一种重组硫酸软骨素酶ac及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种重组硫酸软骨素酶AC及其制备方法与应用。
背景技术
：硫酸软骨素（chondroitin sulfate）是一类线性、硫酸化的酸性多糖，由糖醛酸（L-艾杜糖醛酸或D-葡萄糖醛酸）和半乳糖胺通过1→3糖苷键连接而成的重复二糖单元组成，其平均分子量为25 kDa左右。硫酸软骨素主要包含三类硫酸软骨素A、硫酸软骨素C和硫酸皮肤素。其广泛存在于多种动物组织中，在软骨和结缔组织中含量尤为丰富。硫酸软骨素在降血脂、抗动脉粥样硬化、保护眼角膜等方面具有重要作用，除此之外，硫酸软骨素还作为添加剂广泛用于高档保健品、食品、饮料、滋补品和高档化妆品中。由于其存在分子质量波动大、生物利用度低、口服效果差和疗效不稳定等缺点，限制了其应用。很多研究表明，通过化学法或者酶法制备得到的低分子质量硫酸软骨素(平均分子质量在2～10kDa)可以有效克服以上缺点。
硫酸软骨素酶（ChSase）是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖（△Di及寡糖）的裂解酶，其通过β-消除机理裂解半乳糖胺β(1→4)糖醛酸糖苷键，并在糖醛酸的4,5位形成双键，根据其作用底物的差异主要分为ChSae ABC、ChSaseAC、ChSase B以及ChSase C等类型。目前随着国际上对ChSase AC的关注越来越多，急需一种可以获得大量、廉价ChSase AC的制备工艺方法。目前ChSase AC获取的途径主要是通过硫酸软骨素黄杆菌Flavobacterium heparinum发酵提纯获得，但是硫酸软骨素黄杆菌生长缓慢，ChSase AC表达水平低以及分离纯化复杂，比活力只有18.7 U mg-1，从而直接增加了ChSase AC的生产成本，较低的生产能力和过高的价格是制约其功能研究和应用开发的重要因素。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组硫酸软骨素酶AC及其制备方法与应用。本发明通过分子克隆的方法得到的重组硫酸软骨素酶AC具有较高的酶活力及稳定性能，制备方法简单、成本低，可用于工业上生产低分子量的硫酸软骨素。
本发明的方案通过如下技术手段得以实现：
本发明提供了一种重组硫酸软骨素酶AC，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其基因全长2097 bp，编码701个氨基酸，分子量77 kDa。
另一方面，本发明还提供了编码上述硫酸软骨素酶AC的一种氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供了一种重组硫酸软骨素酶AC的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）以Pedobacter sp. ok626的硫酸软骨素酶AC基因组为模板，采用分别带有BamHI和Xho I酶切位点及5’端保护碱基为引物，按照常规方法进行PCR扩增编码获得目的基因片段；
（2）将目的基因片段与表达载体pET28a连接构建硫酸软骨素酶AC基因的pET-28a-ChSaseAC重组表达载体；
（3）将步骤（2）中构建的pET-28a-ChSaseAC重组表达载体转化进入大肠杆菌宿主菌中，构建硫酸软骨素酶AC基因大肠杆菌工程菌；
（4）硫酸软骨素酶AC基因大肠杆菌工程菌中重组硫酸软骨素酶的诱导表达；
（5）分离纯化步骤（4）所得的表达产物，获得重组硫酸软骨素酶AC蛋白。
进一步地，步骤（1）中所述引物的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示；下游引物序列如SEQ ID NO：2所示。
步骤（1）中所述PCR扩增的反应参数为：95℃起始变性4 min，95℃变性30 s，60℃退火55 s，72℃延伸1 min，循环20次，72 ℃延伸10 min。
步骤（2）中所述的目的基因片段与表达载体pET28a均分别使用Bam HI和Xho I进行双酶切处理。
步骤（2）中所述连接的条件为25℃，12小时；连接体系为：载体2 μL，目的基因6 μL，10×Ligation buffer 1 μL，T4DNA连接酶1 μL。
步骤（4）中所述的诱导表达为：硫酸软骨素酶AC基因大肠杆菌工程菌接种到5 mL含有终浓度50 ug/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，200转/分钟振荡培养至OD600达到0.7后，添加终浓度为0.1mM的IPTG在25℃下振荡15h。
步骤（5）中所述的重组硫酸软骨素酶AC的分子量为77kDa。
