具体实施方式

生物胺含量采用高效液相(HPLC)进行检测。

酶活测定方法：使用间接测定方法测定生物胺氧化酶活力，胺氧化酶作用于生物胺，将生物胺降解为相应的醛类和过氧化氢，在过氧化物酶存在的条件下，过氧化氢与4-氨基安替吡啉和2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸生成亚琨染料，该产物在510nm处有最大吸收值，胺氧化酶活力的大小在一定范围内与产物颜色的深浅呈线性关系，故可通过测定A510的变化来测定胺氧化酶的活力。反应在96孔板中进行，反应体系包括10μL酶液(150mg·L^-1)，100μL配制溶液(包括200mmol·L^-1、pH＝7.6的磷酸钾缓冲液，1.5mmol·L^-1 4-氨基安替吡啉，1mmol·L^-1 2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸)，为开始反应，加入20μL生物胺溶液(10mmol·L^-1)和70μL过氧化物酶(1.4mg·mL^-1)，测定吸光度为510nm，反应温度为37℃，反应时间为10min。

酶活的定义：将每分钟生成1μmoL H₂O₂所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

实施例1：S.hirsuta J2中含铜胺氧化酶基因的PCR扩增

根据NCBI数据库中的披发糖多孢菌(Saccharopolyspora hirsuta)中的胺氧化酶基因(Protein ID为WP_150069050.1)设计引物，以本研究室保藏的S.hirsuta J2(保藏编号为CCTCC NO：M 2020103，公开于公开号为CN111961615A的专利申请文件中)基因组为模板，扩增多铜氧化酶基因。扩增所需的引物如下：上引物序列(5'→3')为ATGATGGCGATGCACCCGCTGG；下引物序列(5'→3')为TCAGGACTCGCAGCAGTGGG。按照HS DNA Polymerase with GC Buffer的反应体系的要求配置PCR反应液，PCR扩增体系如下：98℃预变性10s，55℃退火30s，72℃延伸(1min·kb^-1)循环30次。

以S.hirsuta J2的基因组为模板，进行PCR扩増，PCR产物由1％琼脂糖凝胶电泳验证扩增结果，如图1所示扩增出的序列大小与目标基因序列大小相同，约为1900bp，表明S.hirsuta J2中含有含铜胺氧化酶基因，将PCR产物纯化后送至公司测序，测序结果如SEQID NO.1所示。

实施例2：基因工程菌E.coli BL21-pET28a-CuAO^Shir的构建

(1)获得目的片段。

以S.hirsuta J2全基因组序列作为模板，将引物和全基因组DNA共同完成PCR扩增，PCR反应体系与扩增程序与实施例1所述相同，对条带验证正确的PCR产物凝胶小心割下，回收并纯化。

(2)酶切与连接。

将质粒pET-28a(+)与目的片段分别用限制性内切酶Nde I和EcoR I进行双酶切，酶切体系如以下所示：目的基因片段40μL，质粒40μL，限制性内切酶Nde I和EcoR I各2.5μL，Green Buffer 5μL。将酶切体系中所述组分充分混匀，然后置于37℃金属浴中反应45min。双酶切后的基因片段和质粒经过回收纯化后，按摩尔比4～10：1的比例混合，加入等体积Solution I连接酶，充分混匀后置于16℃金属浴中保温过夜。

(3)转化。

将-80℃保藏的E.coli BL21(DE3)感受态细胞置于冰上冰浴5～10min后，用移液枪吸取5～10μL待转化的连接产物，加入感受态细胞中，轻轻地吹吸混匀，均匀混合后冰浴30min。冰浴结束后，42℃热击90s，完成后立即取出在冰中放置2～5min。然后加入700μL LB液体培养基，37C，200r·min^-1振荡培养45～60min。8000r·min^-1离心2min，弃去大部分上清液，留100μL左右上清液重悬菌体。菌液均匀涂布于含有30mg·L^-1卡那霉素的LB固体培养基平板上，倒置于37℃培养箱中过夜培养，培养至长出单菌落后PCR验证，筛选阳性转化子。

