一种改性的新型抗菌树脂型窝沟封闭剂合成与检测方法
技术领域
本发明属于口腔临床
技术领域
，尤其涉及一种改性的新型抗菌树脂型窝沟封闭剂合成与检测方法。背景技术
目前，龋病是发病率最高的口腔疾病，中国儿童龋病的发病率高居儿童疾病首位。中国儿童龋病发病率高达40％～70％，其中窝沟龋超过80％。儿童乳磨牙和年轻恒牙咬合面窝沟的独特解剖生理特点，使得食物残渣和菌斑难以清洁，故龋病发展非常迅速。自1960年窝沟封闭技术开始应用于临床，窝沟封闭技术已被认可是一种预防乳磨牙和年轻恒磨牙窝沟龋的有效方法。
窝沟封闭剂的防龋效果与封闭剂的保留率直接相关，封闭剂的保留率受封闭材料的性能影响。目前应用于窝沟封闭的窝沟封闭剂材料主要分为光固化复合树脂与玻璃离子两大类。光固化复合树脂因良好的美观性能与优越的物理性能在临床中应用最为广泛。光固化复合树脂目前面临的临床挑战为：表面可能堆积更多的菌斑生物膜，存在聚合收缩，可使封闭剂与牙面之间形成微渗漏，不仅为微生物的侵入提供条件引起龋坏的发生，还易导致材料老化从而容易脱落。因此，为预防窝沟封闭后继发龋的发生，新型窝沟封闭剂应具备良好且长效的抗菌和抗老化性能。
临床上常用的窝沟封闭剂为以3M-Clinpro为代表的第四代产品，具有释放氟离子、良好的流动性等优点。研究发现其5年保留率为82％，10年保留率仅为57％。因此，其持续释放氟离子促进再矿化和抗菌的效果一直存在争议。季铵盐单体(Quaternary ammoniummonomers,QAMs)是一种广谱抗菌剂，广泛应用于工业、医疗、医药等领域。QAMs可以与粘接剂中的甲基丙烯酸酯成分形成聚合物网络，以此固定到渗透树脂中，发挥长效抗菌作用。目前QAMs的抗菌机制尚存在一些争议，普遍认为是QAMs可以结合到细菌细胞膜上，引起细菌的破裂溶解。二甲基氨基十二烷基甲基丙烯酸酯(Dimethylaminododecylmethacrylate,DMADDM)是一种新型季铵盐单体，已被添加到热凝树脂、粘接剂等材料中进行了系统的研究。研究表明，添加DMADDM的牙科材料，对不同阶段的口腔生物膜均具有一定的抑制作用，材料的机械性能不受明显影响。同时体外实验表明，添加DMADDM的材料对变异链球菌(Streptococcusmutans)、血链球菌(Streptococcussanguinis)、戈登链球菌(Streptococcusgordonii)三菌种生物膜的菌种平衡具有调节作用；并且已有相关研究发现，添加DMADDM的材料能延缓生物老化进程，达到抗老化的作用。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：树脂类窝沟封闭剂存在聚合收缩，导致微渗漏和局部生物膜堆积；现有的窝沟封闭剂长效防龋性能不足。
解决以上问题及缺陷的难度为：如何在不影响现有窝沟封闭剂聚合收缩、机械性能的前提下，解决抗菌性能不足的问题从而实现良好长效防龋性能。
解决以上问题及缺陷的意义为：本发明为了进一步提升光固化窝沟封闭剂的抗菌性能，提高封闭剂本身的防龋能力，现将DMADDM加入树脂窝沟封闭剂Clinpro中，利用其优良的抗菌性能。同时，利用口腔生物膜对改性后的窝沟封闭剂进行生物老化，以期改性后的窝沟封闭剂在保留良好材料性能的同时，具有长效、可重复的抗菌能力，从而有效预防窝沟龋发生。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种改性的新型抗菌树脂型窝沟封闭剂合成与检测方法。
本发明是这样实现的，一种改性的新型抗菌树脂型窝沟封闭剂合成与检测方法，所述改性的新型抗菌树脂型窝沟封闭剂合成与检测方法，包括：
步骤一，制备窝沟封闭剂，进行用量关系筛选；
步骤二，对制备的窝沟封闭剂进行性能检测，按照DMADDM的质量分数分组，分别对窝沟封闭剂的光固化深度、细胞毒性、表面粗糙度和显微硬度，每组5个样本；
