光电化学生物传感器及其在甲基转移酶活性检测中的应用
技术领域
本发明光电化学检测
技术领域
，涉及光电化学生物传感器及其在甲基转移酶活性检测中的应用。背景技术
公开该
背景技术
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。异常的DNA甲基化模式取决于DNA甲基转移酶活性的改变，而DNA甲基转移酶可能作为各种癌症和遗传疾病的治疗靶点和生物标志物。人类的一些疾病往往与异常的DNA甲基化相关。因此，DNA甲基化分析对于遗传疾病的早期诊断有至关重要的作用。到目前为止，已经发展出各种用于测定DNA甲基化和DNA甲基转移酶(DNA MTase)活性的方法，如高效液相色谱法、荧光方法、电化学发光法、聚合酶链反应法、比色测定法和凝胶电泳等。然而，大多数DNA MTase活性的测定方法有设备昂贵、操作过程复杂、需要专业的技术人员等缺点。与上述方法相比，光电化学生物传感器具有成本低、设备简单、灵敏度高、操作快等优点，逐渐引起了人们的关注。
光电化学(PEC)检测是一种新兴的、动态发展的分析技术，因其兼具电化学分析和光学分析的优点而受到人们的广泛关注。与传统的电化学方法和光学方法相比，由于激发源和检测信号的分离，使PEC生物传感器具有较高的灵敏度和背景信号低的潜力。当前PEC检测的信号传递机制主要局限于改变电子供体/受体浓度或改变扩散效率来实现信号的减弱/增强。滴涂法仍然是目前广泛采用的电极制备方法。然而，发明人研究发现，光活性材料在电极上的不可重复性和不稳定性严重地阻碍了电荷迁移，同时检测灵敏度较低，从而影响PEC传感在检测DNA甲基转移酶活性中的应用。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供光电化学生物传感器及其在甲基转移酶活性检测中的应用，本发明提供的光电化学生物传感器具有检测灵敏度高、操作快等优点。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一方面，一种光电化学生物传感器，包括：
传感电极，电极表面覆盖P型共价有机聚合物膜；
金纳米颗粒和双链DNA，所述双链DNA内设有识别位点，所述识别位点能够被甲基转移酶甲基化，所述双链DNA的一条单链DNA设置为用于连接所述P型共价有机聚合物膜，所述双链DNA的另一条单链DNA设置为用于连接金纳米颗粒；
内切酶，用于将未甲基化的双链DNA解链；
染料，所述染料能够插入至双链DNA的磷酸骨架中。
P型共价有机聚合物不仅具有比表面积大的优势，而且具有优异的光电性质，有利于光电信号的传感；同时，P型共价有机聚合物的层间形成强π-π堆积会产生高孔隙率和结晶度，这有利于电荷载流子的输运，为载流子的传递提供了输运通道。
金纳米颗粒的表面能够发生表面等离子体共振(SPR)，具有可见光诱导电荷分离、附近强局域电场和独特的等离子体吸光特性。通过表面等离子体共振，不仅可以作为染料的光收集天线，而且可以提高光电流传输效率。经过SPR效应和染料敏化作用的协同，能够大大提高传感器的检测灵敏度，再经过P型共价有机聚合物膜进行高效率的信号输出，从而实现高灵敏度的检测。
双链DNA内设有能够甲基转移酶甲基化的识别位点，通过该识别位点是否进行甲基化判断甲基转移酶的活性，是否甲基化也是内切酶对双链DNA解链的关键，只有当双链DNA存在时，才能将金纳米颗粒和染料结合，并与P型共价有机聚合物膜连接，产生SPR效应和染料敏化作用的协同，不仅能够提高检测灵敏度，而且是增强了检测稳定性和重现性。
P型共价有机聚合物膜相比其他结构，厚度较薄，能够使电极具有更好的光电化学性能和丰富活性位点，不仅有利于信号的接收和传输，而且有利于连接基团的连接从而更好的连接双链DNA，从而提高检测的灵敏度、重现性和稳定性。
另一方面，一种上述光电化学生物传感器在甲基转移酶活性检测中的应用。
第三方面，一种甲基转移酶活性的检测方法，提供上述光电化学生物传感器；
将双链DNA与待测含有甲基转移酶的溶液混合第一次孵育，再加入内切酶进行第二次孵育，然后加入传感电极、金纳米颗粒和染料进行混合反应，对反应后的传感电极进行光电化学检测。
由于甲基转移酶激动剂和甲基转移酶抑制剂能够影响甲基转移酶的活性，因而第四方面，一种上述光电化学生物传感器在筛选甲基转移酶激动剂和/或甲基转移酶抑制剂的应用。
第五方面，一种甲基转移酶活性的检测试剂盒，包括上述光电化学生物传感器、缓冲溶液。
本发明的有益效果为：
