具体实施方式

下文中，将描述本文的各种实施例。本文中所使用的实施例和术语并不旨在将本公开中所描述的技术限制于特定实施例，并且应当理解，实施例和术语包括本文中所描述相应实施例的修改、等价物和/或替代物。

具有新型结构的聚合物及其制备方法

根据本公开的各种实施例的一种聚合物基于具有羟基和羧基中的至少一个基团的生物可降解的聚合物。

生物可降解的聚合物可以是天然聚合物，例如透明质酸、明胶、淀粉、甲壳素、纤维素、海藻酸盐、胶原、肝素或壳聚糖，或合成聚合物，例如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚二恶烷酮(PDO)、聚三亚甲基碳酸酯(PTMC)或聚羟基烷酸酯(PHA)。

具体地，根据本公开的各种实施例的聚合物带有羟基和羧基中的至少一种，其中一个功能团与释放一氧化氮的化合物结合，另一个功能团被可光聚合功能团取代。

例如，当生物可降解的聚合物带有羟基和羧基两者时，羧基可以与释放一氧化氮的化合物结合，羟基可以被可光聚合功能团取代。同时带有羟基和羧基的生物可降解的聚合物可以是例如透明质酸。透明质酸具有以下化学式。

透明质酸具有生物相容性、疏水性和生物可降解性，并且涉及增殖、炎症和创伤愈合的细胞学过程。此外，透明质酸富含羟基和羧基，从而能够易于用各种功能团进行改性。

在一个替换方案中，当生物可降解的聚合物仅带有羟基时，一部分羟基可以被羧基取代，然后与释放一氧化氮的化合物结合，而另一部分羟基可以被可光聚合功能团取代。仅带有羟基的生物可降解的聚合物的示例包括淀粉、甲壳素和壳聚糖。

淀粉具有以下化学式。

甲壳素具有以下化学式。

壳聚糖具有以下化学式。

在另一个替换方案中，当生物可降解的聚合物仅带有羧基时，一部分羧基可以与释放一氧化氮的化合物结合，而另一部分羧基可以被羟基取代，然后被可光聚合功能团取代。仅带有羧基的生物可降解的聚合物的示例包括明胶、海藻酸盐、肝素、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚三亚甲基碳酸酯(PTMC)、聚二恶烷酮(PDO)和聚羟基烷酸酯(PHA)。

明胶具有以下化学式。

海藻酸盐具有以下化学式。

肝素具有以下化学式。

PLA具有以下化学式。

PGA具有以下化学式。

PLGA具有以下化学式。

PTMC具有以下化学式。

PDO具有以下化学式。

PHA具有以下化学式。

同时，光聚合功能团可以包括选自以下项中的至少一项：甲基丙烯酸基、乙基丙烯酸基、巴豆酸基、肉桂酸基、乙烯基醚基、乙烯基酯基、乙烯基亚芳基、二环戊二烯基、降冰片烯基、异戊烯基、异丙烯基、烯丙基或丁烯基；乙烯基亚芳基醚基、二环戊二烯基醚基、降冰片烯基醚基、异戊烯基醚基、异丙烯基醚基、烯丙基醚基或丁烯基醚基；和乙烯基亚芳基酯基、二环戊二烯基酯基、降冰片烯基酯基、异戊烯基酯基、异丙烯基酯基、烯丙基酯基、丁烯基酯基或甲基丙烯酸缩水甘油酯基。换言之，光聚合功能团包含不饱和双键。

释放一氧化氮的化合物可以是能够在特殊条件下存储和释放一氧化氮的物质。例如，释放一氧化氮的化合物可以是包括NO供体的化合物。

就此而言，NO供体可以包括选自以下项中的至少一项：有机亚硝酸盐、有机硝酸盐、亚硝基硫醇、C-亚硝基化合物、N-羟基亚硝胺、二氮杂环丁烯二氧化物、噁三唑-5-亚胺、N-亚硝胺、斯德酮亚胺、肟、羟胺、N-羟基胍、羟基脲、亚硝胺、N-羟基亚硝胺、NO-金属络合物和N-二醇二氮烯鎓(NONOate)。