步骤三，生物老化前后的抗菌性能检测；
步骤四，生物老化后的微渗漏检测，分别称取一定量窝沟封闭剂，按照0％，2.5％，5％，10％的质量分数加入DMADDM，备用。收集牙体完整无龋坏的离体第三磨牙，随机分为4组，每组纳入5个磨牙。
进一步，所述步骤一中，制备窝沟封闭剂的具体过程为：分别称取一定量窝沟封闭剂，按照0％，2.5％，5％，10％，20％，30％的质量分数加入DMADDM，避光混匀备用。
进一步，所述步骤二中，按照DMADDM的质量分数进行分组的具体过程为：
按照加入0％，2.5％，5％，10％DMADDM的质量分数分组，分别对窝沟封闭剂的光固化深度、细胞毒性、表面粗糙度和显微硬度，每组5个样本。
进一步，所述步骤二中，光固化深度检测实验具体过程为：
将制备好的不同组别的窝沟封闭剂放置入内径为4mm，高度为6mm的圆柱形模具中，光固化20秒；
取出固化样本，用薄纸擦去每一个样品顶部和底部未固化的液膜；
游标卡尺记录试样高度，该高度即为固化深度；
根据光固化深度检测结果，筛选出DMADDM加入窝沟封闭剂的最佳比例，含有10％以下的DMADDM不会影响树脂材料的光固化深度。
进一步，所述步骤二中，细胞毒性检测具体过程为：
将制备好的不同组别的窝沟封闭剂放置入内径为13mm，高度为1mm的圆柱形模具中，光固化20秒，后将制备好的样本放入去离子水浸泡24小时；
样本经环氧乙烷低温消毒后，放入细胞培养基中浸泡24小时，得到浸提液后过滤后，与培养液不同比例稀释备用；
将浸提液加入铺满人口腔角质细胞的96孔板中，细胞培养箱中培养24小时，加入CCK-8试剂，反应1小时后，酶标仪595nm波长下测其读数，得到细胞毒性。
进一步，所述培养液不同比例稀释具体为：32倍、64倍、128倍稀释。
进一步，所述步骤二中，表面粗糙度检测具体过程为：
样本制备：将制备好的不同组别的窝沟封闭剂放置入内径为13mm，高度为1mm的圆柱形模具中，光固化20秒；
将样本于原子力显微镜下检测，每个样本观测3个区域，得到表面形貌图像及平均粗糙度Ra值。
进一步，所述步骤二中，显微硬度检测具体过程为：
样本制备：将制备好的不同组别的窝沟封闭剂放置入内径为6mm，高度为1mm的圆柱形模具中，光固化20秒；
将样本置于去离子水中浸泡24小时后取出备用；
利用显微硬度仪记录维氏硬度，每个样本观测3个区域，每个区域加压20g，加压时间为10秒。
进一步，所述步骤三中，生物老化前后的抗菌性能检测具体过程为：
分别称取一定量窝沟封闭剂，按照0％，2.5％，5％，10％的质量分数加入DMADDM，每组6个样本，分为老化前组与老化后组；
分别按照2种方式处理：即刻MTT分析；将样本在培养唾液生物膜培养基中浸泡30天进行生物老化，每天更换培养液，然后进行MTT分析；
MTT分析结果反应的生物膜代谢活性，是反映材料抗菌性能的重要指标。
进一步，所述生物老化前后的表面生物膜代谢活性检测具体过程为：
以48孔板盖子作为模具制备窝沟封闭剂树脂片，将制备好的不同DMADDM质量分数的树脂取出，浸泡于去离子水中24小时后，用环氧乙烷低温消毒后备用；
将样本分为老化前组与老化后组，老化后组进行生物老化；
将窝沟封闭剂树脂片置于24孔板中，培养唾液生物膜24小时后将样本转移至新孔板中；
每孔加入1mL浓度为0.5mg/mL的新鲜MTT溶液，避光孵育1小时后，将样本转移至新孔板中；
每孔加入1mL二甲基亚砜溶液，置于摇床均匀摇动20分钟，使生物膜完全脱色，吹打均匀；