1.本发明采用P型共价有机聚合物膜覆盖电极表面，具有良好的阴极PEC性能和丰富的活性位点，有利于光电化学生物传感器的高效传感的构建。
2.本发明利用了AuNPs的SPR效应和RhB的敏化作用，两种放大作用的耦合可以极大的放大该PEC生物传感器的光电流，大大提高了传感器的灵敏度，检测线为0.022个单位每毫升。酶的高特异性识别可以进一步提高本发明的特异性。
3.本发明设计的阴极PEC生物传感器只需改变识别序列，就可以扩展应用于其他DNA甲基转移酶和DNA修饰酶的检测，在药物研发和疾病诊断领域有广泛应用前景。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例在透明氧化铟锡涂层玻璃(ITO)上原位合成COP薄膜的示意图(A)，用于M.SssIMTase活性检测的PEC生物传感器制备示意图(B)；
图2为本发明实施例所用材料表征图，A为三(4-氨基苯基)胺(TAPA)(1.红线)、2,6-二羟基萘-1,5-二甲醛(DHNDA)(2.蓝线)、COP(3.黑线)的红外光谱图；B为COP的XRD图像；C为COP的紫外漫反射(DRS)光谱图，其中C的内部插图为COP的Tauc-Plot图像；D和E分别为COP的N1s和C1s的XPS谱图；F为AuNPs的紫外-可见吸收光谱；G和H分别为ITO上生长的COP的SEM俯视图和截面图；I为AuNPs的TEM图；
图3为本发明实施例中不同修饰电极的光电流，其中图A为不同修饰电极的PEC性能研究，a为COP/ITO，b为AuNPs/COP/ITO，a、b都在0.1摩尔每升的磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)中进行扫描，c为AuNPs/COP/ITO在N2饱和的0.1摩尔每升的磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)中进行扫描,d为COP/ITO，e为AuNPs/COP/ITO，d、e都在含有0.5微克每毫升的RhB的0.1摩尔每升的磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)中进行扫描；B图为PEC生物传感器的可行性研究。dsDNA/链霉亲和素/COP/ITO电极分别在存在HpaII+AuNPs(a)、HpaII+AuNPs+RhB(b)、HpaII+M.SssIMTase+AuNPs(c)和HpaII+M.SssIMTase+AuNPs+RhB(d)时的光电流响应；
图4为本发明实施例COP在可见光照射下的光电流产生机理；
图5为本发明实施例中灵敏度、选择性和稳定性实验结果表征图，A为不同浓度的M.SssIMTase的光电响应强度变化(浓度从a到j依次为：0，0.05，0.1，0.5，1，5，10，20，50和100个单位每毫升)，B为光电响应强度与M.SssIMTase浓度的对数之间的线性关系。C为个单位每毫升HhaIMTase，100个单位每毫升的Dam MTase和100个单位每毫升M.SssIMTase诱导的光电响应强度，误差棒表示三个独立实验的标准差；(D)阴极PEC生物传感器在0.1摩尔每升的磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)中连续扫描14个周期的PEC响应曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
鉴于现有光电传感器检测甲基转移酶活性存在重现性差、不稳定、灵敏度低等问题，本发明提出了光电化学生物传感器及其在甲基转移酶活性检测中的应用。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种光电化学生物传感器，包括：
传感电极，电极表面覆盖P型共价有机聚合物膜；
金纳米颗粒和双链DNA，所述双链DNA内设有识别位点，所述识别位点能够被甲基转移酶甲基化，所述双链DNA的一条单链DNA设置为用于连接所述P型共价有机聚合物膜，所述双链DNA的另一条单链DNA设置为用于连接金纳米颗粒；
内切酶，用于将未甲基化的双链DNA解链；
染料，所述染料能够插入至双链DNA的磷酸骨架中。
本发明利用金纳米颗粒SPR效应和染料敏化作用的协同，提高传感器的检测灵敏度，再经过P型共价有机聚合物膜进行高效率的信号输出，从而实现高灵敏度的检测。通过提供能够甲基转移酶甲基化的识别位点的双链DNA，并通过内切酶的配合，实现金纳米颗粒SPR效应和染料敏化作用的协同，不仅能够提高检测灵敏度，而且是增强了光电化学检测甲基转移酶活性的稳定性和重现性。
