分子印迹检测氯霉素的电化学传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及氯霉素的检测
技术领域
，尤其涉及的是一种分子印迹检测氯霉素的电化学传感器及其制备方法和应用。背景技术
氯霉素(CAP)是一种抑菌性广谱抗生素，对革兰阳性、阴性细菌均有抑制作用，常用于治疗伤寒杆菌、大肠杆菌等感染。由于氯霉素具有成本低、效力高、活性强、易于获得等特点，被广泛应用于动物的疾病治疗中。氯霉素的使用可能会导致在动物源性食品中残留氯霉素药物。另外，氯霉素还可与人体线粒体结合，抑制人体线粒体的蛋白合成。2019年氯霉素被列入食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单。氯霉素的检测手段通常有气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱/质谱法等，这些方法可以准确有效地进行检测，但往往需要耗时的前处理，昂贵的仪器、以及技术娴熟的运作者等。电化学方法具有易操作、低价、高选择性、便于携带等特点，可用于检测毒品、农药、霉菌等，引起了人们的广泛注意。
分子印迹技术因具有良好的选择性和化学稳定性，近年来引起了广泛的关注。基于分子印迹的电化学传感器能够选择性识别并检测目标化合物，且制作简单、灵敏度高、价格低廉、携带方便，在临床诊断、食品分析等方面应用的越来越广。
发明内容
为了克服上述现有技术中的问题，本发明的第一个目的是提供一种分子印迹检测氯霉素的电化学传感器及器制备方法，基于Ppy-Mip/Uio-66-CDs/GCE传感器Ppy分子与CAP分子之间氢键的形成与断裂，实现了模板CAP的洗脱以及空腔的生成，实现了对氯霉素的定量检测，具有检测灵敏度高、检测速度快、使用方便的优点。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种分子印迹检测氯霉素的电化学传感器，包括Uio-66-CDs/GCE修饰电极，及以功能单体和模板分子氯霉素CAP电聚合后再洗脱除去CAP分子后形成在所述Uio-66-CDs/GCE修饰电极表面的氯霉素分子印迹聚合物薄膜，所述Uio-66-CDs/GCE修饰电极包括玻碳电极和包覆在玻碳电极表面的金属有机框架Uio-66与碳量子点CDs的复合物；所述Uio-66与碳量子点CDs的质量比为1～2:1～4。Uio-66除了具备其它MOF材料的高空隙率、高比表面积和强吸附作用，Uio-66形貌呈正八面体结构，且十分稳定，与CDs形成复合物，可以改善CDs产生团聚效应和增加传感器的有效结合点数量，同时，Uio-66协同CDs具有双信号放大作用，使电化学传感器获得更高的灵敏度。
作为优选，Uio-66-CDs/GCE修饰电极通过如下方法制得：将Uio-66和CDs在DMF混合并超声直至形成均匀的悬浮液，将悬浮液滴至玻碳电极表面并室温干燥，得到所述Uio-66-CDs/GCE修饰电极。仅通过将Uio-66与CDs按设定质量比溶解并超声形成悬浮液，再滴至玻碳电极表面并室温干燥，得到所述Uio-66-CDs/GCE修饰电极，方法简单且为氯霉素的较高检测灵敏度提供保障。
更近一步的，所述Uio-66和CDs悬浮液的浓度为1.0～2.5mg/mL；
进一步限定了Uio-66的制备方法：将ZrCl4、对苯二甲酸溶解在DMF中，混合物转移至衬有特氟龙的高压釜中，120℃加热48h，冷却至室温，离心收集固体产物，甲醇洗涤，真空干燥24h，干燥温度120℃。
进一步限定了CDs的制备方法：将柠檬酸和乙二胺溶解在超纯水搅拌形成均匀的透明溶液，之后转移到聚四氟乙烯高压釜中200℃反应5h，反应完成后冷却至室温，将高压釜中的液体转到透析膜在超纯水中透析，将膜中的液体离心，冷冻干燥。