每孔取200μL溶液至96孔板，每组3个平行孔，使用酶标仪测量波长为540的OD值记为生物膜代谢活性。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明以改性后的树脂窝沟封闭剂材料的光固化深度对DMADDM与Clinpro的用量关系进行筛选，通过实验筛选出最佳用量范围。在此基础上，以细胞毒性、硬度、表面性能及抗菌性能等多个性能为指标，考察DMADDM对窝沟封闭剂材料性能及防龋性能的影响。同时，体外培养唾液生物膜，对改性后的树脂封闭剂进行生物老化，考察其老化后的抗菌能力，证明DMADDM单体改性后的树脂窝沟封闭剂在保留良好机械性与安全性的同时，具备长效持久的抗菌能力，从而提高树脂窝沟封闭剂对窝沟龋长效防龋的能力。
同时本发明利用DMADDM可共价结合树脂单体的能力与其抗菌能力，对树脂窝沟封闭剂的抗菌改性。改性后的窝沟封闭剂在不影响其原有材料性能及安全性的基础上，实现了有效的抗菌防龋能力。同时，改性后的树脂封闭剂材料也能有效对抗口腔生物膜的老化作用，在保留其优越机械性能的同时，具备长效、可持续的抗菌作用，弥补了现有窝沟封闭剂长效防龋性能方面的不足。本发明开发的季铵盐改性窝沟封闭剂具有长效抗菌功能，可有效提高防龋成功率，有望成为临床理想的新型窝沟封闭材料。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的改性的新型抗菌树脂型窝沟封闭剂合成与检测方法流程图。
图2是本发明实施例提供的含不同质量分数DMADDM改性的抗菌窝沟封闭剂的光固化深度示意图。
图3是本发明实施例提供的含不同质量分数DMADDM改性的抗菌窝沟封闭剂的细胞毒性示意图。
图4是本发明实施例提供的含不同质量分数DMADDM改性的抗菌窝沟封闭剂的表面粗糙度示意图。
图5是本发明实施例提供的含不同质量分数DMADDM改性的抗菌窝沟封闭剂的显微硬度示意图。
图6是本发明实施例提供的含不同质量分数DMADDM改性的抗菌窝沟封闭剂经生物老化前后的表面生物膜代谢活性示意图。
图7是本发明实施例提供的含不同质量分数DMADDM改性的抗菌窝沟封闭剂经生物老化后的微渗漏评分示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种改性的新型抗菌树脂型窝沟封闭剂合成与检测方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的改性的新型抗菌树脂型窝沟封闭剂合成与检测方法，包括：
S101：制备窝沟封闭剂，进行用量关系筛选。
S102：对制备的窝沟封闭剂进行性能检测，按照DMADDM的质量分数分组，分别对窝沟封闭剂的光固化深度、细胞毒性、表面粗糙度和显微硬度，每组5个样本。
S103：生物老化前后的抗菌性能检测。
S104：生物老化后的微渗漏检测，分别称取一定量窝沟封闭剂，按照0％，2.5％，5％，10％的质量分数加入DMADDM，备用。收集牙体完整无龋坏的离体第三磨牙，随机分为4组，每组纳入5个磨牙。
本发明实施例提供的S101中，制备窝沟封闭剂的具体过程为：分别称取一定量窝沟封闭剂，按照0％，2.5％，5％，10％，20％，30％的质量分数加入DMADDM，避光混匀备用。
本发明实施例提供的S102中，按照DMADDM的质量分数进行分组的具体过程为：
按照加入0％，2.5％，5％，10％DMADDM的质量分数分组，分别对窝沟封闭剂的光固化深度、细胞毒性、表面粗糙度和显微硬度，每组5个样本。
本发明实施例提供的S102中，光固化深度检测实验具体过程为：
将制备好的不同组别的窝沟封闭剂放置入内径为4mm，高度为6mm的圆柱形模具中，光固化20秒；
取出固化样本，用薄纸擦去每一个样品顶部和底部未固化的液膜；
游标卡尺记录试样高度，该高度即为固化深度；
根据光固化深度检测结果，筛选出DMADDM加入窝沟封闭剂的最佳比例，含有10％以下的DMADDM不会影响树脂材料的光固化深度。
本发明实施例提供的S102中，细胞毒性检测具体过程为：
