具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。本发明中原料均为普通市售产品。

本发明所采用的ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的合成路线和合成方法如图4所示：

第一步，脱保护：

将全乙酰化的壳二糖1溶于无水二氯甲烷和甲醇的混合溶液中，加入甲醇钠溶液，反应生成中间体2。

其中，无水二氯甲烷与甲醇体积比为4：1，甲醇钠1％，反应温度为室温，反应应在无水条件下进行，反应时间为1h。

本步反应操作如下：称取一定量的全乙酰化的壳二糖1于干净的圆底烧瓶中，加入转子，塞上瓶塞，用真空泵抽出瓶内空气，插入氮气球，此步骤循环三次彻底置换瓶内空气，确保瓶内为无水环境，随后用注射器加入溶剂，溶解壳二糖1，最后加入0.4％的甲醇钠，室温条件下反应1h，反应过程经薄层色谱法(TLC)检测，反应完成后用酸性树脂调节pH到7.0左右，除去树脂，减压除掉溶剂得到中间体2此步骤不需要纯化。

第二步，合成糖胺：

将第一步反应混合物除去溶剂，向反应容器中加入饱和碳酸氢钠溶液，反应得到中间体3。

其中，反应温度为40℃，反应时间为20～26h。

本步反应操作如下：向瓶内加入饱和碳酸氢铵容液，于40℃水浴条件下加热反应，此步反应过程中应插气球，防止碳酸氢氨分解产生气体导致瓶内气压过高出现危险；反应进程经TLC检测，反应完成后，通过减压旋蒸法除去溶剂和碳酸氢铵，所得产物不需要纯化。

第三步，合成Gn2-Gly-Fmoc：

将第二部反应混合物溶于DMF中，加入吡啶和Fmoc-Gly-OPfp，反应得到中间体4.

其中，反应温度为4℃，反应时间为24～28h；中间体3与吡啶和Fmoc-Gly-OPfp的摩尔比分别为1：1.1和1：1.2。

本步反应操作如下：加入DMF溶解第二步产物，将吡啶和Fmoc-Gly-OPfp分别溶于DMF中，按摩尔比加到反应容器中，于4℃条件下反应，反应进程通过TLC检测，反应完成后减压除去溶剂，产物经过硅胶柱层析纯化，得到中间体4。

第四步，添加半乳糖合成Gal-Gn2-Gly-Fmoc：

将一定量的中间体4溶于去离子水中，取部分于反应容器中，加入Tris-HCl缓冲液，一定量的镁离子，GalT，UDP-Gal，反应得到中间体5。

其中，反应温度为37℃，反应时间为12h，Tris-HCl缓冲液Tris为100mM，pH为7.5，镁离子为10mM；中间体4与UDP-Gal摩尔比为1：10，与GalT摩尔比为50：1。

本步反应操作如下：取一定量的底物中间体4于烧瓶中，加入缓冲液，按摩尔比加入供体UDP-Gal以及GalT，反应在37℃缓慢搅拌的条件下进行，反应进程通过TLC检测，反应完成后，不做处理进入下一步反应。

第五步，添加唾液酸合成Sia-Gal-Gn2-Gly-Fmoc：

向上一步的反应混合溶液中加入供体CMP-NANA和SiaT反应得到Fmoc-Gly连接的ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物(Sia-Gal-Gn2GlyFmoc)。

其中，这一步的反应温度为37℃，反应时间为0.5h；中间体5与供体CMP-NANA的摩尔比为1：12，与SiaT摩尔比为50：1。

本步反应操作如下：直接向上一步反应的混合溶液中按照摩尔比加入SiaT和CMP-NANA，反应在37℃缓慢搅拌的条件下进行，反应进程通过TLC进行检测；反应完成后向反应混合物中加入等体积的冷乙醇终止反应，离心去除白色蛋白沉淀，减压除去溶剂得到终产物Sia-Gal-Gn2GlyFmoc。

由于ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的分子量与其他用于免疫反应的抗原相比较小，无法确保单纯的标记物能够激发强烈的免疫反应。因此，本发明为了提高其免疫原性以获得更强烈的免疫反应，将上述合成的标记物连接到载体蛋白上制备成糖蛋白缀合物；具体制备方法如下：

第一步，脱掉Fmoc保护基：

将Sia-Gal-Gn2GlyFmoc溶于DMF中，加入一定量的哌啶，反应脱掉Fmoc保护基。

其中，反应时间为1h，反应温度为室温，10％哌啶。

本步反应操作如下：先将Sia-Gal-Gn2GlyFmoc溶于DMF中，接着加入10％哌啶，在室温条件下搅拌反应1h；反应进程通过TLC检测，反应完成后经过减压旋蒸除去溶剂，得到的产物不需要纯化。