举例说明，代表性NO供体可以具有以下化学式。

当包括NO供体NONOate时，释放一氧化氮的化合物能够通过以下过程释放一氧化氮。即，其在水溶液条件下分解以释放一氧化氮。

同时，胺类化合物可以包括选自以下项中的至少一项：N-甲基乙二胺(N-MEDN)、N-乙基乙二胺(N-EEDN)、N-异丙基乙二胺(N-IPED)、N-异丙基-1，3-丙二胺(N-IPPDN)和N-苄基乙二胺(N-BEDN)。

根据本公开的实施例，释放一氧化氮的化合物可以从胺类化合物改性，并且包括NO供体中的N-二醇二氮烯鎓(NONOate)。例如，释放一氧化氮的化合物可以包括选自以下项中的至少一项：由N-MEDN改性的(MEDN)-NONOate，由N-EEDN改性的(EEDN)-NONOate，由N-IPED改性的(IPED)-NONOate，由N-IPPDN改性的(IPPDN)-NONOate和由N-BEDN改性的(BEDN)-NONOate。

优选地，释放一氧化氮的化合物可以是由N-甲基乙二胺(N-MEDN)改性的(MEDN)-NONOate。就此而言，(MEDN)-NONOate可以具有以下化学式。

根据本公开的各种实施例的聚合物，其是以透明质酸作为主链的聚合物，可以具有以下化学式：

其中n是1或更大。

参考该化学式，透明质酸中的羟基用甲基丙烯酸基取代，而羧基与(MEDN)-NONOate结合。

下文中，将描述根据各种实施例的聚合物的制备方法。该聚合物的制备方法可以包括如下步骤：合成中间体；生成中间体盐；和将中间体与溶剂和释放一氧化氮的化合物混合。

在合成中间体的步骤中，生物可降解的聚合物与带有光聚合功能团的聚合物反应以使光聚合功能团取代生物可降解的聚合物的功能团中的至少一个。

例如，当生物可降解的聚合物带有羟基和羧基两者时，羟基可以被可光聚合功能团取代。

在一个替换方案中，当生物可降解的聚合物仅带有羟基时，一部分羟基可以被可光聚合功能团取代。

在另一个替换方案中，当生物可降解的聚合物仅带有羧基时，一部分羧基可以被可光聚合功能团取代。

根据一个实施例，透明质酸，其是生物可降解的聚合物，与具有光聚合功能团的聚合物反应以使光聚合功能团取代透明质酸的至少一个羟基。例如，参考图1(A),透明质酸与甲基丙烯酸酐反应将透明质酸的羟基取代为光聚合甲基苯烯酸基，以合成甲基丙烯酸透明质酸(MA-HA)。即，透明质酸的羟基通过酯基转移作用被甲基丙烯酸基取代，以提供甲基丙烯酸透明质酸(MA-HA)。该反应可以在pH维持在8至11时进行。此外，在反应完成后，通过沉淀、离心和透析来进行纯化。

在合成中间体的步骤之后，可以进行生产中间体盐的步骤。这是将中间体增溶于有机溶剂中的预处理步骤。例如，参考图1(A)，中间体MA-HA能够使用离子交换树脂被转换成四丁基铵(TBA)盐(MA-HA-TBA)。这个预处理步骤是必要的，因为最终的聚合物合成由于释放一氧化氮的化合物对水溶液的高相容性而应当在有机溶剂中进行。

在混合步骤中，中间体盐与溶剂和释放一氧化氮的化合物进行混合。

就此而言，当生物可降解的聚合物带有羟基和羧基两者时，羧基可以与释放一氧化氮的化合物结合。

可替换地，当生物可降解的聚合物仅带有羟基时，在先前的合成步骤中仍然未被取代的羟基可以预先被转换成羧基，该羧基然后与释放一氧化氮的化合物结合。

进一步可替换地，当生物可降解的聚合物仅带有羧基时，在先前的合成步骤中仍然未被取代的羧基可以与释放一氧化氮的化合物结合。

在特别的实施例中，释放一氧化氮的化合物可以是MEDN-NONOate。中间体盐(MA-HA-TBA)和释放一氧化氮的化合物的摩尔比可以是1:0.5至1:30。具体地，中间体盐(MA-HA-TBA)和释放一氧化氮的化合物的摩尔比可以是1:2，1:5或1:7。当由这样的摩尔比来从聚合物制作时，用于存储和释放一氧化氮的纳米纤维能够存储和释放各种浓度范围的一氧化氮，优化了释放时间。