上述分子印迹检测氯霉素的电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：将Uio-66-CDs/GCE修饰电极浸在含功能单体和CAP的PBS缓冲液中，在三电极体系下将功能单体与模板分子CAP电聚合到Uio-66-CDs/GCE修饰电极表面形成功能聚合物-氯霉素薄膜，用洗脱剂(优选甲醇与乙酸的混合液)去除功能聚合物-氯霉素薄膜中的氯霉素，得氯霉素分子印迹聚合物薄膜，即得到所述印迹检测氯霉素的电化学传感器。
具体的，功能单体可以为吡咯，邻苯二胺，苯胺，甲基丙烯酸等，本申请优选吡咯，且当功能单体为吡咯时，功能聚合物-氯霉素薄膜记为Ppy-氯霉素薄膜，印迹检测氯霉素的电化学传感器记为Ppy-Mip/Uio-66-CDs/GCE。
进一步的，所述含Py和CAP的PBS缓冲液中Py的浓度为1×10-4mol/L，CAP的浓度为1×10-3mol/L。
本发明的第二个目的是提供上述分子印迹检测氯霉素的电化学传感器的应用方法，包括如下步骤：
以Ppy-Mip/Uio-66-CDs/GCE作为分子印迹电化学电化学传感器的工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系进行电化学检测氯霉素。
作为上述技术方案的优选，其具体步骤如下：
步骤A1.含不同浓度CAP标准溶液的配制：
将氯霉素用PH＝7.0的磷酸盐缓冲液配制1.0×10-4mol/L溶液后稀释成一系列不同浓度的氯霉素标准溶液，浓度范围为1.0×10-13mol/L～1.0×10-10mol/L；
步骤A2.标准曲线的绘制：
将修饰电极Ppy-Mip/Uio-66-CDs/GCE作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，将三电极体系置于步骤A2制备的一系列不同浓度氯霉素标准溶液中重新结合一定时间，并以含氯化钾的铁氰化钾溶液作为电化学循环伏安探针，在-0.2-0.6V的电化学窗口范围内，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录电位-电流曲线。同时，以含氯化钾的铁氰化钾溶液作为电化学循环伏安的探针，在电压为0.2V，振幅为10mV，频率为0.1-105Hz条件下进行电化学阻抗扫描。利用ZSimDemo.软件对阻值数据进行拟合，建立加入氯霉素前后的电阻Rct差值与氯霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；
步骤A3.样品检测：
样品先经过前处理，按照与步骤A3同样的分子印迹测试条件进行测试。拟合后的阻值，用步骤A3所得的标准曲线所对应的线性回归方程计算出待测样品中氯霉素的浓度。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明传感器具有检测灵敏度高、检测速度快、特异性强、线性范围宽、使用方便的优点。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明的分子印迹电化学电化学传感器Ppy-Mip/Uio-66-CDs/GCE的制备以及对氯霉素检测的简要流程图；
图2是本发明实施例1的分子印迹电化学电化学传感器Ppy-Mip/Uio-66-CDs/GCE在不同制备阶段下的阻值变化曲线，图中a对应的是GCE的阻值变化曲线，b对应实施例1步骤(2)中制得的Uio-66-CDs/GCE修饰电极的阻值变化曲线，c对应实施例1步骤2电聚合后的产物(Ppy-氯霉素膜)的阻值变化曲线，d对应实施例1步骤(2)中制备的传感器的阻值变化曲线，e对应的是实施例1制备的传感器在电化学检测氯霉素后也即吸附结合CAP分子后的阻值变化曲线(对应的氯霉素溶液的浓度是10-10mol/L)，f对应的是吡咯电聚合物Ppy膜的阻值变化曲线，g对应的是对比实施例2制备的传感器的阻值变化曲线，h对应的是对比实施例2制备的传感器在电化学检测氯霉素后也即吸附结合CAP分子后的阻值变化曲线；结合图2可知：电聚合后，在电极表面形成了一层Ppy-CAP膜，阻碍了铁氰化钾的电子转移，使阻值增大。阻值在6000左右的变化曲线表示为重新结合CAP分子，洗脱CAP后的阻值减小，说明铁氰化钾探针又可以重新到达电极表面，说明电极表面形成CAP的空腔。洗脱CAP后阻值增大，说明铁氰化钾探针因特异性结合CAP而难以到达电极表面。