本发明还提供了上述的重组硫酸软骨素酶AC在制备低分子量硫酸软骨素中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明使用分子克隆技术通过提取硫酸软骨素酶AC基因设计引物，经PCR扩增后与表达载体连接，构建重组表达载体；将重组表达载体转化至大肠杆菌，构建重组表达转化体，实现重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的可溶性表达。构建过程操作简单，成本低。所构建的重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白表达量高、具有较高的酶活性，粗酶活性可达到5082 U/L。酶活力为325.2.6 U mg-protein，K m值为0.5 mg mL-1, V max为509.43 U·mg-1。且稳定性好，37℃条件下的半衰期为11 h，4℃下的半衰期有28天。可用于低分子量硫酸软骨素的制备，降解肝素原料中的硫酸软骨素，达到去除类肝素原料中的硫酸软骨素的目的。对提升我国ChSase AC的生物表达的技术水平及拓展其应用领域具有重要的科学意义。
附图说明
图1是重组质粒的双酶切琼脂糖电泳分析图；
图2是重组硫酸软骨素酶AC的电泳分析图；其中M代表分子量标记；编号1代表没有加诱导剂的菌液，2代表加入诱导剂后诱导的菌液，3代表超声破碎后的沉淀，4代表超声破碎后的上清，5代表纯化后的目的蛋白；
图3是重组硫酸软骨素酶AC在37℃下的热稳定性分析图；
图4是重组硫酸软骨素酶AC在4℃下的储存稳定性分析图。
具体实施方式
本发明公开了一种重组硫酸软骨素酶AC及其制备方法与应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。
试剂：Pedobacter sp. ok626（GenBank：SDL23104.1）购买于广东微生物菌种保存中心；pET28a、质粒抽提试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司；蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖（PYG）、硫酸软骨素A等购于Sigma。
实施例1：一种硫酸软骨素酶AC基因的克隆
（1）Pedobacter sp. ok626基因组DNA的提取
1）将活化的Pedobacter sp. ok626的菌株接种到含有100 mL蛋白胨-酵母-葡萄糖（PYG）培养基的250 mL锥形瓶中，在10 %的CO2下，37℃培养18小时，5866×g离心得到菌体。
2）将步骤1）中离心收集的菌体用5倍体积的蒸馏水洗涤，振荡沉淀混匀，随后4℃，5866×g离心8分钟，弃上清；重复该步骤一次；研钵中加入无水酒精，充分燃烧，消除研钵中可能存在的RNase；将离心得到的菌体加入液氮预冷的研钵，充分研磨；
3）利用质粒抽提试剂盒对离心后的菌体进行质粒抽提，得到Pedobacter sp.ok626的基因组DNA，-80℃保存。
（2）PCR反应扩增硫酸软骨素酶AC的基因
从NCBI中查到Pedobacter sp. ok626的硫酸软骨素酶AC的基因，设计引物，用于扩增硫酸软骨素酶AC基因的开放读码框，所设计的物中分别含有Bam HI和XhoI两种酶的酶切位点：上游引物序列如SEQ ID NO:1所示：即5’- acttatccttttggcaccataatgaaaagg -3’；下游引物如seq id no:2所示：即5’- ggttctagtaaagcagttcttttggctttt -3’。
以步骤（1）中抽提到的Pedobacter sp. ok626基因组DNA作为模板，利用所设计的引物进行PCR扩增，反应程序：1）95℃下4分钟；2）95℃下30秒；3）60 ℃下55秒；4）72℃下1分钟；5）重复步骤2）到4）20个循环；5）72℃下10分钟。
将PCR产物纯化后与表达载体pET28a分别使用Bam HI和XhoI进行双酶切，双酶切产物纯化回收再进行连接得到重组表达载体pET-28a-ChSaseAC。连接条件为：25℃，12小时；连接体系（10 μL）：载体2 μL，目的基因6 μL，10×Ligation buffer1 μL，T4DNA连接酶1μL；将连接后的重组表达载体pET-28a-ChSaseAC转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单菌落培养，抽提质粒，对质粒进行双酶切验证。图1是重组质粒的双酶切琼脂糖电泳分析图；其中M代表分子量标记；1为重组表达载体pET-28a-ChSaseAC；2，3代表双酶切产物；如图1所示，酶切结果显示出了两条条带分别对应pET28a（5369 bp）和硫酸软骨素酶AC（2040bp），由此验证重组表达质粒连接成功。