参考图1(A)，当生物可降解的聚合物是透明质酸时，透明质酸的羧基可以通过混合步骤与释放一氧化氮的化合物结合。

根据本公开的聚合物的应用，生物可降解的聚合物和释放一氧化氮的化合物的摩尔比可以进行各种调整。例如，纳米纤维的降解速率可以通过调整生物可降解的聚合物的含量来控制。另一方面，一氧化氮的释放量可以通过调整释放一氧化氮的化合物的含量来控制。一氧化氮的释放量可以根据释放一氧化氮的化合物的含量而变化。因为容易控制这些摩尔比，本公开的聚合物能够根据其用途找到各种应用。

用于存储和转移一氧化氮的纳米纤维及其制作方法

根据本公开的各种实施例的纳米纤维可以是由生物可降解的聚合物改性的纳米纤维。具体地，具有如上所述的新型结构的聚合物可以被静电纺丝成纳米纤维。

下文中，描述了根据本公开的各种实施例的用于制作纳米纤维的方法。

一种用于制作纳米纤维的方法可以包括以下步骤：制备前述具有新型结构的聚合物；制备包含该聚合物、添加剂和光引发剂的聚合物前驱体；和静电纺丝该聚合物前体。

聚合物前驱体可以是本公开的聚合物、聚(环氧乙烷)(PEO)、4臂聚(乙二醇)硫醇(4臂PEG-SH)、光引发剂和碱的混合物。在这个聚合物前驱体混合物中，可以包含浓度1至50％(w/v)的聚合物。当由这样浓度的聚合物来制作时，用于存储和释放一氧化氮的纳米纤维能够覆盖各种浓度的一氧化氮的存储和释放，并为此优化了释放时间。

基于聚合物前驱体混合物的总重量，可以包含0.1％(w/v)至10％(w/v)的量的PEO。PEO的分子量可以为1,000至1,000,000g/mol。

基于聚合物前驱体混合物的总重量，可以包含0.1％(w/v)至10％(w/v)的量的4臂PEG-SH。4臂PEG-SH的分子量可以在1,000至1,000,000g/mol的范围内。可以采用线性PEG-SH和6臂PEG-SH中的一个或两者一起来代替4臂PEG-SH。

光引发剂可以是Irgacure 2959。可以使用浓度为0.01％(w/v)至10％(w/v)的Irgacure 2959。

碱可以包括选自以下项中的至少一项：氢氧化铵(NH₄OH)、甲醇钠(NaOMe)、乙醇钠(NaOEt)、丙醇钠(NaOPr)。纳米纤维可以根据所添加的碱的种类和摩尔浓度改变一氧化氮的存储和释放曲线。换言之，为了以存储和释放所需浓度范围的一氧化氮，可以调整添加至聚合物前驱体的碱的种类和摩尔浓度。

参考图3和4，聚合物前驱体可以进行静电纺丝。静电纺丝是可能受到包括聚合物浓度、表面张力、电导率、溶剂、施加电压、流速、针规等各种参数影响的一种复杂工艺。

该方法可以在静电纺丝步骤之前或之后增加光聚合步骤。光聚合步骤可以使纳米纤维的结构稳定。

下文中，将参考示例和实验示例详细描述本公开。然而，下面的示例和实验示例是为说明，而不应被解释为限制本公开。

示例

步骤1：甲基丙烯酸透明质酸(MA-HA)的合成

将500mg透明质酸(HA)(40kDa)溶解在50mL过滤的去离子水(DIW)中，制成1％(w/v)的HA溶液。将5倍摩尔过量(0.931mL)的甲基丙烯酸酐添加到溶液中，并在黑暗中于4℃下反应12小时，同时使用5N或1N的NaOH保持pH在8至11之间。最终产物(HA-MA)在10倍过量的冷乙醇(EtOH)中沉淀。在4℃下以5,000rpm离心5分钟后，除去上清液，并将沉淀重新溶解在50mL DIW中。为了除去未反应的试剂，通过使用透析膜(截止浓度为3.5kDa Mw)对DIW进行透析3天来纯化MA-HA。