图3是本发明实施例1至4及对比实施例1中制备的Uio-66和CDs的不同质量比(1:4；1:2；1:1；2:1；4:1)时Uio-66-CDs/GCE修饰电极的循环伏安曲线；
图4为本发明实施例中加入不同浓度氯霉素前后实施例制备的传感器阻值变化图，浓度为10-10～10-13mol/L；
图5是加入不同浓度氯霉素前后实施例制备的传感器阻值变化的标准曲线。
具体实施方式
本发明不局限于下列具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明下面结合实施例作进一步详述：
实施例1：
一种分子印迹检测氯霉素的电化学传感器的制备及应用方法
一种分子印迹检测氯霉素的电化学传感器的制备方法：
(1)Uio-66-CDs的制备方法：
S1.将ZrCl4、对苯二甲酸溶解在DMF中，混合物转移至衬有100mL特氟龙的高压釜中，120℃加热48h，冷却至室温，离心收集固体产物，甲醇洗涤，真空干燥24h，120℃；
S2.将柠檬酸和乙二胺溶解在10mL的超纯水搅拌10分钟形成均匀的透明溶液。之后转移到50mL聚四氟乙烯高压釜中200℃反应5h。反应完成后冷却至室温，将高压釜中的液体转到透析膜在超纯水中透析。将膜中的液体离心，冷冻干燥；
S3.将1mg Uio-66和1mg CDs在2mL DMF混合并超声直至形成均匀的悬浮液，得到所述Uio-66-CDs；
S4：取25mL已配好的PBS，用微量进样器移取7.0μL的Py，准确称取0.8mg的CAP，三者混合后超声搅拌10分钟配制成含1×10-4mol/L的Py和1×10-3mol/L的CAP的磷酸盐缓冲液。
(2)Ppy-Mip/Uio-66-CDs/GCE电化学传感器的制备方法是：
将玻碳电极抛光，依次用硝酸、无水乙醇和去离子水分别超声，用微量进样器移取Uio-66-CDs的DMF溶液滴于玻碳电极表面，室温干燥，得到Uio-66-CDs/GCE修饰电极；将Uio-66-CDs/GCE表面重新结合在含Py和CAP的PBS中，在传统三电极体系下将功能单体Py与模板分子CAP电聚合到电极表面形成Ppy-氯霉素薄膜；然后在甲醇乙酸混合液中洗脱模板形成Ppy-Mip/Uio-66-CDs/GCE传感器，洗脱模板后的将Ppy-Mip/Uio-66-CDs/GCE传感器电极可以通过氢键特异性地结合CAP分子。
本发明提供的一种分子印迹检测氯霉素的电化学传感器的应用方法：
Ppy-Mip/Uio-66-CDs/GCE作为分子印迹电化学电化学传感器的工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系进行电化学检测氯霉素。
作为上述技术方案的优选，其具体步骤如下：
A1.含不同浓度CAP标准溶液的配制：
将氯霉素用PH＝7.0的磷酸盐缓冲液配制1.0×10-4mol/L溶液后稀释成一系列不同浓度的氯霉素标准溶液，浓度范围为1.0×10-13mol/L～1.0×10-10mol/L；
A2.标准曲线的绘制：
将修饰电极Ppy-Mip/Uio-66-CDs/GCE作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系。将三电极体系置于步骤A2制备的一系列不同浓度氯霉素标准溶液中重新结合一定时间，并以含氯化钾的铁氰化钾溶液作为电化学循环伏安探针，在-0.2-0.6V的电化学窗口范围内，扫速0.1V/s，进行循环伏安扫描，记录电位-电流曲线。同时，以含氯化钾的铁氰化钾溶液作为电化学循环伏安的探针，在电压为0.2V，振幅为10mV，频率为0.1-105Hz条件下进行电化学阻抗扫描。利用ZSimDemo.软件对阻值数据进行拟合，建立加入氯霉素前后的电阻Rct差值与氯霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；
