具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于本发明的进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可用于本发明中。

本申请实施例中使用的培养基西方如下：

LB培养基：酵母膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。

TB培养基：24g酵母膏，12g蛋白胨，4g甘油加入蒸馏水溶解并定容至900mL为A液。称取12.54g K₂HPO₄和2.31g KH₂PO₄加入蒸馏水溶解并定容至100mL为B液。二者单独高温灭菌处理，冷却至室温后，于无菌工作台将A液与B液混合即得。

固体培养基则是在液体培养基中加2％的琼脂。

实施例1：重组质粒构建

(1)根据NCBI上登录号为4MLS_B的SpyTag基因序列、登录号为AFD50637.1的SpyCatcher基因序列以及p53dim基因串联送至公司全合成，构建质粒pETDuet-TXC。所述酿脓链球菌Streptococcuspyogenes菌来源的SpyTagSpyCatcher的核苷酸序列如SEQ IDNO.4，所述肿瘤抑制因子来源的p53二聚结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。

(2)以实验室保存的质粒pETDuet-AldO为模板，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2，P1和P2为引物进行PCR，通过PCR扩增得到含有天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor A3(2)来源的醛醇氧化酶AldO的基因片段。PCR扩增体系为：模板1μL，上下游引物各1μL，primerSTAR 25μL，ddH2O 22μL。PCR条件为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃90s，72℃5min，30个循环。PCR产物胶回收后，采用Sal I和Sac I双酶切再次胶回收，获得目标片段。以质粒pETDuet-TXC为模板，采用Sal I和Sac I双酶切胶回收得到骨架。加入2μL骨架，1.5μL目标片段，1μL T₄ buffer，0.5μL T₄ ligase、5μL ddH₂O于16℃金属浴过夜连接。转化E.coli JM109，菌落PCR筛选阳性转化子。挑出2个阳性转化子接种到LB液体培养基中，37℃，培养12h，交由上海生工进行测序，测序正确表明基因工程菌pETDuet-TXAC构建成功。将重组质粒pETDuet-TXAC转化E.coli BL21(DE3)。筛选阳性转化子后获得基因工程菌pETDuet-TXAC BL21(DE)。

表一引物

实施例2：醛醇氧化酶二聚体酶的发酵与纯化

(1)将实施例1最终获得的基因工程菌pETDuet-TXAC BL21(DE)接种于含10μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基中，37℃，200-220rpm培养12-16h；按1-2％的接种量转接到含10μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基中，先于30℃、200-220rpm，培养3-5h直至600nm处的光密度值达到0.4至0.8时，加入终浓度为1mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，16-18℃、200-220rpm，培养20-24h。

(2)发酵液于10000rpm，4℃条件下离心10min，收集沉淀，用重悬液重悬菌体，重悬液组成：20mM Na₂HPO₄、20mM咪唑、500mM NaCl、1mM DTT、0.5mM PMSF，pH 7.4，后经超声破碎后离心，上清即为醛醇氧化酶二聚体的粗酶液(如图一泳道一)，首先采用Ni-NTA亲和层析对目标蛋白进行纯化，得到三条蛋白条带(如图一泳道二)。我们采用SEC分子筛对目标蛋白进行进一步分离纯化，第三条泳道为单一的目标蛋白条带，即成功获得纯化的醛醇氧化酶二聚体catAldO。经基因测序，醛醇氧化酶二聚体catAldO核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

实施例3：醛醇氧化酶二聚体酶活力的测定：

采用比色法测定醛醇氧化酶二聚体酶活。在最适反应条件下，每生产1μmol H₂O₂所需用的酶量为一个酶活力单位。酶活测定条件：在55℃条件下，20μL 1mg/mL醛醇氧化酶二聚体纯酶液，10μL 1mg/mL辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)，1470μL 0.1mM2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid)，ABTS)，500μL200mM甘油(D-山梨糖醇、D-甘露醇、L-阿拉伯糖、1,2-丙二醇)混合均匀后反应，通过紫外-可见分光光度法在线检测420nm处吸光度值。酶活的具体计算公式如下：

上式中ΔOD₄₂₀为420nm处的吸收值变化；K表示酶液的稀释倍数；ε为毫摩尔消光系数(值为36L·mmol^-1·cm^-1)；V_cell为比色皿中反应液的总体积；V_enzyme表示加入到比色皿中酶液的体积，同一样品测量3次取平均值并计算标准差。

