil ODS2 C₁₈(4.6×250mm，5μm)，流动相为甲醇∶水(70∶30，v/v)，流速为1ml/min，检测波长为227nm，进样量为20μl。根据标准曲线计算载药胶束中药物浓度。

包封率＝(紫杉醇投药质量-未被包封的游离紫杉醇质量)/紫杉醇投药质量×100％

载药量＝胶束中的紫杉醇质量/胶束质量×100％。

经计算得到载药胶束的载药量为22.7％，包封率为84.6％。

制备空白胶束和载药胶束溶液，用微粒粒度与表面电位测定仪分别测定载药胶束的粒径及表面电位。经测定得，载药胶束的粒径为127.5±3.47nm，Zeta电位为23.2±3.21mV。

1.1傅里叶红外光谱分析(FTIR)

红外光谱用Nicolet 2000型傅立叶变换红外光谱仪(美国Nicolet公司)进行测定。测定的方法为：将约1～2mg上述制得的O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖冻干样品加入到200mg左右经过研磨并干燥的KBr粉末中，充分混合后压片，置于红外光谱仪内扫描，扫描范围：4000cm^-1～400cm^-1，记录其红外光谱，如图1所示。

1.2核磁共振1H-NMR

上述制得的O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖冻干样品溶于D₂O或氘代DMSO，150MHz频率照射，在20℃下用Bruker(AVACE)AV-500型核磁共振仪(德国Bruker公司)记录图谱，如图2所示。

1.3熊果酰基与精氨酰基取代度的测定

1.3.1熊果酰基取代度的测定

用Elementar Vario EL III元素分析仪(德国Elementar公司)分别测定上述壳聚糖和熊果酰基壳聚糖的C、N、H元素质量百分比。

元素分析熊果酸的取代度，结果20.91％。

1.3.2精氨酰基取代度的测定

用Elementar Vario EL III元素分析仪(德国Elementar公司)分别测定上述壳聚糖、熊果酰基壳聚糖、O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖的C、N、H元素质量百分比。

元素分析精氨酸的取代度为178％.

1.4透射电镜

取适量制得的载药纳米粒，蒸馏水稀释100倍，滴在铜网上，静置一段时间，用滤纸吸干，滴加2％磷钨酸溶液负染5～10min，自然挥发干，通过透射电子显微镜观察形态。结果如图3所示，镜下粒径＜200nm，为较圆整颗粒。

实施例2

称取熊果酸250mg溶于25ml二甲基亚砜中，加入适量0.125g NHS和0.58gEDC，搅拌均匀，逐滴加入1mg/ml的壳聚糖溶液(1％醋酸水∶二甲基亚砜体积比1∶1)中，调节pH至5.0范围，室温反应48h，1000ml无水乙醇沉淀，抽滤，30ml二氯甲烷、30ml乙醇、30ml水充分洗涤沉淀3次，冻干即制得式II所示的N-熊果酰基-壳聚糖；称取250mgII所示的N-熊果酰基-壳聚糖，混悬于水中，加入1gNHS、0.11gDMAP和4.5gEDC，搅拌均匀，加入精氨酸1.5g，调节pH至5.0，室温反应48h，透析，抽滤，滤液冻干即制得式I所示的O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖；将100mgO-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖溶于20ml水中，冰浴超声即得O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖纳米胶束。

O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖载药胶束的制备：称取O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖，溶于去离子水中，探头超声30次，功率为100w，工作2s停1s，制备2mg/mL的胶束溶液。另取紫杉醇，加入二甲基亚砜，配成浓度为2mg/mL的溶液。按紫杉醇：O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖的质量比为25％的投药量加入含2mg/mL紫杉醇的二甲亚砜溶液，在室温下避光搅拌2小时，结束后转移到截留分子量为3500的透析袋中，纯水透析24小时，收集透析好的产物于8000r下低温离心10min，以除去未被胶束包封的紫杉醇，收集上清液，得O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖载药胶束。

利用HPLC测定载药胶束中紫杉醇的载药量和包封率。取紫杉醇载药胶束，用流动相稀释，色谱柱为Supersil ODS2 C₁₈(4.6×250mm，5μm)，流动相为甲醇∶水(70∶30，v/v)，流速为1ml/min，检测波长为227nm，进样量为20μl。根据标准曲线计算载药胶束中药物浓度。