将三电极体系置于一系列氯霉素浓度(1.0×10-13mol/L、5.0×10-12mol/L、1.0×10-12mol/L、5.0×10-11mol/L、1.0×10-11mol/L、5.0×10-10mol/L、1.0×10-10mol/L)的0.1mol/L PBS的缓冲溶液中。以含氯化钾的铁氰化钾溶液作为电化学循环伏安的探针，在电压为0.2V，振幅为10mV，频率为0.1-105Hz条件下进行电化学阻抗扫描。建立加入氯霉素前后的阻值(Rct)差值与氯霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程为：y＝1174.9x+16341.2，相关系数(R)为R2＝0.9959。线性回归方程的检测范围为10-13-10-10mol/L，CAP的最低检测限为6.2×10-14mol/L。
A3.样品检测：
样品先经过前处理，按照与步骤A3同样的分子印迹电化学分析测试条件进行测试。拟合后的阻值，用步骤A3所得的标准曲线所对应的线性回归方程计算出待测样品中氯霉素的浓度。
实施例2
S1.具体操作同实施例1中的S1，具体的：将ZrCl4、对苯二甲酸溶解在DMF中，混合物转移至衬有100mL特氟龙的高压釜中，120℃加热48h，冷却至室温，离心收集固体产物，甲醇洗涤，真空干燥24h，120℃；
S2.具体操作同实施例1中的S2，具体的：将柠檬酸和乙二胺溶解在10mL的超纯水搅拌10分钟形成均匀的透明溶液。之后转移到50mL聚四氟乙烯高压釜中200℃反应5h。反应完成后冷却至室温，将高压釜中的液体转到透析膜在超纯水中透析。将膜中的液体离心，冷冻干燥；
S3.将2mg Uio-66和1mg CDs在2mL DMF混合并超声直至形成均匀的悬浮液，得到所述Uio-66-CDs。
实施例3
Uio-66-CDs的制备方法：
S1.具体操作同实施例1中的S1，具体的：将ZrCl4、对苯二甲酸溶解在DMF中，混合物转移至衬有100mL特氟龙的高压釜中，120℃加热48h，冷却至室温，离心收集固体产物，甲醇洗涤，真空干燥24h，120℃；
S2.具体操作同实施例1中的S2，具体的：将柠檬酸和乙二胺溶解在10mL的超纯水搅拌10分钟形成均匀的透明溶液。之后转移到50mL聚四氟乙烯高压釜中200℃反应5h。反应完成后冷却至室温，将高压釜中的液体转到透析膜在超纯水中透析。将膜中的液体离心，冷冻干燥；
S3.将1mg Uio-66和2mg CDs在2mL DMF混合并超声直至形成均匀的悬浮液，得到所述Uio-66-CDs。
实施例3
Uio-66-CDs的制备方法：
S1.具体操作同实施例1中的S1，具体的：将ZrCl4、对苯二甲酸溶解在DMF中，混合物转移至衬有100mL特氟龙的高压釜中，120℃加热48h，冷却至室温，离心收集固体产物，甲醇洗涤，真空干燥24h，120℃；
S2.具体操作同实施例1中的S2，具体的：将柠檬酸和乙二胺溶解在10mL的超纯水搅拌10分钟形成均匀的透明溶液。之后转移到50mL聚四氟乙烯高压釜中200℃反应5h。反应完成后冷却至室温，将高压釜中的液体转到透析膜在超纯水中透析。将膜中的液体离心，冷冻干燥；
S3.将1mg Uio-66和4mg CDs在2mL DMF混合并超声直至形成均匀的悬浮液，得到所述Uio-66-CDs。
对比实施例1
Uio-66-CDs的制备方法：
S1.具体操作同实施例1中的S1，具体的：将ZrCl4、对苯二甲酸溶解在DMF中，混合物转移至衬有100mL特氟龙的高压釜中，120℃加热48h，冷却至室温，离心收集固体产物，甲醇洗涤，真空干燥24h，120℃；