实施例4：催化特性

对纯化醛醇氧化酶二聚体(catAldO)进行催化特性方面的研究，具体见表2。可以观察到，catAldO对甘油的催化效率较出发菌株以及四突变株分别提高了78.4倍和7倍。以及catAldO对大部分糖醇类底物的亲和力以及催化效率均展现出不同程度的提升。

K_m和K_cat的具体计算方法如下

酶相对于底物甘油的动力学常数：测定酶在55℃，50mM pH 8.0的PBS缓冲液中，对不同浓度的甘油(0～200mM)的催化活性。按照标准酶活力测定方法，于最适反应条件下反应，利用紫外-可见分光光度计连续监测一段时间内终产物吸光度值随时间的变化曲线如图2所示。取动力学曲线上线性段的始、终OD值，将吸光度值随时间的增加速率转化为底物浓度随时间的增加率(以μmol·min^-1表示)

利用Origin 2019软件根据如下公式拟合曲线，得到K_m与V_max

上式中V表示反应初始速度，μmol/s；V_max为最大反应速度，μmol/s；S表示底物浓度，mM；K_m为米氏常数，mM。

酶的转化数(K_cat)可通过下式计算：

上式中V_max表示最大反应速率，μmol/s；[E]表示蛋白浓度，μg/mL；V为酶体积，mL；Mr表示酶分子量，μg/μmol；

表二催化特性

源于Streptomyces coelicolor的醛醇氧化酶(alditol oxidase，AldO)具有宽泛的底物谱，对糖醇以及脂肪族、芳香族类1,2-偕二醇均具有一定的催化能力。本研究选取山梨糖醇、甘露糖醇、阿拉伯糖以及1,2-丙二醇为底物，测定catAldO的底物特异性，并确定了一些代表性底物的稳态动力学参数，结果如表二所示。首先catAldO对甘油的催化活性有较显著提高，其中，野生型AldO、四突变型AldO以及catAldO对甘油的展现出不同的底物特异性，K_m值分别为350、111、52.1mM。catAldO相较于野生型酶和四突变体型的亲和力分别提升了6.7倍和2.1倍。并且catAldO对糖醇类底物的亲和力展现出10-24倍催化效率的提升。其中，山梨糖醇为catAldO最适底物，对其具有极高的亲和力(K_m＝0.09mM)。另一方面，周转率增加，这为所有底物提供了更高的催化效率。

实施例5：酶学性质

对纯化醛醇氧化酶二聚体(catAldO)与野生型及四突变型的醛醇氧化酶的最适反应条件以及稳定性进行比较，具体见表3。

表三

表三为本文catAldO与已报道的AldO相关研究中酶学特性的比较。

一方面，我们比较了hisAldO与catAldO最适反应条件，二者的最适温度较高，为55℃，并且在较宽温度范围(30℃～55℃)内，均能保持50％以上的活性。温度在40-60℃时，但对catAldO的活力影响较小，仍能维持80％活性。然而，当温度高于60℃时，两者酶活均呈下降趋势。总体而言，catAldO与hisAldO均呈现为嗜热酶的性质，有较广的反应温度范围。以及，hisAldO与catAldO最适pH为中偏碱性，分别为pH 7.0与8.0。pH对二者酶活影响显著，catAldO仅在pH 6～8范围内保持60％以上活力，而hisAldO仅在pH 6～7之间能保持60％以上活性，当pH偏离范围时，其活力均会显著下降。当pH值低于5或高于10时，二者均丧失活力。我们发现catAldO和hisAldO具有接近的最适反应条件，但是无论在何种反应环境中，catAldO的酶活力均明显高于hisAldO。

另一方面我们比较了hisAldO与catAldO的稳定性。研究结果表明，随温度的升高，catAldO的酶活性在40℃时达到最高。40℃至45℃，酶活缓慢下降。当温度高于此范围时，酶的稳定性显著下降，在55℃中孵育30min后二者均基本丧失酶活。在pH稳定性方面，hisAldO与catAldO在中偏碱性环境中具有良好的pH稳定性。其中，catAldO在pH6～10中孵育1h后，仍然能保持相对酶活80％以上，展现出较好的pH稳定性。但是，当pH值低于6时，catAldO的酶活基本完全丧失。hisAldO在缓冲液pH 6-9中孵育1h后仍能维持较好活性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚说明本发明所做的举例，而非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无需予以穷举。但是，这些均属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110> 华侨大学

