一种非水溶性葡聚糖含量的检测方法
技术领域
本发明涉及分析检测领域，具体涉及一种非水溶性葡聚糖含量的检测方法。
背景技术
电化学发光(Electrogenerated chemiluminescence,ECL)，又称电致化学发光，是化学发光与电化学结合的产物，是指通过施加一定的电压进行电化学反应，在电极表面产生一些电生的物质，然后这些电生的物质之间或者电生物质与体系中某些组分之间通过电子传递形成激发态，由激发态返回到基态而产生的一种发光现象。该技术集成了发光分析高灵敏度和电化学电位可控性的优点，已经成为分析化学工作者十分感兴趣的研究领域之一。电化学发光分析法不仅保留了化学发光分析法灵敏度高、线性范围宽、设备简单、操作方便、快速、易于实现自动化等优点，还具有电化学分析方法控制性强、选择性好、可提供高活性的发光反应物质和节省试剂等优点。
超灵敏电化学发光传感器的迅速发展主要归功于很好的电化学发光信号放大策略。多种纳米材料，例如，碳纳米管、石墨烯、金纳米以及纳米复合材料等作为一种信号放大器已经在电化学发光传感器的构建上得到了广泛的注意。尤其，石墨烯是一种单原子厚度的二维材料，具有非凡的物理化学性质，如大的比表面积、可调节的电子性质。因此石墨烯已经成为在构建电化学发光传感器领域中最具前景的电极材料。
石墨烯的生产方法有很多，其中还原超声剥离得到的氧化石墨烯(GO)的方法是最有效的方法。然而，由于石墨烯无论是在干燥状态还是在溶液状态都很容易团聚，这使石墨烯的实际应用受到了阻碍。最开始在石墨烯中引进金属纳米粒是为了分开石墨烯片层防止石墨烯的团聚。然而，现在发现把金属纳米粒沉积到石墨烯表面，赋予了石墨烯应用的新领域，比如，催化、磁性材料、电子传导等领域。石墨烯金属纳米复合材料作为一种电化学发光信号放大器已经应用到了ECL生物传感器中，并且所得到的传感器具有很好的性能。所以石墨烯-金纳米复合材料也是一种很好的用于信号放大的材料。
葡聚糖为右旋吡喃葡萄糖聚合体，分子式为(C6H10O5)n。葡聚糖主要包括α-葡聚糖和β-葡聚糖两种形式。其中，α-葡聚糖主要存在微生物在生长过程中分泌的粘液中，如蔗糖经细菌发酵产生的胞外多糖，目前是最佳的血浆代用品之一。β-葡聚糖则广泛存在于微生物、植物乃至动物体内，主要以细胞壁中存在，对异体宿主防御系统具有较强的诱导和活性作用，是一类活性强、毒副作用低的良好的生物应答效应物。
2012年日本米田章登对美洲鲎和东方鲎的血液进行了DNA测序，找到了与真菌细胞壁中β-葡聚糖特异性结合的功能区。将此特异性DNA区域命名为美洲鲎属G因子α亚基片端a(Gαa)。
作为深部真菌感染的病原体的的代表，可列举假丝酵母菌、曲霉菌，冉义一个的细胞壁中都存在β-葡聚糖，它是真菌细胞壁上的的特有成分，能被免疫细胞识别。因此在临床上，血清和血浆中的β-葡聚糖的测定被用于真菌感染症的早期临床诊断、治疗效果和康复的判断标准。
酵母是一种重要的食品和工业微生物，在其细胞壁中存在大量的以β-1,3-D为主链、β-1,6-D为侧链的不溶性葡聚糖。这种物质具有抗细菌、抗病毒，增强哺乳动物的免疫力等作用，是一种良好的生物效应调节剂，广泛应用于食品、医药、化妆品等行业，是国内外研究的热门课题。由于酵母葡聚糖的水不溶性使其测定有一定困难，对葡聚糖的检测具有一定的困难。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的问题，提供了一种非水溶性葡聚糖含量的检测方法。本发明利用夹心形式的免疫转感器，将β-葡聚糖季铵盐化提高其水溶性，提高了对β-葡聚糖检测的准确性。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种非水溶性葡聚糖含量的检测方法，包括以下步骤：
S1.样品处理：
S11.在待测样品中按照固液比为1:15～25，加入1mol/L的NaOH溶液，搅拌至溶解；
S12.将步骤S1中的不溶物过滤除去，加入总体积的1/5～1/4的GTMAC混合均匀，在65～75℃条件下反应2～4h；
S2.Ru(bpy)3 2+修饰Gαa蛋白：
S21.制备Ru(bpy)3 2+掺杂的SiO2；
S22.将步骤S21的产物分散含有质量分数为5％～10％的戊二醛PBS缓冲溶液中，搅拌2～4h；