(4)酶切验证。

提取重组菌的质粒，进行Nde I和EcoR I双酶切，如图2所示，分别得到5369bp的pET-28a(+)片段和1927bp的目的片段，将目的片段送至公司测序，测序结果与目的基因序列一致，验证重组菌E.coli BL21-pET28a-CuAO^Shir构建成功，将该菌株表达的重组酶命名为CuAO^Shir。

实施例3：重组酶CuAO^Shir的诱导表达与纯化

(1)重组酶CuAO^Shir的诱导表达

将实施例2构建的重组菌接种至含有50mg·L^-1氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃，150r·min^-1条件下培养12h。将种子液以2％(v/v)的接种量转接到含有50mg·L^-1卡那霉素的TB发酵培养基中，于37℃，160r·min^-1条件下培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为0.25mmol·L^-1的IPTG，于25℃，160r·min^-1条件下培养12h后，菌液OD₆₀₀为1.5。将菌液在4℃，12000r·min^-1条件下，离心10min后收集下层菌体，加入0.2mol·L^-1的磷酸钠缓冲液(pH 7.4)重悬菌体后离心收集菌体，重复上述步骤两次。使用超声波细胞破碎仪破碎菌体，超声条件为：400W，工作1s，间隔1s，破碎时间为5～15min。破碎完成后于4℃，12000r·min^-1离心收集上层清液，过0.45μM滤膜，低温保存备用,上清液酶活为40U/L。

(2)重组酶CuAO^Shir的纯化

亲和层析柱HisTrap^TMHP(GE Healthcare)纯化蛋白，采用AKTA avant 25仪器分离纯化目的蛋白，其操作步骤如下：

1、机器自检，打开软件，设置程序，洗泵，接柱子。

2、用含有20mM咪唑，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液平衡15个柱体积，流速为1mL·min^-1。

3、将重组工程菌悬浮于缓冲液中(50mmol·L^-1PBS，pH 7.40，0.50M NaCl)，采用超声破碎获得粗酶液，0.45μM滤膜过滤，上样到上述平衡后的柱子中，流速为1mL·min^-1。

4、用20mM咪唑，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液冲洗5～10个床体积，流速为1mL·min^-1。

5、用含有500mM咪唑，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液运行线型洗脱(斜率为5，冲洗20个柱体积，缓冲液2浓度从0至100％，然后100％缓冲液2冲洗8～10个柱体积)，流速为1mL·min^-1，用SDS-PAGE检测各阶段洗脱的蛋白的分子量大小和纯度，蛋白纯化过程及SDS-PAGE检测结果如图3所示，蛋白量为200mg/L。

6、纯水冲洗5～10个柱体积，然后20％的酒精冲洗3～5个体积，流速为1mL·min^-1。

实施例4：重组酶CuAO^Shir降解生物胺

对重组酶CuAO^Shir进行酶活测定，探究了其对8种生物胺的氧化脱氨作用，由表1所知，其对色胺、苯乙胺、尸胺、组胺、酪胺有不同程度的氧化能力，其中对苯乙胺、组胺、酪胺的氧化能力较强，当以苯乙胺为底物时，比活力为0.50U·mg^-1，以组胺为底物时，比活力为0.45U·mg^-1，以酪胺为底物时，比活力为0.47U·mg^-1。使用HPLC对加酶前后8种单胺溶液中的生物胺含量进行检测，由图4可知，重组酶CuAO^Shir对苯乙胺、组胺和酪胺的降解能力最为显著，加酶24h后，降解率分别为67.14％、68.25％和60.58％；其次为色胺，降解率为32.28％；对腐胺、亚精胺和精胺的降解能力极弱，降解率均不到10％。

表1 CuAO^Shir对不同生物胺的氧化活性

实施例5：重组酶CuAO^Shir的酶学性质研究

(1)重组酶CuAO^Shir的最适反应pH

改变反应体系pH为4～9，测定在不同pH反应条件下重组酶CuAO^Shir的酶活，以最高酶活为100％，计算各个pH点的相对酶活，结果如图5所示，CuAO^Shir在中性环境下有较高活性，当底物分别为苯乙胺、组胺和酪胺时，CuAO^Shir对苯乙胺的最适pH为6.5，对组胺和酪胺的最适pH为7，在pH6.5～7.5之间均可以维持相对酶活在80％以上。