包封率＝(紫杉醇投药质量-未被包封的游离紫杉醇质量)/紫杉醇投药质量×100％

载药量＝胶束中的紫杉醇质量/胶束质量×100％。

经计算得到载药胶束的载药量为21.8％，包封率为83.5％。

制备空白胶束和载药胶束溶液，用微粒粒度与表面电位测定仪分别测定载药胶束的粒径及表面电位。经测定得，载药胶束的粒径为129.2±3.20nm，Zeta电位为24.6±1.73mV。

实施例3：

1.MTT法检测OAUCS对MCF-7/PTX肿瘤细胞增殖能力的影响

MTT法检测将培养的细胞接种于96孔的培养板中，置于饱和湿度的CO₂培养箱中继续培养24h(37℃、5％CO₂)，弃去培养液，然后每孔加入DMEM培养液适量，对照组、BlankOAUCS组加入不含PTX的空白OAUCS胶束、阳性药组加入含3μM PTX、3μM PTX-OAUCS、6μMPTX-OAUCS、9μM PTX-OAUCS，分别加小牛血清。继续培养24h，制得受试细胞液。每孔加入MTT溶液，37℃孵育4h，吸去每孔中的培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)，振荡后采用酶联免疫反应检测仪测定各孔OD值，在一定波长下测定，调零孔只含有DMSO。所得各孔平均OD值按下述公式计算肿瘤细胞抑制率：

抑制率(％)＝(对照组平均OD值-给药组平均OD值)/对照组平均OD值×100％。

数据处理：将OD值输入Excel表，根据公式计算细胞抑制率，数据统计及处理均通过软件SPSS进行，计量资料组间比较采用Student′s t-检验，多组之间比较采用one-wayANOVA进行，p＜0.05表示具有统计学差异，p＜0.01表示具有显著的统计学差异。

结果显示：OAUCS不同浓度(1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、60mg/ml)作用后，1-30mg/ml，各浓度对MCF-7/PTX细胞的增殖抑制率无统计学差异；30mg/ml OAUCS作用后，MCF-7/PTX细胞的增殖抑制率显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。OAUCS在0-20mg/ml范围对MCF-7/PTX细胞的增殖抑制率较低，无毒。后面考查PTX-OAUCS杀灭肿瘤作用时，选择20mg/ml以下的载体浓度，以排除药物载体对肿瘤的杀灭效应(如图4)。

2.OAUCS对MCF-7/PTX耐药性的逆转作用

取对数期生长的人乳腺癌耐紫杉醇细胞株(MCF-7/PTX)细胞，调整细胞密度，按每孔8×10³个细胞接种于96孔板中，每孔加180μL细胞悬液，培养24h后，吸取培养基换液，PTX组和PTX-OAUCS组更换为100μL DMEM培养基，OAUCS组加入终浓度为1mg/ml OAUCS 100μL培养24h，后用不同浓度的PTX，其终浓度分别为0、1、5、25、125、250μg/mL，每孔总体积200μL；设对照孔为不加药物的；调零孔为不加细胞的培养液，每组设3个复孔。置于饱和湿度、37℃、5％CO₂培养箱中继续培养48h，各孔加入MTT(5mg/mL)10μL，继续培养4h，弃去培养上清，每孔加入DMSO 150μL摇床上摇10min，测定各孔OD570值，计算紫杉醇对MCF-7/PTX细胞增殖的抑制率及IC₅₀值、耐药指数。另取PTX-OAUCS，采用与PTX组相同的PTX浓度和实验方法，计算抑制率及IC₅₀值、耐药指数。

计算公式为：细胞生长抑制率(％)＝[1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100％；采用SigmaPlot 10.0软件计算IC₅₀值；耐药逆转倍数(RI)＝药物作用前细胞IC₅₀/作用后细胞IC₅₀。

结果如表1所示，OAUCS能增强PTX对MCF-7/PTX细胞的增殖抑制作用，提高细胞对PTX的敏感性。该结果表明，OAUCS能降低MCF-7/PTX细胞对PTX的抗性。

