具体实施方式

实施例一：基于核酸适配体的卡那霉素快速检测试纸条的制备

具体步骤为：

1.适配体序列和探针的设计

为了确保生物素化的适配体能与探针上的核酸结合并且在T线区域能被SA捕获，选择不同序列的核酸链(polyA-DNA₍₂₀₎，polyA-DNA₍₁₅₎，polyA-DNA₍₅₊₁₀₎，polyA-DNA₍₅₊₅₎，polyA-DNA₍₁₀₊₅₎)与AuNPs偶联(如表1所示)。选用的相应的适配体浓度为0.5μM，加入相同浓度的卡那霉素(150ng/mL)。结果如图8所示，当在适配体序列的3’端连接多个T碱基时，能明显增加信号强度，信号最高可增强6倍，当应用核苷酸序列如SEQ ID NO.2的核酸探针链polyA-DNA₍₁₀₊₅₎时，对卡那霉素相应信号的变化(ΔT/C值)最大。因此，实验中应用的为探针链polyA-DNA₍₁₀₊₅₎。

表1卡那霉素适配体通用型LFS所用核酸序列

(带下划线或加粗的序列表示互补序列；加粗斜体序列表示适配体部分序列或其互补序列，加粗序列表示适配体延伸序列或其互补序列。)

polyA-DNA的设计：polyA-DNA有三个功能区。第一个功能区是polyA，其作为锚定块，将polyA-DNA锚定在金纳米粒子上；第二个功能区是与DNAc互补的区域，该区域无需特定的序列要求，与DNAc互补即可；第三个功能区是与核酸适配体部分互补的区域，辅助杂交。同时，要保证polyA-DNA自身序列不能互补。

DNAc的设计：如表1、表2中所示，DNAc序列划线处与polyA-DNA互补，并在3’端连有5个A碱基。

表2卡那霉素快速检测试纸条的DNA序列

(带下划线或加粗的序列表示互补序列；加粗序列表示适配体部分序列或其互补序列，加粗斜体序列表示适配体延伸序列或其互补序列。)

表3 OTA快速检测试纸条的DNA序列

(带下划线或加粗的序列表示互补序列；加粗序列表示适配体部分序列或其互补序列；加粗斜体序列表示适配体延伸序列或其互补序列。)

2.金纳米粒子(AuNPs)的制备及功能化

(1)AuNPs的制备

实验用于合成和储备纳米材料的玻璃器皿均用于王水(盐酸：硝酸＝3:1)浸泡12h，用超纯水洗涤干净后使用。

AuNPs的制备采用的是柠檬酸钠还原法。具体如下：

1)将100mL 0.01％的HAuCl₄加入250mL锥形瓶中，加热搅拌至溶液暴沸，保持1～2min。

2)向锥形瓶中迅速加入2mL 1％的柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌。溶液的颜色由浅黄色逐渐变为深紫色最后变成酒红色，保持加热10min，制备得到粒径15nm的AuNPs，将其冷却至室温后，4℃冷藏备用。

(2)AuNPs功能化

1)将5-15μL 100μM的polyA-DNA加入1mL步骤(1)中制备得到的AuNPs(10nM)中混合均匀，然后加入20μL 500mM的柠檬酸缓冲液(pH 3.0)。混合均匀后，在室温下孵育3min。

2)孵育完成后，加入60μLpH 7.6的500mM HEPES缓冲液，调整AuNPs溶液的pH为中性，然后在室温下孵育5-10min。

3)孵育完成后10000r/min离心20min，去上清，向沉淀物中加入重悬液复溶，10000r/min、20min重复离心三次除去未反应的核酸，最终加入400μL重悬液获得功能化的AuNPs，即探针[email protected]，4℃冷藏备用。

用透射电子显微镜分别对步骤(1)制备的AuNPs和步骤(2)制备的[email protected]进行表征，结果如图2所示，制备的粒径15nm的AuNPs在520nm处有单一的特征吸收峰，当与polyA-DNA结合时，最大吸收波长移至530nm，初步证明polyA-DNA成功修饰了AuNPs。

重悬液的组成：20mM Na₃PO₄，5％BSA，10％蔗糖，0.25％吐温-20。

3.链霉亲和素-生物素-DNAc的制备

(1)100μL 2.5mg/mL的链霉亲和素与100μL 250μM 5’端经生物素标记的DNAc混合并在4℃下孵育1h，获得混合液。

(2)使用超滤管(MWCO 30kDa)处理混合液，6000r/min 20min离心三次，重悬于300μL 10mM PBS中，获得链霉亲和素-生物素-DNAc，4℃储存备用。