将含有重组表达载体的菌落扩大培养后，提取质粒保存甘油菌，并将所提质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。经测序验证本实施例中硫酸软骨素酶AC的基因全长2097 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；编码701个氨基酸，分子量77 kDa，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。需要说明的是，本发明中的硫酸软骨素酶AC不仅限于SEQ ID NO:4序列表中所示的氨基酸序列，还可以是SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且具有相同的蛋白活性的有SEQ ID NO:4所示序列衍生的蛋白质的氨基酸序列。
实施例2：硫酸软骨素酶AC的表达纯化
（1）将实施例1中获得的重组表达载体转化至大肠杆菌BL21 （DE3）中，对该菌株进行培养。然后挑取单菌落接种于含5 mL卡那霉素（50 μg/mL）的LB液体培养中，37℃下过夜培养。
（2）取5 mL的过夜培养的菌液到装有250 mL LB液体培养基（含有50 μg mL-1卡那霉素）的500 mL锥形瓶中，200转/分钟振荡培养至OD600约等于0.7。
（3）加入IPTG至终浓度为0.1 mM，在25℃中诱导15小时。
（4）取全部培养液，4℃下5866×g离心5分钟；将离心后的菌体加入8 mL Tris-HCl缓冲液（50 mM，pH 8.0），置于冰水中进行超声破碎，4℃下5866×g离心20分钟收集上清得到重组硫酸软骨素酶AC粗酶液，其总活力有5082 U L-1。
（5）采用Ni柱亲和纯化获取目的蛋白。吸取1 mL Ni-NTA填料于层析柱中，用无菌水冲洗并用结合液平衡Ni柱。吸取全部平衡后的填料与步骤（3）中得到的上清在4℃下结合2小时。用含20 mM咪唑的Tris-HCl（pH 8.0 50 mM）缓冲液清洗杂蛋白，用含有250 mM咪唑的Tris-HCl（pH 8.0 50 mM）的缓冲液洗脱，收集流出液，经SDS-PAGE证实纯化的目的蛋白为重组硫酸软骨素酶AC。
图2是重组硫酸软骨素酶AC的电泳分析图；其中M代表分子量标记；编号1代表没有加诱导剂的菌液，2代表加入诱导剂后诱导的菌液，3代表超声破碎后的沉淀，4代表超声破碎后的上清，5代表纯化后的目的蛋白。从图2中可见，纯化后的目的蛋白重组硫酸软骨素酶AC通过SDS-PAGE得到一个明显的目的条带，分子量与理论分子量77 kDa一致。
实施例3：重组硫酸软骨素酶AC的酶活力分析
在本实施例中以硫酸软骨素A为底物，测定不饱和二糖在232 nm处吸光度的增加量来计算硫酸软骨素酶AC的酶活力。酶的活力单位为：37℃条件下，每分钟降解硫酸软骨素A形成1 μmoL不饱和寡糖产物的酶量。产物不饱和寡糖在232 nm下的摩尔消光系数为5100M−1cm−1，根据蛋白质标准曲线计算出重组硫酸软骨素酶AC的酶活力。每个实验需独立测定3次，计算标准差。经计算重组硫酸软骨素酶AC的酶活力为325.2.6 U mg-1-protein，K m值为0.5mg mL-1，V max为509.43 U·mg-1。
实施例4：重组硫酸软骨素酶AC的稳定性分析
（1）热稳定性分析
对实施例2所得重组硫酸软骨素酶AC在37℃的条件下进行热稳定性分析，分析过程没有加入任何酶保护剂。
分别取5 μL纯化的重组硫酸软骨素酶AC于895 μL pH 8.0的Tris-HCl缓冲液（50mM）中，于37℃水浴锅中放置5、15、30、60、120、240、360、480、600、720 min，于设定好的时间拿出在4℃冷却1 min后，立即加入100 μL 10 mg·mL-1的硫酸软骨素钠底物溶液开始反应并测定重组硫酸软骨素酶AC的酶活力。图3是重组硫酸软骨素酶AC在37℃下的热稳定性分析图；由图3可知，重组硫酸软骨素酶AC在37℃保温60 min后，能保留90%以上的酶活力，且在该温度下的半衰期为660 min。经测定来源于肝素黄杆菌的硫酸软骨素酶AC加入麦芽糖标签后在30℃中的半衰期为498 min，相比之下，本发明提供的重组硫酸软骨素酶AC具有良好的热稳定。
（2）储存稳定性分析