表1各样品对MCF-7/PTX耐药性的逆转作用

综上，OAUCS和PTX-OAUCS可以开发成逆转乳腺癌对紫杉醇耐药性的药物。

实施例4：OAUCS逆转MCF-7/PTX细胞对紫杉醇耐药的作用

1.MTT法检测PTX-OAUCS对MCF-7/PTX细胞的增殖抑制

实验方法同实验例3。取对数期生长的人乳腺癌耐紫杉醇细胞株(MCF-7/PTX)细胞，调整细胞密度，按每孔8×10³个细胞接种于96孔板中，每孔加180μL细胞悬液，培养24h后，加入不同浓度的PTX-OAUCS及PTX，每孔总体积200μL；设对照孔为不加药物的；调零孔为不加细胞的培养液，每组设3个复孔。置于饱和湿度、37℃、5％CO₂培养箱中继续培养48h，各孔加入MTT(5mg/mL)10μL，继续培养4h，弃去培养上清，每孔加入DMSO 150μL摇床上摇10min，测定各孔OD570值，计算肿瘤细胞抑制率。

结果显示：3μM PTX-OAUCS与单用PTX 3μM相比，MCF-7/PTX细胞的增殖抑制率明显上升，差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)；6μM PTX-OAUCS与3μM PTX-OAUCS相比，MCF-7/PTX细胞的增殖抑制率明显上升，差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)。表明PTX-OAUCS能明显的抑制MCF-7/PTX细胞的增殖(如图5)。

2.流式细胞术检测PTX-OAUCS促进MCF-7/PTX细胞的凋亡

将MCF-7与MCF-7/PTX细胞分为6组：对照组、3μM PTX组、6μM PTX组、3μM PTX-OAUCS组、6μM PTX-OAUCS组。取生长于对数期的细胞，按需将细胞调至合适的数量，接种于培养板进行培养，次日观察细胞并将药物调至合适的浓度，作用48小时后用于后续实验；将细胞调整为2.5×10⁵个/ml，接种于六孔板内，即5×10⁵个/孔；次日细胞贴壁后弃掉旧培养基，用DMEM完全培养基将PTX或PTX-OAUCS稀释到需要的浓度加入六孔板内，培养箱继续培养48小时；准备好PBS磷酸盐缓冲液、吸管、不含EDTA的胰酶、流式管、BD凋亡试剂盒等备用；标记好流式管，将六孔板内旧培养基分别吸入相应的流式管内，用PBS磷酸盐缓冲液清洗3次，加入0.5mL的不含EDTA的胰酶，消化充分后用旧培养基中和，将细胞放入相应标记的流式管内；离心，1000rmp，5min，弃上清，每管加入1mL PBS缓冲液，旋涡震荡器上轻微震荡后离心，2000rmp，10min，重复3次，弃掉上清；将10倍的Annexin V Binding Buffer稀释为1倍，每管内加入100μL，继续加入7-AAD和PE Annexin V，每管各2.5μL，避光30min，加入1倍的Annexin V Binding Buffer，200μL/孔；上机分析，实验本记录各组细胞凋亡率。

结果表明：3μM PTX-OAUCS与单用3μM PTX相比，MCF-7/PTX细胞的凋亡率明显上升，差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)；3μM PTX-OAUCS与6μM PTX-OAUCS相比，MCF-7/PTX细胞的凋亡率明显上升，差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)。表明PTX-OAUCS能明显促进MCF-7/PTX细胞的凋亡水平(如图6)。

实施例5：熊果酸逆转小鼠皮下移植瘤对紫杉醇耐药的作用

取生长于对数期的MCF-7/PTX细胞，用PBS重悬，将细胞调整为3×10⁷个/mL，每只小鼠自腋下注射3×10⁶个细胞，100μL/只。细胞注射10天后，将小鼠随机分组，分别进行给药，动物分为6组：对照组(每3天注射PBS 100μL)、空白载体OAUCS组(每3天注射OAUCS10mg/kg)、LPTX组(每3天注射PTX 10mg/kg)、低剂量LPTX-OAUCS组(每3天注射PTX-OAUCS10mg/kg)、中剂量MPTX-OAUCS组(每3天注射PTX-OAUCS 25mg/kg)、高剂量HPTX-OAUCS组(每3天注射PTX-OAUCS 50mg/kg)，LPTX、LPTX-OAUCS、MPTX-OAUCS和HPTX-OAUCS组注射剂量按药物PTX计，用药4周，剥离瘤体。