(2)重组酶CuAO^Shir的最适反应温度

改变反应温度为20～70℃，测定在不同温度反应条件下重组酶CuAO^Shir的酶活，以最高酶活为100％，计算各个温度点的相对酶活，结果如图6所示，在反应温度为35～60℃时酶活较高，当底物分别为苯乙胺、组胺和酪胺时，CuAO^Shir的最适反应温度均为45℃，且在45～50℃之间均可以维持相对酶活在80％以上。

(3)乙醇对重组酶CuAO^Shir酶活的影响

在重组酶最适反应pH、温度条件下，将酶液在将酶液在含有0、3、7、10、15、18、20％(v/v)乙醇的缓冲液中放置1h后测定酶活力。以最高酶活为100％，计算各个乙醇浓度环境下的相对酶活，结果如图7所示，低浓度的乙醇对CuAO^Shir酶活影响不大，当乙醇浓度为3％时，重组酶CuAO^Shir的相对酶活大于89％，因此，CuAO^Shir在含有低浓度乙醇的食品中具有良好的应用潜力；而CuAO^Shir在较高乙醇含量(15～18％vol)的环境下残余酶活大于40％，同时，相比于苯乙胺，CuAO^Shir在较高乙醇浓度环境中对组胺和酪胺的残余酶活较高，因此，CuAO^Shir有一定的乙醇耐受性，在黄酒、葡萄酒等发酵酒中具有一定的应用价值。

实施例6：重组酶CuAO^Shir在黄酒中的应用

将重组胺氧化酶分别加入市售黄酒中(含量为1g蛋白·L^黄酒-1)，于室温静置24h后测定生物胺的含量，对照组为不加酶的市售黄酒。结果如图8所示，市售黄酒含有除色胺和精胺外的6种生物胺，总生物胺含量为59.58mg·L^-1，酪胺、尸胺为其中主要的生物胺，重组酶CuAO^Shir对市售黄酒的总生物胺降解率为30.25％，对酪胺的降解率最高，为38.09％。

实施例7：重组酶CuAO^Shir在酱油中的应用

将重组胺氧化酶分别加入市售黄酒中(含量为1g·L^-1)，于室温静置24h后测定生物胺的含量，对照组为不加酶的市售黄酒。结果如图9所示，对市售酱油的总生物胺降解率为18.29％，对其中主要的生物胺——组胺和酪胺的降解率分别为25.02％和24.45％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