步骤2：MA-HA-TBA的合成

将15g(75mmol)Dowex 50WX-8-400离子交换树脂与250mL DIW悬浮在500mL圆烧瓶中。然后，向圆烧瓶中的Dowex树脂中添加29.335mL TBA-OH(112.5mmol，1.5摩尔过量)，然后反应30分钟。使用滤纸和真空泵过滤Dowex-TBA树脂以除去杂质。为了进行pH归一化，用足量的DIW洗涤树脂。随后，将100mL DIW中的500mg纯化的MA-HA转移到250mL圆烧瓶中，将制备的Dowex-TBA树脂(6.25g，5摩尔过量)倒入MA-HA溶液中。混合3小时后，首先将形成的产物(MA-HA-TBA)通过滤纸过滤，然后通过0.45μm过滤器过滤以除去Dowex树脂。其后，将产物冻干3天，并保存在-20℃下直至进一步使用。

步骤3：(MEDN)-NONOate的合成

将0.4593mL(5.0mmol)的N-MEDN和0.9259mL(5.0mmol)的NaOMe溶解在3.6148mL的EtOH中，使总体积为5mL。将所得溶液置于密闭腔室中并暴露于10atm的NO气体中3天。用Ar吹扫腔室后，将溶液从腔室中抽出，真空密封，然后保存在冰箱中。

步骤4：MA-HA-(MEDN)-NONOate的合成

将0.2g(0.5mmol二聚体，1当量)的MA-HA-TBA溶解在20mL DMSO中。向这个溶液中，例如，依次加入EDC 0.221mL(MW＝155.24g·mol^-1，1.25mmol，2.5当量)，NHS 0.1438g(MW＝115.09g·mol^-1，1.25mmol，2.5当量)和(MEDN)-NONOate 3.5mL(3.5mmol，7当量)，并在25℃下混合3小时。添加到MA-HA-TBA中的每种反应物的量可以变化以实现将透明质酸的羧基改性成NONOate基团。最后，将反应产物在过量的二乙醚中沉淀，用二乙醚充分洗涤。在冷真空条件下将MA-HA-(MEDN)-NONOate干燥3小时，以蒸发掉有机残留物，然后将其储存在-20℃的密封容器中直至使用。

步骤5：纳米纤维的合成

为了合成纳米纤维，如下制备用于静电纺丝的聚合物前驱体。依次将2％(w/v)的PEO作为共混聚合物和2％(w/v)的4臂PEG-SH作为交联剂溶解在DIW/NH₄OH混合物中(体积比为1:1)。将0.1％(w/v)的Irgacure 2959作为光引发剂添加到此所得的聚合物溶液中，使用1N HCl将聚合物溶液的pH值调节至11，并且将4、7或10％(w/v)的MA-HA-(MEDN)-NONOate加入到聚合物前驱体溶液中。然后，将上面制备的混合溶液装入塑料注射器中并且流过25号针，使用高压电源(ESR200PR2D，NanoNC Co.，韩国首尔)按照以下条件制作纳米纤维：体积流量为20μL·min^-1，施加电压为17.5kV，针尖到收集器的距离为15cm。静电纺丝后，通过使用UV LED灯将静电纺丝纳米纤维光交联5分钟，真空密封，然后储存在-20℃的冰箱中。

实验示例1：MA-HA-(MEDN)-NONOate的表征

参考图1(A)，透明质酸的羟基通过步骤1被甲基丙烯酸基取代，以提供甲基丙烯酸透明质酸(MA-HA)。参考图1(B)，检测到甲基丙烯酸酯质子NMR峰在5.6和6.1ppm处。另外，检测到HA中的N-乙酰基的甲基质子NMR峰在1.9ppm处。

在步骤2中，使用离子交换树脂将MA-HA转化为四丁基铵盐(MA-HA-TBA)，以溶解在有机溶剂(例如，DMSO)中。由于NONOate基团易于在水溶液中分解，因此MA-HA-(MEDN)-NONOate的合成过程应在有机溶剂条件下进行，以最大程度地减少NONOate的分解。参照图1(A)和图1(B)，TBA结合过程没有影响甲基丙烯酸基的改性，正如反应之前和之后的甲基丙烯酸酯质子峰所表明的那样，表明了MA-HA-TBA的可靠合成。此外，TBA质子NMR峰出现在3.0ppm和1.5至0.7ppm处。

如图1(B)所示，MA-HA-MEDN-NONOate是通过MA-HA-TBA与预制的MEDN-NONOate的偶联反应合成的。

在图2(A)中，在FR-IR光谱中观察到了NONOate的特征峰。如图2(B)所示，通过UV-Vis光谱法确认了NONOate基团的形成。MA-HA-(MEDN)-NONOate在260nm处显示最大吸收，而MA-HA-(MEDN)在260nm处未显示任何比吸收峰。因此，数据证明了MA-HA-(MEDN)-NONOate的成功合成。