每3天通过游标卡尺测量肿瘤的长和宽，计算瘤体体积(V＝L×W²×0.5，L表示肿瘤的长度；W表示肿瘤的宽度)，记录数据，绘制成瘤体在小鼠体内的增长曲线。在最终药物施用3天后，取出肿瘤，天平称取剥离后瘤体重量，游标卡尺测量瘤体剥落后长和宽，记录数据，绘制成图。

结果表明：低剂量L-PTX-OAUCS组相对于L-PTX组，小鼠皮下的肿瘤生长较慢，差异具有统计学意义(P＜0.05)；高剂量H-PTX-OAUCS组相对于低剂量L-PTX-OAUCS组，小鼠皮下的肿瘤生长较慢，差异具有统计学意义(P＜0.05)；瘤体剥落后，低剂量L-PTX-OAUCS组相对于L-PTX组，瘤体体积较小，差异具有显著的统计学意义(P＜0.05)；高剂量H-PTX-OAUCS组相对于低剂量L-PTX-OAUCS组，瘤体体积下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)；瘤体剥落后，高剂量H-PTX-OAUCS组相对于低剂量L-PTX-OAUCS组，瘤体重量较轻，差异具有统计学意义(P＜0.05)。表明L-PTX-OAUCS作用相对于单用L-PTX作用能明显抑制肿瘤在小鼠体内的生长(如图7)。

实施例6：罗丹明外排试验测定P-gp的功能

1.P-gp的功能采用经典的方法：能将细胞染色的荧光染料罗丹明123(R123)来确定，罗丹明也是公认的、经典的P-gp的底物。有许多报道称，P-gp的功能显著地与罗丹明外排有关，和P-gp的抑制可导致染料保留。罗丹明可以是几乎完全包封于纳米胶束系统中。罗丹明对在细胞中的积累，用流式细胞仪检测。

R123-OAUCS的制备：称取O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖，溶于去离子水中，探头超声30次，功率为100w，工作2s停1s，制备2mg/mL的胶束溶液。另取R123，加入二甲基亚砜，配成浓度为2mg/mL的溶液。按紫杉醇：O-精氨酰基-N-熊果酰基-壳聚糖的质量比为25％的投药量加入含2mg/mL R123的二甲亚砜溶液，在室温下避光搅拌2小时，结束后转移到截留分子量为3500的透析袋中，避光，纯水透析24小时，收集透析好的产物于8000r下低温离心10min，以除去未被胶束包封的R123，收集上清液，得R123-OAUCS。

取生长于对数期的MCF-7/PTX细胞，按需将细胞调至合适的数量，接种于培养板进行培养，次日观察细胞并将药物调至合适的浓度，作用48小时后用于后续实验；将细胞调整为2.5×10⁵个/ml，接种于六孔板内，即5×10⁵个/孔；次日细胞贴壁后弃掉旧培养基，用DMEM完全培养基将罗丹明溶液和R123-OAUCS加入以培养基，都含5μg/mL的罗丹明于37℃孵育2h，对照组为DMEM培养基。弃去上清，加入200μlPBS洗涤3次，胰酶消化，加入500μL预冷PBS重悬细胞，于流式细胞仪检测，激发波长480nm，发射波长540～660nm，细胞内罗丹明浓度以荧光强度平均值表示。

罗丹明123(R123)为经典的P-gp底物，受到P-gp的外排，且自身带有荧光，可以通过细胞内荧光的强弱反映受P-gp外排的强弱。OAUCS对罗丹明受P-gp外排的影响，如图8所示，从图中可以看出R123单独与细胞孵育2h，进入细胞内的R123非常少，而将R123制成R123-OAUCS胶束，进入到细胞中R123大大增加，胞内R123荧光强度增加，差异具有显著的统计学意义(P＜0.01)；表明OAUCS确实可以起到抑制P-gp对R123的外排作用。