江南大学（绍兴）产业技术研究院

浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司

<120> 一种披发糖多孢菌来源的可降解生物胺的含铜胺氧化酶及其应用

<130> BAA210772A

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1914

<212> DNA

<213> Saccharopolyspora hirsuta

<400> 1

atgacgatgc acccgctgga accgctgagc gcggcggagg tcctgcgcaa ccgagatgtc 60

ctgcagcagg cgggcctgct gcgcgagtcg acccgcttcc ccctggtgca gctggcggaa 120

ccggacaagg ccaccgtgct cgcgcaccgc gacggcgacc cggtggagcg ccgggcgcgc 180

tcggtgctgc tggacgtcaa gaccggggag ctgaccacca ccctggtctc gctgaccagc 240

ggtgaagtgg tgggcaaggc cgtggtgaac ccggtcgagc agggccagcc gccggtgatg 300

ctcgacgagt acgagctggt cgagcgcgtc gtgcgcgacg acgagacctg gcagcgcgcc 360

atccgcgacc gcggcttcga cgacctcacc aaggtgcggg tgtgcccgct gtcggccggg 420

tggttcggcg tcgccgagga gagcggccgc cgcatgctgc gggccctggc cttcgcccag 480

aacagcccgg acgaactgcc ctgggcgcac ccgatcgacg gactggtggc ctacgtcgac 540

gtgatcgagc agcgggtgct ggaggtggtc gacgaccgga agttcccggt accggccgag 600

agtggcgact acaccgacga ggcggtgacc ggcccgctgc gcgacacgct gcgcccgatc 660

gagatcaccc agcccgaggg gcccagcttc caggtcgacg ggcacgaggt gcggtgggag 720

aactggcgat tccgcatcgg cttcgacccg cgcgaaggcc tggtgctgca ccagctgtcg 780

ttccgcgacg gcgaccgcga gcggccggtg gtctaccggg cctccatcgg cgagatggtg 840

gtcaactacg gcgacccgtc gccggcccgg ttctggcaga actacttcga ctcgggcgag 900

tactcgctgg gcaagctcgc caacgagctg gtgctcggct gcgactgcct cggcgagatc 960

cgctacttcg acgcggtggt ggcccaggag gacggcacgc cgcgcaccct gcgcaacgcg 1020

gtgtgcatgc acgaggagga cttcggggtg ctgtggaagc acaccgacgt gttcaccggc 1080

acggccgaga cccggcggca gcggcggctg gtggtgtcct tcttcgtctc cgtcggcaac 1140

tacgactacg gcttctactg gtacctctac ctggacggca ccatccagct ggagaccaag 1200

gcgaccggca tcgtgttcac ctcggcctac ccggaggagg gcacgcgctg ggccaacgag 1260

ctcgcccccg gcctcggcgc cccgtaccac cagcacctgt tcggcgcgcg gctggacatg 1320

atggtggacg gcacccgcaa cgcggtggac gaggtggcgg cccagcgggt gccgatcagc 1380

gcggacaacc cgcacggcaa cgccttcacc cgcagcgtca cccggttggc gcgggagagc 1440

gatggcgggc gcgaggcgga tccggccgcg ggccgcgcct ggcacgtggt caacaccgag 1500

cgcaccaacc gcctcggcca gccggtcggc tacgcgctgc tcccgcaggg caccccggtg 1560

ctgctggccg acccggagtc ctcgatcgcc cagcgcgccg cgttcgcgac caagcacctg 1620

tgggtcaccc agcacgccga ggatgagcgc tacccggcgg gggagtgggt gaaccagagc 1680

cacggcggtg cgggcatccc ggcgttcacc gcggcggacc gcagcatcga cggcgaggac 1740

atcgtgctgt ggcacacctt cggcctgacc cacttccccc gccccgagga ctggccgatc 1800

atgccggtgg actactgcgg cttcaccctg aagccggtgg gcttcttcga ccgcaacccc 1860

accctcgacg tcccacccaa ccccagcacc ggctcccact gctgcgagag ctga 1914

<210> 2

<211> 637

<212> PRT

<213> Saccharopolyspora hirsuta

<400> 2

Met Thr Met His Pro Leu Glu Pro Leu Ser Ala Ala Glu Val Leu Arg

1 5 10 15

Asn Arg Asp Val Leu Gln Gln Ala Gly Leu Leu Arg Glu Ser Thr Arg

20 25 30

Phe Pro Leu Val Gln Leu Ala Glu Pro Asp Lys Ala Thr Val Leu Ala

35 40 45

His Arg Asp Gly Asp Pro Val Glu Arg Arg Ala Arg Ser Val Leu Leu

50 55 60

Asp Val Lys Thr Gly Glu Leu Thr Thr Thr Leu Val Ser Leu Thr Ser