该实施方式的一些实施例中，双链DNA的一条单链DNA通过生物素与链霉亲和素的配合连接P型共价有机聚合物膜。在一种或多种实施例中，P型共价有机聚合物膜表面设置链霉亲和素。
该实施方式的一些实施例中，双链DNA的另一条单链DNA通过金-硫键连接金纳米颗粒。
该实施方式的一些实施例中，P型共价有机聚合物膜和金纳米颗粒分别位于双链DNA的两端。
该实施方式的一些实施例中，双链DNA由单链DNA1与单链DNA2杂交形成；
单链DNA1的序列为：CAC CTC CGG ACT G；
单链DNA2的序列为：CAG TCC GGA GGT G。
该实施方式的一些实施例中，所述P型共价有机聚合物膜由2,6-二羟基萘-1,5-二甲醛和三(4-氨基苯基)胺通过席夫碱反应获得。所述席夫碱反应是醛基与伯胺基反应形成碳氮双键的反应。
在一种或多种实施例中，传感电极的制备方法为：向电极表面滴加2,6-二羟基萘-1,5-二甲醛溶液和三(4-氨基苯基)胺溶液，进行反应。通过在电极表面原位生成P型共价有机聚合物膜，更有利于信号的传输，提高稳定性和重现性。
在一种或多种实施例中，2,6-二羟基萘-1,5-二甲醛溶液和三(4-氨基苯基)胺溶液中均含有均三甲苯、乙醇和醋酸。
在一种或多种实施例中，所述电极为导电玻璃。所述导电玻璃优选为ITO。
本发明的另一种实施方式，提供了一种上述光电化学生物传感器在甲基转移酶活性检测中的应用。所述应用优选为非疾病的诊断与治疗为目的。
本发明的第三种实施方式，提供了一种甲基转移酶活性的检测方法，提供上述光电化学生物传感器；
将双链DNA与待测含有甲基转移酶的溶液混合第一次孵育，再加入内切酶进行第二次孵育，然后加入传感电极、金纳米颗粒和染料进行混合反应，对反应后的传感电极进行光电化学检测。
所述检测方法优选为以非疾病的诊断与治疗为目的。
该实施方式的一些实施例中，第一次孵育温度为36.5～37.5℃。孵育时间为30～150分钟。
该实施方式的一些实施例中，第二次孵育温度为36.5～37.5℃。孵育时间为30～150分钟。
该实施方式的一些实施例中，将第二次反应后的溶液滴加至传感电极上进行第三次孵育，再滴加金纳米颗粒进行第四次孵育，然后添加染料溶液进行第五次孵育。
本发明的第四种实施方式，提供了一种上述光电化学生物传感器在筛选甲基转移酶激动剂和/或甲基转移酶抑制剂的应用。
本发明的第五种实施方式，提供了一种甲基转移酶活性的检测试剂盒，包括上述光电化学生物传感器、缓冲溶液。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例
ITO玻璃上的COP薄膜的合成：将ITO玻璃切成4.7厘米×1厘米的片，在1.0摩尔每升NaOH、10％H2O2和丙酮中超声处理，然后用超纯水彻底清洗，并在使用前用氮气吹干。将2,6-二羟基萘-1,5-二甲醛(DHNDA)和三(4-氨基苯基)胺(TAPA)分别溶于均三甲苯、乙醇和冰醋酸(体积比为5:5:1)的混合溶液。然后将DHNDA和TAPA溶液按1:1的体积比混合均匀后立即将混合溶液滴于ITO表面，在封闭体系中室温反应。然后将ITO玻璃浸泡在二氯甲烷中以除去未反应的残余试剂，制备好的电极在室温下干燥，此时ITO表面形成均匀的玫瑰棕色薄膜。
金纳米颗粒(AuNPs)的合成：将200毫升0.01％的HAuCl4溶液在剧烈的搅拌下煮沸，随后将5毫升1％的柠檬酸钠溶液迅速加入到沸腾溶液中。当溶液变成深红色，表明形成AuNPs，AuNPs溶液保持磁力搅拌进行冷却。
光电化学生物传感器的制备：ITO表面进行COP薄膜的修饰。随后取20微升链霉亲和素溶液(0.05毫克每毫升)滴加于COP薄膜修饰的电极上，干燥后得到链霉亲和素/COP/ITO修饰电极。
DNA-1由5′到3′的序列为：5′-CAC CTC CGG ACT G-SH-3′，序列见SEQ ID NO.1。
DNA-2由5′到3′的序列为：5′-CAG TCC GGA GGT G-biotin-3′，序列见SEQ IDNO.2。
硫醇化的DNA-1的活化过程为：采用三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)将二硫键键合的寡核苷酸还原一小时。