分别吸取 10 μL纯化的重组硫酸软骨素酶AC于1.5 mL EP管中，离心确保没有气泡后储存于4℃冰箱中，于第1、2、3、4、10、15、20、25、30天取出，加入890 μL pH 8.0 50 mM的 Tris-HCl缓冲液测定重组硫酸软骨素酶AC的酶活力。图4为重组硫酸软骨素酶AC在4℃下的储存稳定性分析图。如图4所示，重组硫酸软骨素酶AC在4℃储存4天后，酶活力损失较大，损失了39%，在储存4~25天之间，该酶比较稳定，仅下降7%，在4℃下重组硫酸软骨素酶AC的半衰期为28天，表明重组硫酸软骨素酶AC在4℃储存稳定性良好，具有良好的存储稳定性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种重组硫酸软骨素酶AC及其制备方法与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acttatcctt ttggcaccat aatgaaaagg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggttctagta aagcagttct tttggctttt 30
<210> 3
<211> 2040
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagtctggtg atgcggcggg tctgatcatg cagcgtatcg ttctggacct gcgtaaaccg 60
attcagtccg ttgataaagc agctgaaaag aacctggcaa ccctgcaggc taacggctct 120
tggaaaggca ttgattacac cgcaaaaacc atcgctaaat gggaaccggg cgatcacctg 180
gttaaactgg aaagcctggt gcaagcgtac gtgaccaaag actctcgtta cttctccaac 240
gatcaggttc tggaagctat cactctggct ctgaaacatt ggtacgatca ggacccgaaa 300
tccagcaact ggtggcataa cgaaatcgcg accccgcagg ctatcggtga actgctgatt 360
cagctgcgta acggcgaatc tcgtatcccg gcggatctgg aaagctccct gatcgaacgt 420
atgaaacgtg gtgatctggc taaacagacc ggtgcaaata aaactgacgt tgcgctgcac 480
tacttctacc gcgctctgct gaccaacaac caggcgctgc tggccacttc ttctgttgaa 540
ctgtttgatc cgatccgtct ggttcattat gatgaaggcc tgcagtatga ttattcttac 600
ctgcagcatg gtccgcagtt gcagatttct agctatggtg cggtatacat caccggcatc 660
ctgaaaatga tcaactacgt tcaaggtacc ccgtacgcga tcagcaacga aaaactgcag 720
ctgttctcta aatactaccg cgaaacctat ctgaaagcga tccgcggcag ctacatggat 780
ttcaacaccg aaggccgtgg cgtttctcgt ccgaacatcc tgcgtaaaaa cactgaaaaa 840
acccgcctga tcaccgctgt tctggttgat ccgctgcacg cggatgaatg gaaatccgct 900
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ttctggattg gcgactatgt gatgcacctg cgtccgggtt actccttcaa cgttcgcatg 1020
gtaagcaacc gtaccaaacg ctctgaatct ggcaacaaag aaaacctgtt tggtcgttat 1080
ctgtctgatg gcgcgactaa tatccaggtg cgtggcccgg aatattataa catcgtaccg 1140
atttgggaat gggacaaaat tccgggtacc accacccgtg attacgcaga agatcgtctg 1200
accaccaaat tctggggtga ggacggctct accgattttg taggtggcgt ttctgacggt 1260
gtttacggtg cttccaccta taccctgaac tatgatagcc tgtctggcaa aaaagcatgg 1320
ttcttctttg atcaagagat tgtgtgcctg ggcgctgata ttcgtagcaa caccccggaa 1380
agcattgtaa ccacggtgaa ccagtcttgg ctgaacggtg atgttcaggg ctctgctatt 1440