4.核酸适配体试纸条的组装

(1)将样品垫和结合垫(金标垫)切成适当尺寸，加入10mM PBS浸泡30min，然后在45℃下干燥。

(2)将步骤1中制备得到的探针[email protected]均匀的喷涂在结合垫上，37℃干燥2h。

(3)在NC膜上用三维喷点仪器以0.9μL/cm的速度均匀喷涂链霉亲和素和步骤2制备的链霉亲和素-生物素-DNAc，分别作为检测区(T线)和控制区(C线)，检测区和控制区之间的距离固定在5mm，37℃干燥2h。

(4)将步骤(1)～(3)制备完成的样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫按图1依次粘贴在PVC板上，将组装好的试纸条均匀切割为4mm的宽度，放入分装袋中，密封保存。

实施例二：用试纸条对卡那霉素标准溶液的测定

(1)卡那霉素标准溶液的制备

卡那霉素标准溶液用Runningbuffer(4×SSC，pH 7)分别稀释终浓度为0.5、5、15、25、50、150、250和400ng/mL。用超纯水将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的卡那霉素适配体稀释至0.5μM。

(2)卡那霉素核酸试纸条检测标准曲线的建立：

将步骤(1)中99μL不同浓度的卡那霉素标准溶液与1μL卡那霉素适配体溶液混合孵育20min，混合反应后将混合液滴加入到样品垫进行检测，反应3min后测定(T/C)相对信号强度，建立(T/C)相对光信号强度与不同卡那霉素浓度之间对应关系的标准曲线。

结果如图3所示，当卡那霉素浓度为15ng/mL时，试纸条上T线的颜色能与不含卡那霉素的溶液(0ng/mL卡那霉素)的试纸条上的T线的颜色有明显的差异；在卡那霉素浓度为5～250ng/mL时T线颜色随卡那霉素浓度的增高而减弱，在卡那霉素浓度为250ng/mL时T线颜色基本没有变化，因此肉眼检测下限为15ng/mL，上限为250ng/mL。

胶体金试纸定量分析仪读取不同浓度卡那霉素的相对强度，得到如图4所示(T/C)相对光信号强度与卡那霉素浓度的变化关系曲线，最低检测线为0.3ng/mL。其中在5～250ng/mL浓度范围内，(T/C)相对光信号强度与浓度存在线性关系，线性回归方程为y＝-0.1637x+0.4341，R²＝0.9819，式中y为(T/C)相对光信号强度，x为卡那霉素的浓度的Log函数(ng/mL)。

实施例三：用试纸条对OTA标准溶液的测定

(1)OTA标准溶液的制备

OTA标准溶液用Running buffer(4×SSC，pH7)分别稀释终浓度为1、10、50、100、250和500ng/mL。用超纯水将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的OTA适配体稀释至0.5μM。

(2)OTA核酸试纸条检测标准曲线的建立：

将步骤(1)中99μL不同浓度的OTA标准溶液与1μL OTA适配体溶液混合孵育20min，混合反应后将混合液滴加入到样品垫进行检测，反应3min后测定(T/C)相对信号强度，建立(T/C)相对光信号强度与不同OTA浓度之间对应关系的标准曲线。

结果如图5所示，当OTA浓度为10ng/mL时，试纸条上T线的颜色能与不含OTA的溶液(0ng/mL OTA)的试纸条上的T线的颜色有明显的差异；在OTA浓度为1～250ng/mL时T线颜色随OTA浓度的增高而减弱，在OTA浓度为250ng/mL时T线颜色基本没有变化，因此肉眼检测下限为10ng/mL，上限为250ng/mL。

胶体金试纸定量分析仪读取不同浓度OTA的相对强度，得到如图6所示(T/C)相对光信号强度与OTA浓度的变化关系曲线，最低检测线为0.18ng/mL。其中在1～250ng/mL浓度范围内，(T/C)相对光信号强度与浓度存在线性关系，线性回归方程为y＝-0.151x+0.4371，R²＝0.9794，式中y为(T/C)相对光信号强度，x为OTA的浓度的Log函数(ng/mL)。

实施例四：蜂蜜样品中卡那霉素残留的检测

利用蜂蜜模拟样品来测试回收率，步骤为：

(1)[email protected]溶液预处理：将制备储藏的[email protected]添加0.8～1.4μL体积至试纸条金标垫上，存储于4℃。

(2)样品预处理：将蜂蜜样本稀释10倍，0.22μm微孔滤膜过滤。在蜂蜜中加入不同浓度的卡那霉素(50、150、250ng/mL)；

(3)蜂蜜中卡那霉素的回收率测定：取实施例1中核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述的卡那霉素适配体(0.5μM)1μL与步骤(2)中含不同浓度卡那霉素的蜂蜜溶液99μL混合孵育20min，混合反应后再采用试纸条进行检测。

应用实施例一制备得到的核酸适配体试纸条检测牛奶中卡那霉素的含量，结果如表4和图7所示。

表4蜂蜜样品中卡那霉素残留的检测

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种检测小分子物质的通用型适配体胶体金侧向层析试纸

<130> BAA210601A

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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