一种制备人肾脏组织单细胞悬液的消化酶及应用
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种制备人肾脏组织单细胞悬液的消化酶及应用。
背景技术
随着scRNA-seq研究和流式细胞术实验在肾脏组织中的应用的发展与革新。单细胞的制备是进行单细胞转录组学、流式细胞技术和细胞原代培养等实验的关键部分。肾脏组织消化通常采用的是以胶原酶为主的酶消化法，但是现有报道的酶消化法消化得到的细胞悬液中含有大量细胞团块，未能达到单细胞悬液制备的要求。
目前常见组织的单细胞悬液的制备方法有机械法和酶消化法。机械法对组织损伤较大，易引起细胞损伤和丢失；酶消化法，所需的组织需要量少，适宜于含结缔组织成分多的标本。机械分离法简单，但由于分离组织不彻底、含有组织块较多、分离的细胞数量偏少等原因，现已较少采用。根据组织类型、研究目的及要求选择恰当方法制备人肾脏单细胞悬液是非常重要的一个实验环节，对于研究肾脏疾病的细胞学机制，探讨防治策略具有重要意义。
有鉴于此，提出本发明。
发明内容
本发明的目的是寻求一种高效人肾脏单细胞悬液的消化酶体系或配方。为实现上述目的，本发明在单因素实验的基础上设计正交组合试验，用不同组合消化酶进行条件优化，最终获得一种高效的人肾脏单细胞悬液消化酶体系，具体提供如下技术方案。
本发明首先提供一种用于高效制备人肾脏组织单细胞悬液的消化酶，其特征在于，所述消化酶包含ColⅡ、ColIV、ColⅠ、DNaseⅠ和透明质酸酶。
进一步的，所述消化酶中ColⅡ、ColIV、ColⅠ、DNaseⅠ和透明质酸酶的浓度比为：40-80:5-10:5-10:4-10:4-10。
在一些优选的方式中，所述消化酶中ColⅡ、ColIV、ColⅠ、DNaseⅠ和透明质酸酶的浓度比为：40:5:10:2:2。
进一步的，所述消化酶中ColⅡ、ColIV、ColⅠ、DNaseⅠ和透明质酸酶的浓度分别为1-4mg/mL，0.125-0.5mg/mL，0.125-0.5mg/mL，0.1-0.5mg/mL和0.1-0.5mg/mL。
在一些优选的方式中，所述消化酶中ColⅡ、ColIV、ColⅠ、DNaseⅠ和透明质酸酶的浓度分别为2mg/mL，0.25mg/mL，0.5mg/mL，0.1mg/mL和0.1mg/mL。
本发明还提供一种上述消化酶在制备人肾脏组织单细胞悬液中的应用。
进一步的，所述应用中包括如下步骤：
1)样本处理步骤：取离体肾脏组织样本，剪碎后PBS清洗，离心去上清；
2)酶消化步骤：加入权利要求1-5任一所述消化酶，孵育混匀；
3)重悬纯化步骤：离心去上清，重悬后纯化。
进一步的，所述步骤1)为：取离体肾脏组织样本，EP离心管中剪碎后用PBS清洗，离心去上清。
进一步的，所述步骤2)为，加入消化酶后37℃孵育10-20min，每经过5-8min混匀一次,DMEM完全培养基终止消化。
进一步的，所述步骤3)为，得到的细胞悬液过滤离心去上清，DMEM培养基重悬后纯化。
本发明还提供一种高效制备人肾脏组织单细胞悬液的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)样本处理步骤：取离体肾脏组织样本，剪碎后PBS清洗，离心去上清；
2)酶消化步骤：加入上述消化酶，孵育混匀；
3)重悬纯化步骤：离心去上清，重悬后纯化。
进一步的，所述步骤1)为：取离体肾脏组织样本，EP离心管中剪碎后用PBS清洗，离心去上清；
在一些优选的方式中：所述步骤1)为：用穿刺针取一条离体穿刺组织样本，将穿刺样本放入离心管中，PBS清洗后300×g离心5min，去除上清液，用剪刀将穿刺样本剪碎，PBS清洗，离心去上清。
进一步的，所述步骤2)为，加入消化酶后37℃孵育10-20min，每经过5-8min混匀一次,DMEM完全培养基终止消化；
在一些优选的方式中，所述步骤2)为，加消化酶后37℃中孵育20min，每过5min混匀一次，DMEM完全培养基终止消化。
进一步的，所述步骤3)为，得到的细胞悬液过滤离心去上清，DMEM培养基重悬后纯化；
在一些优选的方式中，所述步骤3)为，得到的细胞悬液用70um细胞筛过滤，300×g,5min离心，去上清，DMEM培养基重悬后纯化。