S23.将步骤S22过滤得到的纳米粒子分散到含有Gαa蛋白的PBS缓冲液中，在0～4℃条件下培育12～24h；
S24.将步骤S23得到的产物用PBS溶液清洗之后，在0～4℃保持在PBS缓冲液中；
S3.石墨烯金纳米电极的制备：
S31.配置0.5～1.0mg/mL的GO溶液，再在其中加入氯金酸，使得氯金酸的浓度为10～50μM；
S32.将打磨好的GCE电极浸泡其中，利用循环伏安法以5～10mV/s的扫描速度，在-1.5V-0.5V范围扫描8～15圈；
S33.将步骤S32修饰的电极用去离子水冲洗3～5遍；
S4.待测物检测
S41.将步骤S3制备的电极浸泡在浓度为0.01～0.05g/mL的Gαa蛋白的PBS溶液中3～5h；
S42.将步骤S41的电极用PBS溶液清洗之后，浸泡在步骤S1的待测溶液中1～3h；
S43.将步骤S42的电极用PBS溶液清洗之后，浸泡在步骤S2的溶液中0.5～1h；
S44.在电化学发光系统中测试步骤S43电极的发光强度。
优选地，所述步骤S11中固液比为1:20。
优选地，所述所述步骤S12的反应温度为70℃，反应时间3h。
优选地，所述PBS缓冲剂的pH为7.2。
优选地，所述步骤S31中GO的浓度为1.0mg/mL。
优选地，所述步骤S31中氯金酸的浓度为20μM。
优选地，所述步骤S32中扫描速度为10mV/s，扫描圈数为10圈。
优选地，所述步骤S41中浸泡时间为4h。
优选地，所述步骤S42中浸泡时间为1.5h。
优选地，所述步骤S43中浸泡时间为1h。
上述方法中步骤S1样品处理主要是将样品中β-葡聚糖转变为季铵盐。而且转变为季铵盐而不影响葡聚糖整体的分子构型。β-葡聚糖仍可以和美洲鲎属G因子α亚基片端a(Gαa)发生特异性结合。步骤S1中GTMAC为缩水甘油基三甲基季铵盐酸盐。
步骤S2中用Ru(bpy)3 2+修饰Gαa蛋白。步骤S21中首先用Ru(bpy)3 2+修饰SiO2。具体操作如下：首先在室温下，将1.77mL表面活性剂TX-100，7.5mL环己烷和1.8mL助表面活性剂正己醇搅拌器混合30min。然后，加入0.48mL Ru(bpy)3Cl2，并持续搅拌至混合物形成均匀的油包水微乳液体系。加入100μL TEOS，然后加入60μL质量百分含量为28～38％的氨水，进行水解反应。持续搅拌24h，然后加入100μL(3一氨基丙基)三乙氧基硅(APTES)和60μL的氨水并支持搅拌。24h后，加入25mL丙酮破乳。在10000r/min下，离心10min，收集产物。用乙醇和水超声、离心洗涤数次，以出去纳米粒子表面吸附的表面活性剂和吸附的Ru(bpy)3Cl2。
氧化石墨烯(GO)用鳞片石墨通过改进的Hummers法合成。首先，称取1g鳞片石墨和0.8g硝酸钠与23mL的浓硫酸混合预氧化12h。然后在冰浴中，搅拌条件先缓慢加入3.0g高锰酸钾，控制加样速度使温度不高于30℃。然后将其转移至约50℃的水浴中反应6h。再一次性加入3.0g高锰酸钾，再反应6h。逐步加入50mL的去离子水，温度升至98℃保持温度反应40min，观察到混合物由棕褐色变为黄色。进一步加入30mL的去离子水进行稀释，停止反应并加入2mL双氧水溶液(30％)进一步氧化，反应液会突变为亮黄色，趁热过滤反复洗涤至中性，最后一次洗涤进行10000rpm离心30min倾去上清液，60℃真空干燥得到氧化石墨烯。
玻碳电极(GCE)的处理方法具体为：首先玻碳电极(GCE)依次用0.3和0.05μmα-Al2O3粉末抛光。电极在每次抛光后都要用去离子水冲洗，然后在去离子水和乙醇中分别超声5min，然后在0.5M的硫酸溶液中活化，扫描范围为-1V到1V扫描速度为100mV s-1，一直扫到循环伏安曲线重合为止。接下来电极在简单的冲洗后直接用来修饰。把得到GO粉末溶解到0.07M pH为8.0的PBS溶液中形成1.0mg mL-1的GO溶液，再在溶液中滴加几滴氯金酸溶液。利用循环伏安法(CV)(扫描范围-1.5V-0.5V，扫描速度为10mV s-1，扫描10圈)将GO和氯金酸同时被还原到玻碳电极表面。