DNA-1和DNA-2在杂交缓冲溶液(1.0毫摩尔每升的EDTA、5毫摩尔每升的MgCl2、10毫摩尔每升的Tris，pH＝7.4)中37℃孵育30分钟获得DNA-1/DNA-2杂交链(dsDNA)。将dsDNA探针在反应溶液(160微摩尔每升的SAM、2.0微升的1×NEBuffer 2和不同浓度的M.SssIMTase)在37℃下孵育2小时。随后将dsDNA探针加入到含有HpaII的1×CutSmart缓冲溶液中，在37℃下孵育2小时，取孵育后的反应溶液滴加在链霉亲和素/COP/ITO电极上孵育。用PBS缓冲溶液冲洗后，将20微升AuNPs溶液滴加在dsDNA/链霉亲和素/COP/ITO电极上孵育8小时，得到AuNPs/dsDNA/链霉亲和素/COP/ITO电极。然后将修饰电极与1毫摩尔每升的RhB孵育30分钟。
采用传统的三电极系统，以原位生长了COP的ITO玻璃为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在氙灯的照射下，以PBS缓冲溶液为电解质溶液，检测传感器所产生的光电流的变化。
1.材料的表征
三(4-氨基苯基)胺(TAPA)的红外光谱(图2A，1)在3338cm-1和1621cm-1处有拉伸频率，分别对应着氨基的N-H键和苯环的C＝C。2,6-二羟基萘-1,5-二甲醛(DHNDA)的红外光谱(图2A，2)在2918cm-1处有醛的特征伸缩振动，在1639cm-1处有羰基的特征伸缩振动。TAPA在3338cm-1处N-H的伸缩峰和DHNDA在1639cm-1处C＝O的特征伸缩振动在聚合后均消失，而在1603cm-1和2911cm-1处出现了新的特征峰，分别对应于C＝N和苯环上C-N的伸缩振动峰，证实了三(4-氨基苯基)胺(TAPA)和2,6-二羟基萘-1,5-二甲醛(DHNDA)的单体已经转化为COP(图2A，3)。XPS谱图进一步证明了COP的成功合成(图2E)。在C1s的高分辨率X射线光电子能谱中(XPS谱图)，检测到一条清晰的发射线，其结合能为285.7eV，这归因于C＝N键。在N1s的XPS谱图中也观察到了398.8eV处的C＝N(图2D)。这些结果与红外光谱观察到的结果一致，这进一步证实了COP薄膜中亚胺键的形成。我们使用X射线衍射(XRD)对COP薄膜进行了进一步的表征。如图2B所示，COP在位于11.5°和21.8°处有两个宽峰。分别对应于[100]和[001]平面。在较高2θ角(21.8°)处的宽峰是由COP层间π-π堆积引起的。
COP薄膜的紫外可见漫反射光谱(DRS)在300～600纳米的范围内具有很强的吸收带，吸收尾甚至延伸到700纳米处(图2C)。利用下面方程可以求得COP的带隙(Eg)：
αhν＝A((hν-Eg)1/2 (1)
其中α为吸收系数，h为普朗克常数，ν为光的频率，Eg为带隙，A为常数项。将Tauc-Plot图((αhν)2vs(hν))的线性区域外推到与横轴的交点处，计算得出COP的光带隙为2.89eV。
13纳米的AuNPs在520纳米处观察到有一个吸收峰(图2F)。并且从AuNPs的TEM图像可以看出(图2I)，AuNPs的直径约为13纳米且粒径分布均匀。COP的扫描电子显微镜(SEM)的俯视图像(图2G)显示了ITO表面覆盖了一层连续均匀的薄膜。SEM的横截面图像几乎看不出薄膜与ITO之间的边界(图2H)，这证明所合成的薄膜是超薄的，并且在ITO表面有很强的粘附性。
2.可行性的实验验证
为了证明本技术方案的可行性，本实施例使用了不同修饰电极制备阴极PEC生物传感器的方法(图3)。AuNPs/COP/ITO在0.1摩尔每升的磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)中的光电流(-2073纳安,图3A,曲线b)高于COP/ITO在0.1摩尔每升的磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)中的光电流(-819纳安,图3A,曲线a)。阴极光电流的增加主要有两个原因：(1)AuNPs与COP的直接接触促进了它们之间的电荷转移；(2)AuNPs的SPR效应提高了光生载流子的分离效率。将AuNPs/COP/ITO电极在氮气脱氧的0.1摩尔每升的磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)中进行检测，光电流降低(图3A,曲线c)，这说明氧气作为电子受体在阴极光电流的产生中起重要作用。在含有0.5微克每毫升RhB的0.1摩尔每升的磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)中检测COP/ITO电极和AuNPs/COP/ITO电极，其光电流分别约为-2512纳安(图3A,曲线d)和-4201纳安(图3A,曲线e)，表明RhB的增敏作用可以增强COP/ITO的光电流强度。