实验示例2：纳米纤维的表征

图5(A)示出了干态的纳米纤维的SEM图像和溶胀态的纳米纤维的共焦显微图像。从图像中，研究了纳米纤维的纤维形态、直径和溶胀行为。当在2％(w/v)的PEO共混的前驱体聚合物中MA-HA-(MEDN)-NONOate的含量从4％(w/v)增加到10％(w/v)时，成功地合成了具有与浓度相关的各种直径的均匀纳米纤维。在图5(B)中，在MA-HA-(MEDN)-NONOate含量分别为4％(w/v)、7％(w/v)和10％(w/v)的情况下，纳米纤维的平均直径为240±30nm、330±50nm和490±60nm。因此，已经发现通过静电纺丝生产的纳米纤维的直径随着MA-HA-(MEDN)-NONOate浓度的增加而增加。荧光标记的水合纳米纤维的纤维直径也通过共焦显微镜测量。纤维直径的分布变得更宽，4％(w/v)、7％(w/v)和10％(w/v)的MA-HA-(MEDN)-NONOate的平均直径分别增加至670±160nm、830±250nm和1320±320nm。由于HA具有吸水性能，因此纳米纤维中HA的含量越高，纳米纤维的直径越大。

实验示例3：一氧化氮的存储和释放曲线

根据MA-HA和(MEDN)-NONOate之间的摩尔比和静电纺丝聚合物前驱体中MA-HA-(MEDN)-NONOate的含量％(w/v)，评估纳米纤维的一氧化氮的存储和释放曲线。例如，在MA-HA与(MEDN)-NONOate之间的摩尔比＝1:7和10％(w/v)的MA-HA-(MEDN)-NONOate时，表示10％(w/v)的MA-HA:(MEDN)-NONOate＝1:7。

评估了t[NO](NO释放的总摩尔数)、t_1/2(NO释放的减半时间)、[NO]_m(NO释放的最大瞬时浓度)、t_m(达到[NO]_m所需的时间)和t_d(直至完成NO释放的NO持续时间)。结果总结在下表1中。

图6(A)和图6(B)示出了代表性实例随时间的一氧化氮的释放量和总释放量。

表1

参照表1和图6，纳米纤维的一氧化氮有效载荷受前驱体聚合物中的总MA-HA-(MEDN)-NONOate浓度和合成的MA-HA-(MEDN)-NONOate中MA-HA与(MEDN)-NONOate的比例的显着影响。

具体地，在固定的MA-HA-(MEDN)-NONOate浓度为7％(w/v)的情况下，t[NO]和[NO]_m的趋势为MA-HA:(MEDN)-NONOate＝1:2<1:5<1:7。即，t[NO]从20nmol·mg^-1增加到580nmol·mg^-1，[NO]_m从190ppb·mg^-1增加到7,230ppb·mg^-1。

此外，在固定的MA-HA:(MEDN)-NONOate＝1:7的条件下，前驱体溶液中MA-HA-(MEDN)-NONOate的浓度从4增加到10％(w/v)导致t[NO]和[NO]_m均显着增加。具体地，t[NO]从350nmol·mg^-1增加到620nmol·mg^-1，[NO]_m从4,460ppb·mg^-1增加到8,920ppb·mg^-1。

因此，如果释放一氧化氮的纳米纤维使用高浓度MA-HA-(MEDN)-NONOate(即，10％(w/v))或高摩尔比的HA主链聚合物NONOate基团(即，MA-HA:(MEDN)-NONOate＝1:7)来制作，则较高浓度的NONOate基团被包含在纤维中，导致较多量NONOate分解和较多NO释放以及延长的释放时间。

在本公开的各种实施例中，一氧化氮的有效荷载可以通过调整聚合物前驱体中MA-HA和(MEDN)-NONOate之间的摩尔比和MA-HA-(MEDN)-NONOate的含量％(w/v)被控制在5nmol·mg^-1至5,000nmol·mg^-1的范围内。