第二步，连接双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)：

将上一步的反应混合物溶于磷酸盐缓冲液与DMF组成的混合溶剂中，加入DSG反应得到Sia-Gal-Gn2GlyDSG。

其中，将(0.1M，pH 8.0)磷酸盐缓冲液与DMF体积比为1：4组成混合溶液，反应时间为3～6h，室温下反应，其中Sia-Gal-Gn2Gly与DSG摩尔比为15：1。

本步反应主要操作如下：将脱掉Fmoc保护基的反应混合物溶于磷酸盐缓冲液与DMF的混合溶剂中，加入DSG，在室温条件下反应3～6h，反应进程经过TLC检测，反应完成后，减压旋蒸得到产物Sia-Gal-Gn2Gly-DSG，所得到的产物不需要纯化。

第三步，连接载体蛋白KLH(血蓝蛋白)、BSA(牛血清白蛋白)：

将上一步反应混合物溶于磷酸盐缓冲液，加入载体蛋白，反应得到生物标记物与蛋白形成的糖缀合物Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-KLH/BSA。

其中本步反应需要在搅拌温和的条件下进行，反应温度为室温，反应时间为2.5～3d，Sia-Gal-Gn2GlyDSG与载体蛋白的摩尔比为30：1。

本步反应主要操作如下：将上一步反应混合物溶于(0.1M，pH 8.0)磷酸盐缓冲液，按摩尔比加入载体蛋白，缓慢搅拌反应2.5～3d；反应完成经葡聚糖凝胶柱脱盐纯化得到Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-KLH/BSA。

抗ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物特异性抗体的制备：本发明提到的抗ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的抗体可以利用本领域已知的各种方法来制备，例如通过免疫学实验获得抗体。

本发明提到的抗体可以特异性识别并结合ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物。

检测方法和试剂盒：

本发明的抗体能够特异性结合ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物，从而可用于检测ALG1-CDG、PMM2-CDG在样品中是否存在或其水平。

因此，本发明提供了一种用作试剂盒的方案，其中包括本发明的抗体。本发明的抗体带有可检测的标记。所述试剂盒还包含第二抗体，其特异性识别本发明的抗体。优选的，所述第二抗体包括可检测的标记。

在本发明中，所述可检测标记可以是可通过荧光、光学、免疫学、光谱、化学等手段检测的任何物质。特别优选的此类标记物能够适用于免疫学检测(例如，荧光免疫法测定、酶联免疫法测定、化学发光免疫法测定法等)。这类标记物是本领域熟知的，包括但不限于，荧光染料(例如，荧光素、藻红蛋白(PE)、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、罗丹明)、发光物质(例如化学发光物质吖啶脂类化合物)、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)。本发明中涵盖的标记物可通过本领域已知的方法检测。例如，荧光标记物可以用光检测器检测，以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物，通过检测酶与底物反应得到的产物来检测。在某些实施方案中，可通过不同长度的连接物，将上述可检测的标记连接到本发明的抗体，以降低其潜在的空间位阻。

另一方面，本发明提供了检测样本中ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的方法，其包括本发明抗体的使用步骤。在一个优选实验方案中，本发明的抗体带有可以检测的标记物。在另一个优选的方案中，使用带有可以检测标记的试剂检测本发明的抗体。所述检测方法可用于诊断的目的，或者非诊断的目的(例如，某些细胞或蛋白样品，而非患者)。

实施例1：化学酶法合成Sia-Gal-Gn2GlyFmoc

在氮气条件下，向25mL圆底烧瓶加入全乙酰壳二糖1(36μmol)，将其溶于4mL无水二氯甲烷/甲醇混合溶液中，体积比为4：1，加入20μL甲醇钠，室温反应1h，用TLC检测反应进程。反应完成后，用酸性树脂调节pH至7.0左右，滤去树脂，减压除去溶剂得到中间体2，透明晶体。

向圆底烧瓶中加入2ml去离子水，2g碳酸氢铵，40℃水浴反应24h，用TLC检测反应进程。反应结束后，减压除去溶剂和碳酸氢铵，反复三次，得到中间体3，透明晶体。

向烧瓶中加入2mLDMF溶剂，20mgFmoc-Gly-OPfp，加入吡啶-DMF溶液(140μL/mL，23μL，39μmol)4℃反应24h，用TLC检测反应进程。反应结束后，减压得到淡黄色固体，通过硅胶柱层析纯化得到中间体4，收率70％。