与现有技术相比，本发明至少具有如下优势：
1)采用本发明的消化液，处理冻存的肾脏穿刺组织，可以提取单细胞数量为3.2×106个，得到的单细胞悬液中活细胞百分率均在45％以上，该效果优势极其显著。
2)本发明的消化液消化肾脏组织得出的单细胞与传统配方相比，细胞结团比例较少，适于单细胞检测应用。
3)本发明通过改良复合酶消化法，提出了一种制备人肾脏组织单细胞悬液的有效方法，为从单细胞水平研究肾脏中的细胞类型和疾病发生机制提供了条件。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1各类型胶原酶对肾脏组织消化作用的影响；
图2各类型复合胶原酶对肾脏组织消化作用(细胞数目)的影响；
图3各类型复合胶原酶对肾脏组织消化作用(细胞存活)的影响；
图4 5号复合酶配方、10号复合酶配方及11号复合酶作用下的人肾脏单细胞悬液流式细胞图；
图5 5号复合酶配方、10号复合酶配方及11号复合酶消化出的单细胞在显微镜下的计数，200×；白色的圈代表死细胞。
图6 5号复合酶配方、10号复合酶配方及11号复合酶消化出的单细胞在显微镜下的细胞团计数分析。图中纵坐标代表消化后细胞团的百分比。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
下面为具体的实施方法。
本发明材料及主要试剂
新鲜的人肾脏组织穿刺样本是在组织保存液中保存7d后的离体样本；DMEM培养基、Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶(Gibco公司，美国)，透明质酸酶、DNaseⅠ(Sigma公司，美国)、流式细胞染色液、PI染料(BD公司，美国)。
本发明基础方法
1)分解组织到单细胞的方法
在培养皿中将离体组织去外膜去脂肪，新鲜样本放入组织保存液(AQIX)中保存。组织块放入50mL的离心管中，用穿刺针取一条离体穿刺组织样本，把样本在FRS中浸泡30分钟，加入CS10冻存液1ml，-80℃过夜，液氮保存。将穿刺样本放入5mL离心管中，用3mLPBS清洗，300×g离心5min，去除上清液，用剪刀将穿刺样本剪碎，放入PBS清洗，离心去上清。加消化酶在37℃中孵育20min，每过5min混匀一次，用DMEM完全培养基终止消化，得到的细胞悬液用70um细胞筛过滤，300×g,5min离心，去上清，用3mL的DMEM培养基重悬。
2)检测指标及统计分析
取15uL的悬液用细胞计数仪计测量所含的细胞数目及细胞存活率。取1mL的细胞悬液，离心去上清，把细胞沉淀用1mL流式染色液重悬，加入2uL的pI标记细胞，上流式细胞仪检测得到单核细胞的细胞活性。采用Graphpad prism 6软件进行数据的统计和绘图，用spss软件进行分析，所有计量资料以(x±SD)表示。
如下为具体的实施例。
实施例1胶原酶对制备单细胞悬液的作用
消化酶配制方法：用DMEM高糖培养基中加入Ⅰ型胶原酶，Ⅱ型胶原酶，Ⅳ型胶原酶，配制成8mg/mL的原液。
取AQIX中保存5d的新鲜肾脏穿刺样本，分别加入0.125、0.25、0.5、1、2、4mg/mL浓度的80ul的Ⅰ型胶原酶，Ⅱ型胶原酶，Ⅳ型胶原酶，用FMCase作为对照，在37℃下孵育20min，每过5min混匀一次。
不同的胶原酶对肾脏组织的消化效果会产生不同的影响。如图1可知，2mg/mL的Ⅱ型胶原酶对肾脏组织的消化出的单细胞活性较高，可达到85％，低浓度的Ⅳ型胶原酶对于肾脏组织的作用效果强，相同浓度的Ⅱ型胶原酶比Ⅰ型胶原酶对于肾脏组织的消化出的单细胞活性较高，当三种胶原酶的浓度大于1mg/mL，对肾脏组织消化出的单细胞活性比FCMase高。
实施例2复合胶原酶对制备单细胞悬液的作用
综合单因素结果可知，胶原酶总浓度在2mg/mL时对组织的消化能力最强，Ⅱ型胶原酶作用最优，宜使用较高浓度，Ⅰ型胶原酶和Ⅳ型胶原酶为辅助作用酶，宜使用低浓度配比，因胶原酶超过2mg/mL时细胞活性有降低的趋势，可知胶原酶总浓度不宜超过4mg/mL。