实验示例4：生物可降解性试验

因为体内应用，根据本公开的各种实施例的纳米纤维必须是生物可降解的。因为体内应用，植入的材料(缝合线、纱布或绷带型)应是生物可降解的，以便无需进行二次手术以取出植入物。为了评估纳米纤维对透明质酸酶(HAse)的生物降解能力，将纳米纤维放入PBS或HAse溶液(10-1000U·mL^-1)中，并监测失重百分比。参考图7，降解率随着HAse浓度的增加而增加。特别地，即使在与实际生物系统相似的酶浓度100U·mL^-1下，也检测到优异的生物降解性，表明了本发明的纳米纤维的体内适用性。

另外，测得的生物可降解性随着MA-HA-(MEDN)-NONOate的％(w/v)的增加而增加，即，随着纳米纤维中HA含量的增加而增加。

实验示例5：细胞毒性试验

使用由7％(w/v)MA-HA-(MEDN)-NONOate(MA-HA:(MEDN)-NONOate＝1:2，1:5，1:7)所制备的纳米纤维进行体内细胞毒性试验。如表1所示,基于7％(w/v)MA-HA:(MEDM)-NONOate＝1:2、1:5和1:7的纳米纤维的平均一氧化氮有效荷载分别是20、140和580nmol·mg^-1。在图8中，纳米纤维分别表示为[NO]₂₀NF、[NO]₁₄₀NF和[NO]₅₈₀NF。例如，[NO]₂₀NF表示每1mg纳米纤维释放的一氧化氮的量为20nmol。

由于它们在伤口愈合中的重要作用，评估了释放一氧化氮的纳米纤维对于作为模型细胞系的NIH/3T3成纤维细胞的有希望的治疗应用的细胞毒性。为了评估纳米纤维本身的毒性，制备了包含MA-HA-(MEDN)的纳米纤维作为阳性对照。作为另一个阳性对照(空白)，还制备了没有任何纳米纤维接触的细胞单层。

如图8(A)的上图所示，在第一天，确定空白、对照、[NO]₂₀NF、[NO]₁₄₀NF和[NO]₅₈₀NF的细胞活力分别为98.1、98.7、98.8、98.2和98.8％。在图8(A)的下图中，当成纤维细胞与释放一氧化氮的纳米纤维一起培养3天时，活/死图像显示出比对照组和空白组更快的增殖，具有更多的纺锤形。通过HA与甲基丙烯酸和含有NONOate基团的仲胺的化学结合，NONOate和交联化学物质不仅简单地物理截留在纳米纤维网络中，而且实际上被化学地固定在该网络中。同时，在生理环境下，NONOate分解并从纳米纤维中释放出一氧化氮，而其他化学物质则不易从纳米纤维中析出。因此，释放一氧化氮的纳米纤维和形成纳米纤维的化学物质对细胞无毒，从而减少了任何体内应用的潜在毒性问题。

实验示例6：细胞增殖试验

众所周知，一氧化氮参与创伤愈合。在这个实验示例中，在假定释放一氧化氮的纳米纤维对成纤维细胞的增殖有效的情况下进行细胞增殖试验。简要地，通过WST-8试验研究了纳米纤维对成纤维细胞增殖的定量作用。如图8(B)所示，[NO]₂₀NF、[NO]₁₄₀NF和[NO]₅₈₀NF的3天成纤维细胞增殖与空白组相比分别增加了5.3％、15.2％和18.5％。相反，对照组对细胞增殖的影响可忽略不计。这些结果表明，从纳米纤维释放的一氧化氮可以有效地为成纤维细胞增殖提供合适的环境。

实验示例7：细胞运动试验

为了研究根据本公开的各种实施例的纳米纤维的治疗潜力，进行了体外划痕测试。参考图9(A)中最上面一行的图像，刮擦单层成纤维细胞以建立体外创伤愈合模型(单线创伤部位)。在存在或不存在释放一氧化氮的纳米纤维的情况下，将刮擦的成纤维细胞培养12小时。在培养12h后，用[NO]₂₀NF、[NO]₁₄₀NF和[NO]₅₈₀NF处理的成纤维细胞的相对划痕区域分别重新繁殖34％、33％和49％。相反，如图9(B)所示，未处理(空白)或仅纳米纤维(对照)处理的成纤维细胞仅再繁殖22％和29％。如图9(B)和图9(C)所示，在培养36h后，相对于原始创伤，用[NO]₂₀NF、[NO]₁₄₀NF和[NO]₅₈₀NF处理的成纤维细胞显示出52、65和72％的明显改善的伤口闭合性。未经处理和仅纳米纤维处理的成纤维细胞显示出较低的创伤闭合效果，分别为33％和40％。另外，允许在60小时内形成均匀的单层细胞，所有释放一氧化氮的纳米纤维都促进了成纤维细胞的增殖。因此，根据本公开的各种实施例的纳米纤维可以发现驱使细胞运动，从而改善创伤愈合。因此，数据表明纳米纤维在创伤愈合应用方面具有治疗潜力。换言之，本公开的各种实施例在各种再生医疗领域中找到应用，包括灼伤处理、肾脏移植等等。