将中间体4溶于去离子水中形成14mM的溶液，取50μL于5mL玻璃瓶中，加入Tris-HCl缓冲液(375μL，100mM，pH 7.5)，氯化镁(5μL，1M)，UDP-Gal(30μL，0.1M)，GalT(40μL，16mg/ml)。于37℃条件下振荡反应12h，用TLC检测反应进程，反应结束后不做任何处理，进入下一步反应。

向上一步的反应混合物中加入CMP-NANA(30μL，0.1M)，SiaT(40μL，24mg/ml)。在37℃条件下振荡反应0.5h，用TLC检测反应进程，反应结束后，加入等体积冷乙醇终止反应，离心(9000g，5min)除去蛋白沉淀，减压旋蒸除去溶剂得到Sia-Gal-Gn2GlyFmoc，产物不需要纯化。

Fmoc-Gly连接的ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物6，表征数据：1HNMR(600MHz，D2O)δ＝7.74～7.79(d，2H)，7.55～7.60(t，2H)，7.32～7.38(t，2H)，7.24～7.31(t，2H)，4.85～4.89(d，J＝10.20Hz，1H)，4.46～4.49(d，J＝6.62Hz，1H)，4.26～4.31(d，J＝7.82Hz，1H)，4.17～4.23(d，J＝13.20Hz，1H)，3.91～3.97(m，1H)，3.35～3.87(m，50H)，1.85～1.94(d，9H)；MS(MALDI TOF)m/z:Calcd For C50H69N5O26，[M-H]-1154.42，Found 1154.44。

实施例2：将标记物连接到载体蛋白(KLH/BSA)上制成糖缀合物

将1mg(1.4μmol)Sia-Gal-Gn2GlyFmoc溶于400μL DMF中，加入40μL哌啶，在室温条件下反应1h，脱去Fmoc保护基。反应进程通过TLC检测，反应结束后减压旋蒸除去溶剂，再用乙酸乙酯洗涤三次得到甘氨酸连接的生物标记物(Sia-Gal-Gn2Gly)，产物不需纯化。

将Sia-Gal-Gn2Gly溶于320μL DMF中，加入80μL磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 8.0)，3.5mg(21μmol)DSG，室温条件下缓慢搅拌反应4h，用TLC检测反应进程，反应完成后减压旋蒸除去溶剂，反应混合物用乙酸乙酯洗三次除去残留的DSG，得到Sia-Gal-Gn2Gly-DSG，产物不需要纯化。

将上一步反应混合物溶于300μL磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 8.0)，80μL去离子水，2mg载体蛋白，在室温条件下反应2.5d，得到Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-KLH/BSA，产物经葡聚糖凝胶柱脱盐纯化得到缀合物。

实施例3：鼠源抗ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物抗体的产生

在本实施例中，通过常规的动物免疫学实验方法，获得抗ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的抗体；利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测抗体的滴度、类型以及抗体对ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的特异性。

3.1免疫学实验

免疫学实验所选用的实验动物为C57BL/6小鼠5-6周龄(获得自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，实验包括空白组、实验组和对照组共计6组，每组五只小鼠，采用皮下注射的方式进行抗原免疫接种。

初次免疫空白组1每只小鼠接种载体蛋白KLH(100μL，5mg/mL)，对照组2每只接种Sia-Gal-Gn2Gly(100μL，0.12mg/mL)，

实验组3每只接种生物标记物与KLH的混合溶液(100μL，含有12μg生物标记物和0.5mgKLH)，

实验组4每只接种Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-KLH(100μL，含有12μgSia-Gal-Gn2)，

实验组5每只接种Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-KLH与弗氏佐剂的混合物(100μL，含有12μgSia-Gal-Gn2，初次免疫接种为弗氏完全佐剂，后续免疫刺激用弗氏不完全佐剂，均按体积比1：1充分混合至完全乳化)，

实验组6每只接种Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-KLH与氢氧化铝佐剂的混合物(100μL，含有12μgSia-Gal-Gn2，与氢氧化铝佐剂按体积比1：1充分混匀)。