电化学发光检测系统采用三电极系统，修饰的电极作为工作电极。Pt电极作为对电极，AgCl作为参比电极。Ru(bpy)3 2+在三正丙胺可以产生强烈的电化学发光信号。上述步骤S4的电化学发光的溶液体系为三正丙胺溶液。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
本发明提供的一种非水溶性葡聚糖含量的检测方法，采用季铵盐化葡聚糖，增加了葡聚糖的水溶性。并且采用金纳米复合石墨烯对电化学发光信号的扩大，得到具有更好准确性、灵敏度的检测方法。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一种非水溶性葡聚糖含量的检测方法，包括以下步骤：
S1.样品处理：
S11.在待测样品中按照固液比为1:15，加入1mol/L的NaOH溶液，搅拌至溶解；
S12.将步骤S1中的不溶物过滤除去，加入总体积的1/5的GTMAC混合均匀，在75℃条件下反应2h；
S2.Ru(bpy)3 2+修饰Gαa蛋白：
S21.制备Ru(bpy)3 2+掺杂的SiO2；
S22.将步骤S21的产物分散含有质量分数为10％的戊二醛PBS缓冲溶液中，搅拌2h；
S23.将步骤S22过滤得到的纳米粒子分散到含有Gαa蛋白的PBS缓冲液中，在0～4℃条件下培育24h；
S24.将步骤S23得到的产物用PBS溶液清洗之后，在0～4℃保持在PBS缓冲液中；
S3.石墨烯金纳米电极的制备：
S31.配置1.0mg/mL的GO溶液，再在其中加入氯金酸，使得氯金酸的浓度为10μM；
S32.将打磨好的GCE电极浸泡其中，利用循环伏安法以5～10mV/s的扫描速度，在-1.5V-0.5V范围扫描8圈；
S33.将步骤S32修饰的电极用去离子水冲洗3遍；
S4.待测物检测
S41.将步骤S3制备的电极浸泡在浓度为0.01g/mL的Gαa蛋白的PBS溶液中5h；
S42.将步骤S41的电极用PBS溶液清洗之后，浸泡在步骤S1的待测溶液中3h；
S43.将步骤S42的电极用PBS溶液清洗之后，浸泡在步骤S2的溶液中0.5h；
S44.在电化学发光系统中测试步骤S43电极的发光强度。
实验例2
一种非水溶性葡聚糖含量的检测方法，包括以下步骤：
S1.样品处理：
S11.在待测样品中按照固液比为1:25，加入1mol/L的NaOH溶液，搅拌至溶解；
S12.将步骤S1中的不溶物过滤除去，加入总体积的1/4的GTMAC混合均匀，在65℃条件下反应4h；
S2.Ru(bpy)3 2+修饰Gαa蛋白：
S21.制备Ru(bpy)3 2+掺杂的SiO2；
S22.将步骤S21的产物分散含有质量分数为5％的戊二醛PBS缓冲溶液中，搅拌4h；
S23.将步骤S22过滤得到的纳米粒子分散到含有Gαa蛋白的PBS缓冲液中，在0～4℃条件下培育12h；
S24.将步骤S23得到的产物用PBS溶液清洗之后，在0～4℃保持在PBS缓冲液中；
S3.石墨烯金纳米电极的制备：
S31.配置0.5mg/mL的GO溶液，再在其中加入氯金酸，使得氯金酸的浓度为50μM；
S32.将打磨好的GCE电极浸泡其中，利用循环伏安法以5～10mV/s的扫描速度，在-1.5V-0.5V范围扫描15圈；
S33.将步骤S32修饰的电极用去离子水冲洗3遍；
S4.待测物检测
S41.将步骤S3制备的电极浸泡在浓度为0.05g/mL的Gαa蛋白的PBS溶液中3h；
S42.将步骤S41的电极用PBS溶液清洗之后，浸泡在步骤S1的待测溶液中1h；
S43.将步骤S42的电极用PBS溶液清洗之后，浸泡在步骤S2的溶液中1h；
S44.在电化学发光系统中测试步骤S43电极的发光强度。
实施例3
一种非水溶性葡聚糖含量的检测方法，包括以下步骤：
S1.样品处理：
S11.在待测样品中按照固液比为1:20，加入1mol/L的NaOH溶液，搅拌至溶解；
S12.将步骤S1中的不溶物过滤除去，加入总体积的1/5的GTMAC混合均匀，在70℃条件下反应3h；
S2.Ru(bpy)3 2+修饰Gαa蛋白：
S21.制备Ru(bpy)3 2+掺杂的SiO2；
S22.将步骤S21的产物分散含有质量分数为8％的戊二醛PBS缓冲溶液中，搅拌3h；
S23.将步骤S22过滤得到的纳米粒子分散到含有Gαa蛋白的PBS缓冲液中，在0～4℃条件下培育20h；
S24.将步骤S23得到的产物用PBS溶液清洗之后，在0～4℃保持在PBS缓冲液中；