图3B展示了不同修饰表面的PEC生物传感器的PEC性能。发现dsDNA/链霉亲和素/COP/ITO在HpaⅡ+M.SssIMTase+AuNPs存在的情况下的光电流(图3B,曲线c,-2048纳安)大于只有HpaⅡ+AuNPs存在时的光电流(图3B,曲线a,-1120纳安)，证明该PEC生物传感器可用于M.SssIMTase的检测。这是由于AuNPs的SPR效应提高了光生载流子的分离效率，COPs的导带(CB)和AuNPs可以与溶解氧发生反应，产生明显的阴极光电流。此外，dsDNA/链霉亲和素/COP/ITO电极在HpaⅡ+M.SssIMTase+AuNPs+RhB存在时的光电流(图3B,曲线d,-2738纳安)远高于只有HpaⅡ+M.SssIMTase+AuNPs存在时的光电流(图3B,曲线c,-2048纳安)，这表明染料RhB的嵌入可以提高光电流，进一步增强PEC生物传感器的信号。
3.PEC性能机制实验
图4描述了COP薄膜构建的PEC生物传感器在光照条件下产生光电流的机理。在光的照射下，COP价带(VB)上的电子会转移到导带(CB)上，从而产生电子-空穴对。由于SPR增强效应，COP被激发到导带(CB)上的电子可以快速注入到AuNPs上。随后，AuNPs和COP导带(CB)上的电子会与电解质溶液中的溶解氧发生反应，产生明显的阴极光电流。RbB在吸收光后会产生激发态的RbB*，电子由COP的价带(VB)转移到激发态的RbB*上(公式2)。然后，电子由还原染料RhB-(公式3)转移到O2，生成还原产物和RbB(公式4)。此外，AuNPs的SPR效应可以作为RhB的光收集天线，提高光收集能力，从而实现光电流的增强。
RhB/COP+hv→RhB*/COP(激发) (2)
RhB*/COP→RhB-/COP(h+)(空穴注入) (3)
RhB-/COP(h+)+O2→RhB/COP(h+)+还原 (4)
产物(染料再生和氧气还原)
4.灵敏度实验
为了评估本技术方案的检测M.SssIMTase的灵敏度，在最佳实验条件下，本实施例测量了光电响应强度与M.SssIMTase浓度之间的关系。如图5A所示，电响应强度随着M.SssIMTase浓度的增加而增加。光电响应强度与M.SssIMTase浓度的对数在0.05～100个单位每毫升的范围内有很好的线性关系(图5B)，其线性相关方程为I＝-343.48lgC-1971.23(R2＝0.9964)，其中I代表光电流值，C表示M.SssIMTase的浓度(单位每毫升)。根据对照的平均值加上三倍的标准偏差，计算得出检测限为0.022个单位每毫升。
5.特异性、重现性和稳定性实验
为了研究PEC生物传感器的选择性，我们以Dam甲基化酶(Dam MTase)和HhaI甲基化酶(HhaIMTase)为干扰酶，评价了所构建的PEC生物传感器的选择性。如图所示5C，M.SssIMTase的光电响应强度远远大于Dam MTase和HhaIMTase的光电响应强度，这是因为Dam MTase和HhaIMTase无法使CpG位点甲基化。因此，所研制的PEC生物传感器对M.SssIMTase具有良好的特异性。
为了评价所提出的PEC生物传感器的重现性，在相同条件下制备了三个不同的PEC生物传感器，以研究该PEC生物传感器的测定内精度，测定的批内变异系数为0.21％，这表明该PEC生物传感器具有良好的重现性。我们进一步研究了所提出的PEC细胞传感器的稳定性。图5D显示，激发光源每20秒重复一次开关灯循环，在连续照射280秒后光响应强度没有明显变化。14个开关灯循环的光电流值的相对标准偏差(RSD)为1.23％，表明该PEC生物传感器具有良好的稳定性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 光电化学生物传感器及其在甲基转移酶活性检测中的应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cacctccgga ctg 13
<210> 2
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cagtccggag gtg 13