将制备好的不同组别的窝沟封闭剂放置入内径为13mm，高度为1mm的圆柱形模具中，光固化20秒，后将制备好的样本放入去离子水浸泡24小时；
样本经环氧乙烷低温消毒后，放入细胞培养基中浸泡24小时，得到浸提液后过滤后，与培养液不同比例稀释备用(32倍、64倍、128倍稀释)。
将浸提液加入铺满人口腔角质细胞(HOK)的96孔板中，细胞培养箱中培养24小时，加入CCK-8试剂，反应1小时后，酶标仪595nm波长下测其读数，得到细胞毒性。
本发明实施例提供的S102中，表面粗糙度检测具体过程为：
样本制备：将制备好的不同组别的窝沟封闭剂放置入内径为13mm，高度为1mm的圆柱形模具中，光固化20秒。
将样本于原子力显微镜下检测，每个样本观测3个区域，得到表面形貌图像及平均粗糙度Ra值。
本发明实施例提供的S102中，显微硬度检测具体过程为：
样本制备：将制备好的不同组别的窝沟封闭剂放置入内径为6mm，高度为1mm的圆柱形模具中，光固化20秒；
将样本置于去离子水中浸泡24小时后取出备用；
利用显微硬度仪记录维氏硬度，每个样本观测3个区域，每个区域加压20g，加压时间为10秒。
本发明实施例提供的S103中，生物老化前后的抗菌性能检测具体过程为：
分别称取一定量窝沟封闭剂，按照0％，2.5％，5％，10％的质量分数加入DMADDM，每组6个样本，分为老化前组与老化后组，分别按照2种方式处理：(1)即刻MTT分析；(2)将样本在培养唾液生物膜培养基中浸泡30天进行生物老化，每天更换培养液，然后进行MTT分析；MTT分析结果反应的生物膜代谢活性，是反映材料抗菌性能的重要指标。
其中，生物老化前后的表面生物膜代谢活性检测
以48孔板盖子作为模具制备窝沟封闭剂树脂片，将制备好的不同DMADDM质量分数的树脂取出，浸泡于去离子水中24小时后，用环氧乙烷低温消毒后备用；
将样本分为老化前组与老化后组，老化后组进行生物老化。
将窝沟封闭剂树脂片置于24孔板中，培养唾液生物膜24小时后将样本转移至新孔板中。
每孔加入1mL浓度为0.5mg/mL的新鲜MTT溶液，避光孵育1小时后，将样本转移至新孔板中。
每孔加入1mL二甲基亚砜(DMSO)溶液，置于摇床均匀摇动20分钟，使生物膜完全脱色，吹打均匀。
每孔取200μL溶液至96孔板，每组3个平行孔，使用酶标仪测量波长为540的OD值记为生物膜代谢活性。
下面结合实验对本发明的技术方案作进一步的描述。
1材料、仪器
树脂窝沟封闭剂Clinpro((3M ESPE,St.Paul,MN,USA),DMADDM(二甲基氨基十二烷基甲基丙烯酸酯(Dimethylaminododecylmethacrylate)，离体人磨牙，HOK细胞，SHI培养基，MTT(甲基噻唑基四唑)；显微硬度仪，酶标仪，原子力显微镜，细胞培养箱，细菌培养箱、恒温箱，电子天平，模具等。
2窝沟封闭剂制备和用量关系筛选、性能检测、生物老化前后的抗菌性能检测以及生物老化后的微渗漏检测
2.1窝沟封闭剂的制备和用量关系筛选
分别称取一定量窝沟封闭剂，按照0％，2.5％，5％，10％，20％，30％的质量分数加入DMADDM，避光混匀备用。
光固化深度检测实验
将制备好的不同组别的窝沟封闭剂放置入内径为4mm，高度为6mm的圆柱形模具中，光固化20秒。
取出固化样本，用薄纸擦去每一个样品顶部和底部未固化的液膜。
游标卡尺记录试样高度，该高度即为固化深度。
根据光固化深度检测结果，筛选出DMADDM加入窝沟封闭剂的最佳比例，含有10％以下的DMADDM不会影响树脂材料的光固化深度。
2.2性能检测
按照加入0％，2.5％，5％，10％DMADDM的质量分数分组，分别对窝沟封闭剂的光固化深度、细胞毒性、表面粗糙度和显微硬度，每组5个样本。
2.2.1细胞毒性实验
将制备好的不同组别的窝沟封闭剂放置入内径为13mm，高度为1mm的圆柱形模具中，光固化20秒，后将制备好的样本放入去离子水浸泡24小时。