免疫接种分别于第7天、第14天、第28天、第35天以相同剂量进行免疫加强，第42天采集血清利用ELISA方法进行检测。

3.2 ELISA法检测血清中抗体滴度

将缀合物(Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-BSA)溶于的碳酸氢盐缓冲液(0.1M，pH 9.6)中，得到标记物浓度为2μg/mL的溶液，100μL每孔包被于聚苯乙烯96孔板(solarbio，3590)中，在37℃条件下封闭1h，吸干孔内溶液，用PBST(含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液pH 7.4)清洗三次，加入100μL 10％BSA-PBST溶液室温封闭1h，吸干每孔溶液，再用PBST清洗三次，所有组的血清从1：300到1：656100稀释，每孔100μL，37℃反应2h，吸干每孔的液体，用PBST清洗三次；将AP(碱性磷酸酶)标记的山羊抗鼠Ig(G+M)(Thermo Fisher Scientific，T2192)按1：1000稀释，每孔100μL室温反应1h，用PBST清洗三次。最后加入对硝基苯基磷酸酯(PNPP)液体底物(Sigam，P7998)，每孔100μL，室温下避光反应30min。用酶标仪读取405nm吸收值。用血清的稀释倍数于对应的光密度(OD)值绘制对数曲线，并获得最佳拟合线。使用线性的方程式来计算OD达到0.1时的稀释值，并且获得抗体效价作为稀释值的倒数，每组测得三次平行结果。

结果如图1所示，将Sia-Gal-Gn2连接到载体蛋白(KLH)上能够诱导产生高滴度的抗体。同时在混合使用佐剂时，能进一步提高抗体滴度。

3.3 ELISA法检测血清中抗体类型

将缀合物(Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-BSA)溶于的碳酸氢盐缓冲液(0.1M，pH 9.6)中，得到标记物浓度为2μg/mL的溶液，100μL每孔包被于聚苯乙烯96孔板(solarbio，3590)中，于37℃封闭1h，吸干孔内溶液，用PBST(含有0.05％吐温-20的pH 7.4磷酸盐缓冲液)清洗三次，加入100μL 10％BSA-PBST溶液室温封闭1h，吸干每孔溶液，再用PBST清洗三次，将缀合物与氢氧化铝佐剂混合免疫组的血清从1：300到1：656100稀释，每孔100μL，37℃反应2h，吸干每孔的液体，用PBST清洗三次；AP(碱性磷酸酶)标记的山羊抗鼠Ig(G+M)、IgG、IgM(Thermo Fisher Scientific，T2192，G-21060，Abcam，ab98672)按1：1000稀释，每孔100μL室温反应1h，用PBST清洗三次。对硝基苯基磷酸酯(PNPP)液体底物(Sigma，P7998)，每孔100μL，室温下避光反应30min。用酶标仪读取405nm吸收值。用标准曲线计算滴度，每个样品测三次。

结果如图2所示，由缀合物与弗氏佐剂混合刺激产生的抗体，其中IgG的滴度显著高于IgM，表明，缀合物与弗氏佐剂混合产生了具有长期记忆性的免疫反应。

3.4 ELISA法检测血清中抗体IgG对ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的特异性

为了检测抗体IgG的特异性，通过上述缀合物的合成制备方法获得缀合物Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-BSA、Sia-Gal-GnGly-DSG-BSA、Gal-Gn2Gly-DSG-BSA、Gn2Gly-DSG-BSA、Gal-GnGly-DSG-BSA，将缀合物分别溶于的碳酸氢盐缓冲液(0.1M，pH 9.6)中，得到糖浓度为2μg/mL的溶液，100μL每孔包被于聚苯乙烯96孔板(solarbio，3590)中，于37℃封闭1h，吸干孔内溶液，用PBST(含有0.05％吐温-20的pH 7.4磷酸盐缓冲液)清洗三次，加入100μL10％BSA-PBST溶液室温封闭1h，吸干每孔溶液，再用PBST清洗三次，将缀合物与氢氧化铝佐剂混合免疫组的血清从1：300到1：656100稀释，每孔100μL，37℃反应2h，吸干每孔的液体，用PBST清洗三次；

AP(碱性磷酸酶)标记的山羊抗鼠IgG(Thermo Fisher Scientific，G-21060)按1：1000稀释，每孔100μL室温反应1h，用PBST清洗三次。

对硝基苯基磷酸酯(PNPP)液体底物(Sigma，P7998)，每孔100μL，室温下避光反应30min。用酶标仪读取405nm吸收值。用标准曲线计算滴度，每个样品测三次。

结果如图3所示，缀合物与弗氏佐剂混合产生的抗体，其IgG能够特异性识别ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物。

由此结果可以看出，抗ALG1-CDG、PMM2-CDG抗体具有作为ALG1-CDG、PMM2-CDG体外临床诊断试剂的价值。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。