gaaggtaaat tcggcaaagg caaaaccgaa gtgttcaaaa acgaccacca gagttggatc 1500
ctgcacgacg gtattggtta cgttttcccg gaagcggcag atatcagcct gagcattaac 1560
acccagaaag gtagctggta caaaattaac aacgcaaaca gcaaaactga actgagcggc 1620
aacgttttta aactgtggat taaccatggc gctaaaccgg aagcagccaa atacgcatac 1680
gtggtgctgc cgggtatcaa aaacaccacc ccgctggtta actttggtaa atctggtatc 1740
cagatcctgg ctaatacccc gcaagtgcag gctgtttcca acgaacctct gaacatggtt 1800
caggccatct tttatgaacc gggcgtgctg aaagcgagcg cctacaccat taaatctgat 1860
aaagcgtgcg cactgctgat taaatctctg aacggtaaag tagtgattag cgtagcagat 1920
ccgaaacaga aagaacgtaa cgcggttatt agtatcacta acaacaaaga tggtaaaacc 1980
actgattatc cggttagctt cccgcagcag gcgttcgcag gcgcgaccgt gatgctgaaa 2040
<210> 4
<211> 701
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Lys Arg Ile Leu Leu Ile Gly Val Leu Thr Leu Ser Met Leu Thr
1 5 10 15
Ser Arg Pro Ala Lys Ala Gln Ser Gly Asp Ala Ala Gly Leu Ile Met
20 25 30
Gln Arg Ile Val Leu Asp Leu Arg Lys Pro Ile Gln Ser Val Asp Lys
35 40 45
Ala Ala Glu Lys Asn Leu Ala Thr Leu Gln Ala Asn Gly Ser Trp Lys
50 55 60
Gly Ile Asp Tyr Thr Ala Lys Thr Ile Ala Lys Trp Glu Pro Gly Asp
65 70 75 80
His Leu Val Lys Leu Glu Ser Leu Val Gln Ala Tyr Val Thr Lys Asp
85 90 95
Ser Arg Tyr Phe Ser Asn Asp Gln Val Leu Glu Ala Ile Thr Leu Ala
100 105 110
Leu Lys His Trp Tyr Asp Gln Asp Pro Lys Ser Ser Asn Trp Trp His
115 120 125
Asn Glu Ile Ala Thr Pro Gln Ala Ile Gly Glu Leu Leu Ile Gln Leu
130 135 140
Arg Asn Gly Glu Ser Arg Ile Pro Ala Asp Leu Glu Ser Ser Leu Ile
145 150 155 160
Glu Arg Met Lys Arg Gly Asp Leu Ala Lys Gln Thr Gly Ala Asn Lys
165 170 175
Thr Asp Val Ala Leu His Tyr Phe Tyr Arg Ala Leu Leu Thr Asn Asn
180 185 190
Gln Ala Leu Leu Ala Thr Ser Ser Val Glu Leu Phe Asp Pro Ile Arg
195 200 205
Leu Val His Tyr Asp Glu Gly Leu Gln Tyr Asp Tyr Ser Tyr Leu Gln
210 215 220
His Gly Pro Gln Leu Gln Ile Ser Ser Tyr Gly Ala Val Tyr Ile Thr
225 230 235 240
Gly Ile Leu Lys Met Ile Asn Tyr Val Gln Gly Thr Pro Tyr Ala Ile
245 250 255
Ser Asn Glu Lys Leu Gln Leu Phe Ser Lys Tyr Tyr Arg Glu Thr Tyr
260 265 270