S2.具体操作同实施例1中的S2，具体的：将柠檬酸和乙二胺溶解在10mL的超纯水搅拌10分钟形成均匀的透明溶液。之后转移到50mL聚四氟乙烯高压釜中200℃反应5h。反应完成后冷却至室温，将高压釜中的液体转到透析膜在超纯水中透析。将膜中的液体离心，冷冻干燥；
S3.将4mg Uio-66和1mg CDs在2mL DMF混合并超声直至形成均匀的悬浮液，得到所述Uio-66-CDs；
用微量进样器取所制得的Uio-66-CDs复合材料5μL滴在玻碳电极表面，在CH660(电化学工作站)下测试Uio-66-CDs/GCE修饰电极的循环伏安性能(为在含0.5mol/L KCl的0.5mol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液(pH 7.0)中的循环伏安曲线)。
所得结果见图3，说明，当Uio-66：CDs在0.25-2范围内，均适用于该体系。当Uio-66：CDs＝4时，如图，循环伏安性能明显下降，此时该传感器的放大效应不明显。
对比实施例2
一种非印迹检测氯霉素的电化学传感器的制备方法：
(1)Uio-66-CDs的制备方法：
S1.将ZrCl4、对苯二甲酸溶解在DMF中，混合物转移至衬有100mL特氟龙的高压釜中，120℃加热48h，冷却至室温，离心收集固体产物，甲醇洗涤，真空干燥24h，120℃；
S2.将柠檬酸和乙二胺溶解在10mL的超纯水搅拌10分钟形成均匀的透明溶液。之后转移到50mL聚四氟乙烯高压釜中200℃反应5h。反应完成后冷却至室温，将高压釜中的液体转到透析膜在超纯水中透析。将膜中的液体离心，冷冻干燥；
S3.将1.0mg Uio-66和1.0mg CDs在2mL DMF混合并超声直至形成均匀的悬浮液，得到所述Uio-66-CDs；
S4：取25mL已配好的PBS，用微量进样器移取7.0μL的Py，三者混合后超声搅拌10分钟配制成含1×10-4mol/L的Py的磷酸盐缓冲液。
(3)Ppy-Nip/Uio-66-CDs/GCE电化学传感器的制备方法是：
将玻碳电极抛光，依次用硝酸、无水乙醇和去离子水分别超声，用微量进样器移取Uio-66-CDs的DMF溶液滴于玻碳电极表面，室温干燥，得到Uio-66-CDs/GCE修饰电极；将Uio-66-CDs/GCE表面重新结合在含Py的PBS中，在传统三电极体系下将功能单体Py电聚合到电极表面形成Ppy-Nip/Uio-66-CDs/GCE(无CAP)。
Ppy-Nip/Uio-66-CDs/GCE作为非印迹电化学电化学传感器的工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系进行电化学检测氯霉素。
此外，经试验验证，配置Uio-66和CDs悬浮液时，尝试使用溶剂水、乙醇及DMF，但结果显示，仅在以DMF作为溶剂时，参能获得较高灵敏度的传感器。
功能单体为吡咯、邻苯二胺、苯胺或甲基丙烯酸时均能够与CAP之间进行特异性结合，但以吡咯为最优，基于吡咯的分子印迹检测氯霉素的电化学传感器的制备及应用方法，功能单体Py与模板分子CAP之间存在氢键，由于氢键相互作用，通过电聚合在电极表面形成一层Ppy与CAP的印迹膜阻碍了铁氰化钾探针到达电极表面，使电极表面导电性降低。利用甲醇乙酸混合液洗涤电极表面CAP分子后，Ppy与CAP之间氢键断裂并形成特异性的印迹空腔，此时铁氰化钾探针可以通过空腔到达电极表面，使导电性有明显提升并可以特异性的结合CAP分子,实现了对CAP的定量检测，同时Ppy具有导电性，可协同Uio-66-CDs/GCE修饰电极进一步加强检测灵敏度，本发明氯霉素的最低检测限可达6.2×10-14mol/L。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