<120> 一种醛醇氧化酶二聚体及其制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1882

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcccatatt gtcatggttg atgcatacaa gccgaccaaa ggttcaggtg ctagcggcgg 60

aggtggctca gaagccgcag caaaaggtgg aggaggctca acaggaggag aatatttcac 120

ccttcagatc cgtgggcgtg agcgcttcga ggagttccga gagaagaatg aggccttgga 180

actcaaggat gcccaggctg ggaaggagcc aggggggtca ggtgagctca tgagcgacat 240

caccgttacc aactgggccg gcaacatcac ctacaccgcg aaggaactgc tgcgtccgca 300

ctccctggac gcgctgcgtg ccctggtggc ggacagcgcc cgtgtgcgtg tgctgggcag 360

cggtcactcc ttcaacgaga tcgccgagcc gggcgacggt ggtgttctgc tgtctctggc 420

gggcctgccg tccgtggtgg acgtggacac cgcggcccgt accgtgcgtg ttggcggcgg 480

tgtgcgttac gcggagctgg cccgtgtggt gcacgcgcgt ggcctggcgc tgccgaacat 540

ggcctctctg ccgcacatct ctgttgccgg ttctgtggcc accggcaccc acggttctgg 600

tatgggcaac ggttctctgg cctctatggt gcgcgaggtg gagctggtta ccgcggacgg 660

ttctaccgtg gtgatcgcgc gtggcgacga gcgtttcggc ggtgcggtga cctctctggg 720

cgcgctgggc gtggtgacct ctctgaccct ggacctggag ccggcgtacg agatggaaca 780

gcacgttttc accgagctgc cgctggccgg tctggacccg gcgaccttcg agaccgtgat 840

ggcggcggcg tacagcgtgt ctctgttcac cgactggcgt gcgccgggtt tccgtcaggt 900

gtggctgaag cgtcgcaccg accgtccgct ggacggtttc ccgtacgcgg ccccggccac 960

cgagaagatg catccggtgc cgggcatgcc ggcggtgaac tgcaccgagc agttcggtgt 1020

gccgggtccg tggcacgagc gtctgccgca cttccgcgcg gagttcaccc cgagcagcgg 1080

tgccgagctg cagtctgagt acctgatgcc gcgtgagcac gccctggccg ccctgcacgc 1140

gatggacgcg atccgtgaga ccctggcgcc ggtgctgcag acctgcgaga tccgcaccgt 1200

tgccgccgac gcgcagtggc tgagcccggc gtacggtcgt gacaccgtgg ccgcgcactt 1260

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ggttccgttc gcggcccgtc cgcactgggg taaggtgttc accgttccgg cgggcgagct 1380

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gggtaagttc accaacgcgt tcgtgcgcgg tgtgctggcg ggctcaggct caggttctgt 1500

cgacatccca acgaccgaaa acctgtattt tcagggcgcc atggttgata ccttatcagg 1560

tttatcaagt gagcaaggtc agtccggtga tatgacaatt gaagaagata gtgctaccca 1620

tattaaattc tcaaaacgtg atgaggacgg caaagagtta gctggtgcaa ctatggagtt 1680

gcgtgattca tctggtaaaa ctattagtac atggatttca gatggacaag tgaaagattt 1740

ctacctgtat ccaggaaaat atacatttgt cgaaaccgca gcaccagacg gttatgaggt 1800

agcaactgct attaccttta cagttaatga gcaaggtcag gttactgtaa atggcaaagc 1860

aactaaaggt gacgctcata tt 1882

<210> 2

<211> 1257

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgagcgaca tcaccgttac caactgggcc ggcaacatca cctacaccgc gaaggaactg 60

ctgcgtccgc actccctgga cgcgctgcgt gccctggtgg cggacagcgc ccgtgtgcgt 120

gtgctgggca gcggtcactc cttcaacgag atcgccgagc cgggcgacgg tggtgttctg 180

ctgtctctgg cgggcctgcc gtccgtggtg gacgtggaca ccgcggcccg taccgtgcgt 240

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ctggacccgg cgggtaagtt caccaacgcg ttcgtgcgcg gtgtgctggc gggctaa 1257

<210> 3

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaggagaat atttcaccct tcagatccgt gggcgtgagc gcttcgagga gttccgagag 60

aagaatgagg ccttggaact caaggatgcc caggctggga aggagccagg gggg 114

<210> 4

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcccatattg tcatggttga tgcatacaag ccgaccaaag ccatggttga taccttatca 60

ggtttatcaa gtgagcaagg tcagtccggt gatatgacaa ttgaagaaga tagtgctacc 120

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