Leu Lys Ala Ile Arg Gly Ser Tyr Met Asp Phe Asn Thr Glu Gly Arg
275 280 285
Gly Val Ser Arg Pro Asn Ile Leu Arg Lys Asn Thr Glu Lys Thr Arg
290 295 300
Leu Ile Thr Ala Val Leu Val Asp Pro Leu His Ala Asp Glu Trp Lys
305 310 315 320
Ser Ala Ile Ala Arg Thr Asp Ser Ser Ala Ala Pro Asp Tyr Lys Ile
325 330 335
Glu Pro Leu His Lys Gln Phe Trp Ile Gly Asp Tyr Val Met His Leu
340 345 350
Arg Pro Gly Tyr Ser Phe Asn Val Arg Met Val Ser Asn Arg Thr Lys
355 360 365
Arg Ser Glu Ser Gly Asn Lys Glu Asn Leu Phe Gly Arg Tyr Leu Ser
370 375 380
Asp Gly Ala Thr Asn Ile Gln Val Arg Gly Pro Glu Tyr Tyr Asn Ile
385 390 395 400
Val Pro Ile Trp Glu Trp Asp Lys Ile Pro Gly Ile Thr Thr Arg Asp
405 410 415
Tyr Ala Glu Asp Arg Leu Thr Thr Lys Phe Trp Gly Glu Asp Gly Ser
420 425 430
Thr Asp Phe Val Gly Gly Val Ser Asp Gly Val Tyr Gly Ala Ser Thr
435 440 445
Tyr Thr Leu Asn Tyr Asp Ser Leu Ser Gly Lys Lys Ala Trp Phe Phe
450 455 460
Phe Asp Gln Glu Ile Val Cys Leu Gly Ala Asp Ile Arg Ser Asn Thr
465 470 475 480
Pro Glu Ser Ile Val Thr Thr Val Asn Gln Ser Trp Leu Asn Gly Asp
485 490 495
Val Gln Gly Ser Ala Ile Glu Gly Lys Phe Gly Lys Gly Lys Thr Glu
500 505 510
Val Phe Lys Asn Asp His Gln Ser Trp Ile Leu His Asp Gly Ile Gly
515 520 525
Tyr Val Phe Pro Ala Ala Asp Ile Ser Leu Ser Ile Asn Thr Gln Lys
530 535 540
Gly Ser Trp Tyr Lys Ile Asn Asn Ala Asn Ser Lys Thr Glu Leu Ser
545 550 555 560
Gly Asn Val Phe Lys Leu Trp Ile Asn His Gly Ala Lys Pro Glu Ala
565 570 575
Ala Lys Tyr Ala Tyr Val Val Leu Pro Gly Ile Lys Asn Ile Thr Pro
580 585 590
Leu Val Asn Phe Gly Lys Ser Gly Ile Gln Ile Leu Ala Asn Thr Pro
595 600 605
Gln Val Gln Ala Val Ser Asn Glu Pro Leu Asn Met Val Gln Ala Ile
610 615 620
Phe Tyr Glu Pro Gly Val Leu Lys Ala Ser Ala Tyr Thr Ile Lys Ser
625 630 635 640
Asp Lys Ala Cys Ala Leu Leu Ile Lys Ser Leu Asn Gly Lys Val Val
645 650 655
Ile Ser Val Ala Asp Pro Lys Gln Lys Glu Arg Asn Ala Val Ile Ser
660 665 670
Ile Thr Asn Asn Lys Asp Gly Lys Thr Thr Asp Tyr Pro Val Ser Phe
675 680 685
Pro Gln Gln Ala Phe Ala Gly Ala Thr Val Met Leu Lys
690 695 700