样本经环氧乙烷低温消毒后，放入细胞培养基中浸泡24小时，得到浸提液后过滤后，与培养液不同比例稀释备用(32倍、64倍、128倍稀释)。
将浸提液加入铺满人口腔角质细胞(HOK)的96孔板中，细胞培养箱中培养24小时，加入CCK-8试剂，反应1小时后，酶标仪595nm波长下测其读数，得到细胞毒性。
2.2.2表面粗糙度
样本制备：将制备好的不同组别的窝沟封闭剂放置入内径为13mm，高度为1mm的圆柱形模具中，光固化20秒。
将样本于原子力显微镜下检测，每个样本观测3个区域，得到表面形貌图像及平均粗糙度Ra值。
2.2.3显微硬度检测
样本制备：将制备好的不同组别的窝沟封闭剂放置入内径为6mm，高度为1mm的圆柱形模具中，光固化20秒。
将样本置于去离子水中浸泡24小时后取出备用。
利用显微硬度仪记录维氏硬度，每个样本观测3个区域，每个区域加压20g，加压时间为10秒。
2.3生物老化前后的抗菌性能检测
分别称取一定量窝沟封闭剂，按照0％，2.5％，5％，10％的质量分数加入DMADDM，每组6个样本，分为老化前组与老化后组，分别按照2种方式处理：(1)即刻MTT分析；(2)将样本在培养唾液生物膜培养基中浸泡30天进行生物老化，每天更换培养液，然后进行MTT分析；MTT分析结果反应的生物膜代谢活性，是反映材料抗菌性能的重要指标。
其中，生物老化前后的表面生物膜代谢活性检测
以48孔板盖子作为模具制备窝沟封闭剂树脂片，将制备好的不同DMADDM质量分数的树脂取出，浸泡于去离子水中24小时后，用环氧乙烷低温消毒后备用；
将样本分为老化前组与老化后组，老化后组进行生物老化。
将窝沟封闭剂树脂片置于24孔板中，培养唾液生物膜24小时后将样本转移至新孔板中。
每孔加入1mL浓度为0.5mg/mL的新鲜MTT溶液，避光孵育1小时后，将样本转移至新孔板中。
每孔加入1mL二甲基亚砜(DMSO)溶液，置于摇床均匀摇动20分钟，使生物膜完全脱色，吹打均匀。
每孔取200μL溶液至96孔板，每组3个平行孔，使用酶标仪测量波长为540的OD值记为生物膜代谢活性。
(4)生物老化后的微渗漏检测
分别称取一定量窝沟封闭剂，按照0％，2.5％，5％，10％的质量分数加入DMADDM，备用。收集牙体完整无龋坏的离体第三磨牙，随机分为4组，每组纳入5个磨牙。图7是本发明实施例提供的含不同质量分数DMADDM改性的抗菌窝沟封闭剂经生物老化后的微渗漏评分示意图。
A、微渗漏检测
1、样本制备：清洁磨牙表面，35％磷酸酸蚀磨牙表面30秒，水冲洗15秒，干燥15秒。磨牙窝沟内涂布含有不同质量分数DMADDM的窝沟封闭剂，光固化20秒。
2、磨牙样本使用环氧乙烷低温消毒。
3、生物老化：磨牙样本置于无菌离心管中。唾液与SHI培养基1：50稀释后，在装有磨牙样本的离心管中加入5mL的唾液培养基混合液，培养唾液生物膜。将样本在培养唾液生物膜培养基中浸泡30天进行生物老化，每天更换培养液。
4、染色：取出生物老化后的磨牙样本，水洗后干燥。在距离封闭剂1mm以外的牙表面均匀涂抹指甲油，干燥后的磨牙样本浸泡入0.5％的品红溶液，置于37℃恒温箱中24小时后取出样本，水洗30秒。
5、采用慢速切割机，从合面中央沿牙长轴将磨牙样本纵向切开。
6、将牙齿切片在体式显微镜下进行观察染料渗入情况，每一个切片记为一个样本，每组10个样本。采用如下评分等级评价微渗漏情况：0分—无染料渗入；1分—染料渗入深度达到窝沟深度的1/3；2分—染料渗入深度达到窝沟深度的2/3；3分—染料渗入深度达到窝沟底部。记录每组评分。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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