实验示例8：一氧化氮的释放曲线取决于添加到聚合物前驱体中的碱的种类和量

在合成纳米纤维的步骤5中，如下制备用于静电纺丝的聚合物前驱体，并且测定一氧化氮存储和释放曲线。

(1)据NH₄OH的摩尔浓度测定一氧化氮的储存和释放曲线

在制备聚合物前驱体时，以各种摩尔浓度添加NH₄OH作为碱。随后，测定静电纺丝的纳米纤维的一氧化氮释放曲线。

结果在下表2和图10中给出。从数据可知，随着NH₄OH摩尔浓度的降低，NO的释放总量和NO的最大通量均增加。

表2

t[NO]：NO释放总量

t_1/2：NO减半时间

[NO]_m：NO最大通量

t_m：到最大通量的时间

t_d：NO持续时间

(2)根据NaOMe的摩尔浓度测定一氧化氮的储存和释放曲线

在制备聚合物前驱体时，以各种摩尔浓度添加NaOMe作为碱。随后，测定静电纺丝的纳米纤维的一氧化氮释放曲线。

从表3和图11的数据可以看出，当NaOMe的摩尔浓度为1.35M时，NO的释放总量峰值达到1.30μmol·mg^-1，比NH₄OH(7.87M)高约两倍，这表明来自添加了NaOMe的聚合物前驱体的纳米纤维的一氧化氮存储容量非常高。此外，观察到NO释放总量随着NaOMe摩尔浓度从0.68M增加到1.35M而增加两倍或更多倍，但随着NaOMe摩尔浓度增加到2.7M和5.4M而减少。同时，当使用的NaOMe的摩尔浓度为2.7M，一氧化氮释放的持续时间为63.2hr，这是最长的。这个摩尔浓度被认为对于NO释放的长时间持续是有用的。

表3

(3)根据NaOEt的摩尔浓度测定一氧化氮的储存和释放曲线

在制备聚合物前驱体时，以各种摩尔浓度添加NaOEt作为碱。随后，测定静电纺丝的纳米纤维的一氧化氮释放曲线。

从表4和图12的数据可以看出，当使用的NaOEt的摩尔浓度为0.67M时，NO释放总量峰值为0.92μmol·mg^-1。观察到NO释放总量随着NaOEt摩尔浓度从0.34M增加到0.67M而增加，但随着NaOEt摩尔浓度增加到1.34M和2.68M而减少。

表4

(4)根据NaOPr的摩尔浓度测定一氧化氮的储存和释放曲线

在制备聚合物前驱体时，以各种摩尔浓度添加NaOPr作为碱。随后，测定静电纺丝的纳米纤维的一氧化氮释放曲线。

从表5和图13的数据可以看出，当使用的NaOPr的摩尔浓度为0.53M时，一氧化氮释放总量峰值为1.21μmol·mg^-1。观察到NO释放总量随着NaOPr摩尔浓度从0.28M增加到0.53M而增加两倍或更多，但随着NaOPr摩尔浓度增加到1.06M和2.11M而减少。

表5

试验示例8中获得的数据表明，能够根据一氧化氮在目标浓度下的量和持续时间来应用聚合物前驱体中所含的碱。

上述实施例中所描述的特征、结构、效果等包括本发明的至少一个实施例，但本发明不仅限于一个实施例。此外，本领域技术人员可以将每个实施例中所示的特征、结构、效果等进行组合或修改为其他实施例。因此，与该组合或修改有关的内容应当被解释为被包括在本公开的范围内。

此外，尽管参考示例性实施例具体描述了本公开，但本公开不限于此。本领域技术人员将理解，不脱离本公开的精神和范围，可以做出以上未示出的各种修改和应用。例如，可以修改和制造实施例中所示的每个部件。应当理解，与这些修改和应用有关的差异包括在本发明的所附权利要求中定义的范围内。