采用L9(34)正交表设计9组实验，所添加胶原酶的种类、浓度及配比如表1-9组实验的浓度设计如表2所示。以复合胶原酶为基础消化酶，添加0.1mg/mLDNaseⅠ和0.1mg/mL透明质酸酶，胶原酶能够通过破坏肽键来消化细胞外基质，Ⅰ型DNA酶以防止细胞聚集及透明质酸酶用于切割糖苷键破坏细胞外基质，现阶段大部分用不同类型的胶原酶来消化肾脏组织，DNaseⅠ和透明质酸酶应用浓度为0.1-0.5mg/mL，用于辅助消化。取冻存的穿刺组织样本，每组3个重复，消化条件同上，制成单细胞后统计各种复合酶消化下单细胞总数目和细胞活率。
表1胶原酶对肾脏组织消化作用的正交实验
表2复合胶原酶对肾脏组织消化作用的实验设计
以消化出的单细胞数目及活性为因变量，分别考察Ⅰ型胶原酶，Ⅱ型胶原酶，Ⅳ型胶原酶三种胶原酶不同浓度的复配对肾脏组织消化效果的影响，结果统计如图2和图3；应用SPSS 19.0软件进行数据分析，极差分析结果如表3，表4。
由表3可以看出，3种胶原酶Ⅰ型胶原酶，Ⅱ型胶原酶，Ⅳ型胶原酶对消化成单细胞数目多少的的影响依次为：colⅠ＞colⅣ＞colⅡ即colⅠ是影响组织消化成足够数量的细胞的主要因素。比较K值大小，确定最优激素组合为2mg/mLcolⅡ+0.25mg/mLColIV+0.25mg/mLcolⅠ。
由表4可以看出，3种胶原酶Ⅰ型胶原酶，Ⅱ型胶原酶，Ⅳ型胶原酶对消化成单细胞成活率的的影响依次为：colⅡ＞colⅠ＞colⅣ，即colⅡ是影响组织消化成高活率单细胞的主要因素。比较K值大小，确定最优激素组合为2mg/mLcolⅡ+0.25mg/mLColIV+0.5mg/mLcolⅠ；而图2中第5组复合酶配方在9组实验中消化所得的单细胞数目最多，即2mg/mLcolⅡ+0.25mg/mLColIV+0.5mg/mLcolⅠ消化所得的组织单细胞的平均细胞数目可达到3160000±95393.92，而第10组用文献参考的酶消化所得的单细胞的平均细胞数目为3133333.33±241269.78，第11组对照用的广谱复合型酶FCMase消化所得的单细胞的平均细胞数目为1596666.66±146780.25，第5组与第10组酶消化所得的单细胞数目差异性不显著，且P值为0.916，与第11组相比较，差异极显著，P值为0.001。各复合酶对消化成单细胞成活率的的影响差异不显著。
表3复合胶原酶对肾脏组织消化所得细胞数目的极差分析
表4复合胶原酶对肾脏组织消化的细胞成活率的极差分析
实施例3最优复合酶体系建立
基于上述实施例1和2建立本发明的优势复合酶体系：
1-2mg/mL的colⅡ，0.125-0.5mg/mL的ColIV，0.125-0.5mg/mL的colⅠ，0.1-0.5mg/mL的DNaseⅠ和0.1-0.5mg/mL的H酶；
其中最优复合酶体系为：
2mg/mL colⅡ+0.25mg/mL ColIV+0.5mg/mL colⅠ+0.1mg/mL DNaseⅠ+0.1mg/mL H酶。
利用上述最优复合酶体系针对冻存的1条新鲜的穿刺肾脏组织(约10mg)进行处理。经统计，由上述图2和图3可以看出，在此酶体系消化下(即5号复合酶)可以提取单细胞数量为3.2×106个，得到的单细胞悬液中活细胞百分率均在45％以上。
实施例4与商品化消化酶效果比较
分别采用本发明最优复合酶体系(5号)与商品化酶体系(10号)LiberaseTM0.025mg/mL+0.05mg/mLDNaseⅠ和(11号)FCMase+0.1mg/mLDNaseⅠ，在同等处理条件下进行效果比较。
结果，由图4中流式分析可知，5号最优复合酶配方处理后，PI阳性细胞数目较少，颗粒度较大的代表细胞结团，由图可知细胞团数量较少。图5中5号复合酶配方得到的死细胞比例较少，图6中5号酶消化下的细胞团比例为12％，比10号酶解消化出的细胞团数目要低，本发明消化酶消化肾脏组织得出的单细胞与酶Liberase TM配方相比细胞结团比例较少。11号复合酶消化出的肾脏单细胞细胞团的比例也较低，但由图2可知11号酶消化出的单细胞总数较低，所以综合来看5号复合酶消化出的单细胞细胞数目较多，死亡率较低，且细胞团较少，宜试用于人肾脏单细胞的悬浮液的制备，其效果某种意义上超出实验预期。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