65 70 75 80

Gly Glu Val Val Gly Lys Ala Val Val Asn Pro Val Glu Gln Gly Gln

85 90 95

Pro Pro Val Met Leu Asp Glu Tyr Glu Leu Val Glu Arg Val Val Arg

100 105 110

Asp Asp Glu Thr Trp Gln Arg Ala Ile Arg Asp Arg Gly Phe Asp Asp

115 120 125

Leu Thr Lys Val Arg Val Cys Pro Leu Ser Ala Gly Trp Phe Gly Val

130 135 140

Ala Glu Glu Ser Gly Arg Arg Met Leu Arg Ala Leu Ala Phe Ala Gln

145 150 155 160

Asn Ser Pro Asp Glu Leu Pro Trp Ala His Pro Ile Asp Gly Leu Val

165 170 175

Ala Tyr Val Asp Val Ile Glu Gln Arg Val Leu Glu Val Val Asp Asp

180 185 190

Arg Lys Phe Pro Val Pro Ala Glu Ser Gly Asp Tyr Thr Asp Glu Ala

195 200 205

Val Thr Gly Pro Leu Arg Asp Thr Leu Arg Pro Ile Glu Ile Thr Gln

210 215 220

Pro Glu Gly Pro Ser Phe Gln Val Asp Gly His Glu Val Arg Trp Glu

225 230 235 240

Asn Trp Arg Phe Arg Ile Gly Phe Asp Pro Arg Glu Gly Leu Val Leu

245 250 255

His Gln Leu Ser Phe Arg Asp Gly Asp Arg Glu Arg Pro Val Val Tyr

260 265 270

Arg Ala Ser Ile Gly Glu Met Val Val Asn Tyr Gly Asp Pro Ser Pro

275 280 285

Ala Arg Phe Trp Gln Asn Tyr Phe Asp Ser Gly Glu Tyr Ser Leu Gly

290 295 300

Lys Leu Ala Asn Glu Leu Val Leu Gly Cys Asp Cys Leu Gly Glu Ile

305 310 315 320

Arg Tyr Phe Asp Ala Val Val Ala Gln Glu Asp Gly Thr Pro Arg Thr

325 330 335

Leu Arg Asn Ala Val Cys Met His Glu Glu Asp Phe Gly Val Leu Trp

340 345 350

Lys His Thr Asp Val Phe Thr Gly Thr Ala Glu Thr Arg Arg Gln Arg

355 360 365

Arg Leu Val Val Ser Phe Phe Val Ser Val Gly Asn Tyr Asp Tyr Gly

370 375 380

Phe Tyr Trp Tyr Leu Tyr Leu Asp Gly Thr Ile Gln Leu Glu Thr Lys

385 390 395 400

Ala Thr Gly Ile Val Phe Thr Ser Ala Tyr Pro Glu Glu Gly Thr Arg

405 410 415

Trp Ala Asn Glu Leu Ala Pro Gly Leu Gly Ala Pro Tyr His Gln His

420 425 430

Leu Phe Gly Ala Arg Leu Asp Met Met Val Asp Gly Thr Arg Asn Ala

435 440 445

Val Asp Glu Val Ala Ala Gln Arg Val Pro Ile Ser Ala Asp Asn Pro

450 455 460

His Gly Asn Ala Phe Thr Arg Ser Val Thr Arg Leu Ala Arg Glu Ser

465 470 475 480

Asp Gly Gly Arg Glu Ala Asp Pro Ala Ala Gly Arg Ala Trp His Val

485 490 495

Val Asn Thr Glu Arg Thr Asn Arg Leu Gly Gln Pro Val Gly Tyr Ala

500 505 510

Leu Leu Pro Gln Gly Thr Pro Val Leu Leu Ala Asp Pro Glu Ser Ser

515 520 525

Ile Ala Gln Arg Ala Ala Phe Ala Thr Lys His Leu Trp Val Thr Gln

530 535 540

His Ala Glu Asp Glu Arg Tyr Pro Ala Gly Glu Trp Val Asn Gln Ser

545 550 555 560

His Gly Gly Ala Gly Ile Pro Ala Phe Thr Ala Ala Asp Arg Ser Ile

565 570 575

Asp Gly Glu Asp Ile Val Leu Trp His Thr Phe Gly Leu Thr His Phe

580 585 590

Pro Arg Pro Glu Asp Trp Pro Ile Met Pro Val Asp Tyr Cys Gly Phe

595 600 605

Thr Leu Lys Pro Val Gly Phe Phe Asp Arg Asn Pro Thr Leu Asp Val

610 615 620

Pro Pro Asn Pro Ser Thr Gly Ser His Cys Cys Glu Ser

625 630 635

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgatggcga tgcacccgct gg 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcaggactcg cagcagtggg 20