2.Western blot检测P-gp的表达

取生长于对数期的细胞，按需将细胞调至合适的数量，接种于培养板进行培养，次日观察细胞并将药物调至合适的浓度，作用48小时后用于后续实验；将细胞调整为2.5×10⁵个/ml，接种于六孔板内，即5×10⁵个/孔；次日细胞贴壁后弃掉旧培养基，用DMEM完全培养基将对照组、低剂量OAUCS组(L-OAUCS，0.1mg/ml)、中剂量OAUCS组(M-OAUCS，1mg/ml)、高剂量OAUCS组(H-OAUCS，10mg/ml)组稀释到需要的浓度加入六孔板内，200μL，培养箱继续培养48小时。取经不同浓度OAUCS孵育处理的MCF-7/PTX细胞，提取总蛋白，BCA法定量蛋白量，上样电泳，凝胶上蛋白转至PVDF膜，室温封闭1h，加一抗(P-gp一抗，β-actine一抗)，4℃孵育过夜，将PVDF膜置于GST兔二抗孵育，洗3次后显影，检测并记录P-gp的表达。

采用OAUCS与MCF-7/PTX细胞孵育48h，用Western blot检测P-gp的表达，OAUCS对P-gp表达的影响结果如图9所示，低剂量L-OAUCS组相对于对照组，P-gp的表达下降显著，差异具有显著统计学意义(P＜0.05)；高剂量H-OAUCS组相对于低剂量L-OAUCS组，P-gp的表达下降显著，差异具有极显著统计学意义(P＜0.001)。随着OAUCS浓度增加，MCF-7/PTX细胞P-gp的表达逐渐下降，表明OAUCS可以下调P-gp的表达。

实施例7：

MTT法测定细胞的粘附情况

10g/L BSA；25mg/L Matrigel 50μl/孔分别加入96孔培养板，风干过夜，BSA为对照基底。每孔加入50μl含0.1％BSA的无血清培养液37℃1h水化基底膜。取常规传代培养或与不同浓度的的OAUCS(1mg/ml、10mg/ml)共孵育有48h的MCF-7细胞，经消化洗涤后，以0.1％BSA-1％新生牛血清的RPMI1640调细胞密度为1×10⁵个/ml，分别将100μl细胞悬液加入96孔板，每组平行4个样本。常规培养1h，吸弃培养液，PBS冲洗除去未粘附细胞，每孔加MTT溶液20μl，CO₂培养箱温育4h，弃MTT液，每孔加入150μl DMSO，酶标光度计490nm波长测量各孔吸光度(OD值)。计算细胞在人工基底膜Matrigel上的粘附率和粘附抑制率。

计算公式为：粘附率(％)＝[(Matrigel组细胞OD值/BSA组细胞OD值)-1]×100％。粘付抑制率(％)＝[1-(用药组细胞粘附率/未用药组细胞粘附率)]×100％。

表2 OAUCS处理的MCF-7/PTX细胞在Matrigel上的粘附

经OAUCS处理的各组与对照组比较t检验(*P＜0.05；**P＜0.01)

粘附是癌细胞侵袭、转移的始动步骤，抑制肿瘤细胞粘附，可以防止肿瘤细胞转移。实验结果表明：OAUCS不同浓度(1mg/ml、10mg/ml)对MCF-7/PTX细胞的粘附抑制作用明显上升，差异具有显著的统计学意义(P＜0.05)。表明1mg/ml和10mg/ml OAUCS能抑制MCF-7/PTX肿瘤细胞的粘附作用，防止肿瘤细胞转移。

综上所述：本发明是一种新型具穿膜深渗透、抑制P-糖蛋白逆转肿瘤耐药的抗肿瘤转移的纳米递药载体，包封率、载药量高，本发明的药物载体，细胞毒性实验、细胞摄取和外排实验、粘附实验表明本发明中的新型载药系统有更好的细胞穿膜摄取效果、P-gp的抑制作用和抑制粘附抗转移作用，作用显著优于对照组实验组，小鼠皮下移植瘤实验表明，该制剂有更好的抗癌作用，达到了更好的治疗效果。

以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。