S3.石墨烯金纳米电极的制备：
S31.配置1mg/mL的GO溶液，再在其中加入氯金酸，使得氯金酸的浓度为20μM；
S32.将打磨好的GCE电极浸泡其中，利用循环伏安法以5～10mV/s的扫描速度，在-1.5V-0.5V范围扫描10圈；
S33.将步骤S32修饰的电极用去离子水冲洗3遍；
S4.待测物检测
S41.将步骤S3制备的电极浸泡在浓度为0.01g/mL的Gαa蛋白的PBS溶液中4h；
S42.将步骤S41的电极用PBS溶液清洗之后，浸泡在步骤S1的待测溶液中1.5h；
S43.将步骤S42的电极用PBS溶液清洗之后，浸泡在步骤S2的溶液中1h；
S44.在电化学发光系统中测试步骤S43电极的发光强度。
实验例1
金纳米-石墨烯硒是通过同时在沉积氧化石墨烯和氯金酸得到的。首先用循环伏安法在5mM含有0.1M KCl的的[Fe(CN)6]4-/[Fe(CN6)]3-溶液中对沉积的电极进行表征。与裸电极相比修饰后的电极电路有一个很大的提高。裸电极的电流为1.0×10-4A，修饰上石墨烯金纳米后电极的电流变为1.4×10-4A。用修饰有石墨烯金纳米的电极浸泡在含有Gαa蛋白中，由于石墨烯具有较大的比表面积对蛋白具有很好的吸附作用，电极表面吸附Gαa蛋白以后，电极的电流明显减小变为0.4×10-4A。从在修饰过程中电流的变化说明，电极成功修饰上石墨烯金纳米复合材料，电流的急剧减小说明吸附了Gαa蛋白。
实验例2
为了探究石墨烯金纳米复合材料修饰的复合电极的稳定。对电极组装的各个阶段进行了持续的电化学发光测试。电化学发光的测试体系为：5mM含有0.1M KCl的[Fe(CN)6]4-/[Fe(CN6)]3-溶液和0.1M的三正丙胺溶液的混合溶液中。电极的扫描范围为-0.5～1.5V，扫描速度为100mV/s。对裸电极(GCE)、修饰有石墨烯和金纳米复合材料的电极(GCE-gGNPs)、修饰g-GNPs并吸附Gαa蛋白的电极(GCE-gGNPs-Gαa)、在葡聚糖中浸泡之后的电极(GCE-gGNPs-Gαa-G)以及在修饰有钌的Gαa蛋白浸泡之后的电极(GCE-gGNPs-Gαa-G-Gαa)。对上述各阶段电极的电化学发光测试结果如表1所示。
表1电极组装过程电化学发光强度的变化情况表
从表1可以看出随着电化学循环圈数逐渐增减。各个阶段的电化学发光信号只有略微的衰减。而且裸电极、修饰gGNPs的电极、吸附Gαa蛋白以及再吸附β-葡聚糖的阶段，电极几乎没有电化学信号的相应，只有到修饰有Ru的Gαa蛋白被引入到电极表面时，电极才表现出很强的电化学发光信号。并且在持续电化学扫描过程中，电化学发光信号没有明显的衰减。说明本发生组装的电化学发光生物传感器具有很好的稳定性。
实验例3
配置标准β-葡聚糖溶液，浓度依次为0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM系列浓度的β-葡聚糖溶液。按照实施例3的检测方法进行处理，测试各浓度的电化学发光强度如表2所示。
表2不同浓度β-葡聚糖的电化学发光信号强度
浓度nM
0.01
0.05
0.1
0.5
1
5
10
ECL a.u.
345.12
1432.45
2065.78
3179.92
4129.56
4768.33
5467.45
对上述数据进行拟合，在最佳的测试条件下，本发明电化学发光传感器的电化学发光信号随着β-葡聚糖的浓度增加而增加，而且电化学发光强度在0.01nM～10nM范围的β-葡聚糖的浓度的对数呈线性关系，线性方程为IECL＝1785.8lgCβG+3843.4，线性相关系数为R＝0.9987。定义传感器对空白样品的相应强度乘以3倍的标准变差为检测限，本发明的传感器的检测限位5.7pM。因此本发明实现了对β-葡聚糖超灵敏的检测。
实验例4
血清与血浆相似的化学成分，血液中的β-葡聚糖的含量是对血液中真菌感染测试的重要指标。传感器对实际样品的检测效果，通过对血清中的回收实验来确定。在血清加入标准的β-葡聚糖，通过用上述实施例的方法对β-葡聚糖的含量进行测试。得到的回收率在95～101％。这个结果说明本发明的方法能够应用到血液中β-葡聚糖的实际检测。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
