一种模块化生物样本低温保存及快速复温装置
技术领域
本发明涉及低温保存
技术领域
，具体是一种模块化生物样本低温保存及快速复温装置。背景技术
低温保存是指将细胞或者组织放置在低温条件下进行长期保存，现代医学中，低温保存被广泛应用，特别是生殖医学、器官储运，细胞治疗、样本库建设等方面。玻璃化冷冻方法被认为是生物组织、细胞等生物材料最好的深低温保存方式，它在生物样本库的建设方面具有非常重要的应用价值。玻璃化方法是指通过极快的降温速率将生物样本冷却到远低于其结晶点的温度，使溶液内冰晶的形成和生长受到极大的限制，最终实现向非晶体固态的转变过程。而实现玻璃化保存的途径不外乎有两大类：一是提高低温保护剂的浓度，仅需要较低降温速率，就可以实现玻璃化保存；二是降低保护剂浓度，减小样品体积，增大比表面积，实现超快速冷冻而实现玻璃化。对于前者来讲，因为保护剂浓度高、毒性强，需要繁琐的洗脱程序，很难达到后续临床的应用标准。因此，通过增大比表面积超快速冷冻的玻璃化方法是目前的研究重点。
此外玻璃化保存方法在复温过程中，37℃水浴复温使最常用的复温方式，但其升温速率较慢，升温速率不够快会导致反玻璃化现象，对生物样本产生致命的冰晶损伤。射频会在导体中产生感应涡流，并伴有产生热量的电阻损耗。射频复温芯片110中的金属层在射频场中可产生感应涡流，在射频场中可以提供超过1000℃/min升温速率。但单独的射频复温对于低保护剂浓度的玻璃化复温是不够的，需要耦合射流复温来进一步提高复温速率，射流复温是指将温水形成射流高速冲击在被复温对象表面进行复温，由于射流边界层极薄，射流复温具有很高的换热效率，可进一步提高复温速率，并可抑制射频复温可能产生的过热现象，是实现样品高速降温或复温的关键技术。
目前研究的另一个重点是结合天然非渗透性保护剂的胞内递送等技术实现生物样本无DMSO的保存，但是这种保存方式在复温时同样面临重结晶带来的细胞损伤，结合射频复温和射流复温的使用，可以进一步提高生物样本复温后的质量，且无需像磁纳米粒子复温以及金纳米粒子激光复温那样在生物样本体系中引入其他物质，避免对生物样本的潜在毒性以及后续繁琐的洗脱步骤。
发明内容
本发明的目的在于提供一种模块化生物样本低温保存及快速复温装置，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种模块化生物样本低温保存及快速复温装置，包括生物样本封装系统、慢速程序降温系统、液氮降温系统、射频复温系统和射流复温系统；还包括控制系统；
所述生物样本封装系统包括射频复温芯片和热封装置；所述射频复温芯片为金属复合膜构成的矩形袋装结构，其中射频复温芯片的最内层为生物相容性材料，可将生物样本与金属层隔离开来，避免金属材料对于生物样本潜在的毒性；射频复温芯片的中间层为金属材料，在交变磁场中产生热效应，可提高生物样本的复温速率，降低重结晶及反玻璃化现象对于生物样本的损伤，此外还可以提供良好的避光和隔绝氧气的作用，更好的保护生物样本；射频复温芯片的最外层为聚对苯二甲酸乙二醇酯，可提供良好的机械性能，使芯片具有良好的机械强度，防止样本泄露，且聚对苯二甲酸乙二醇酯具有良好的印刷性能，可以很好的展示样本信息；
所述慢速程序降温系统包括程序降温盒、异丙醇、深低温冰箱以及液氮罐；所述程序降温盒包括外壳、盒托和盒盖，外壳和盒盖相互扣合，盒托位于外壳内，其中盒托内设有若干间隔设置芯片放置腔，同时芯片放置腔对应的外壁之间设有间隔；
其中，异丙醇为降温盒内的溶液，处于外壳于盒托之间，起到减慢降温速率的作用，盒托将异丙醇溶液与样本隔离开来，避免异丙醇直接接触样品。
所述液氮降温系统包括液氮、杜瓦瓶和储藏架；
所述射频复温系统包括射频发生器和冷却水循环装置，冷却水循环装置用于冷却射频发生器；
所述射流复温系统包括射流生成器、高压泵、循环泵、水槽和恒温槽；所述射流生成器包括壳体，壳体内竖直设有一上下贯穿的芯片放置槽，芯片放置槽的底部两侧一体成型限位块；所述芯片放置槽的两侧设有布水槽，布水槽与芯片放置槽之间设有隔板，隔板上开设有若干倾斜向下设置的通孔，布水槽与芯片放置槽通过该通孔连通设置，其中布水槽的顶部连通有连接管，连接管与进水管连通设置；所述水槽和恒温槽通过进水管和回水管构成循环，进水管和回水管上均安装有手动阀，其中进水管上安装有高压泵用于水流的进水，回水管上安装有循环泵用于水流的回水；
射频发生器的线圈位于水槽内，射流生成器位于射频发生器的线圈内；
进一步的，所述控制系统包括温度传感装置、压力传感器、水位检测器以及控制器。
进一步的，所述隔板上的通孔可水平设置。
进一步的，所述射频复温芯片的容积为0ml-50ml。
进一步的，所述射频复温芯片用于保存生物样本，如病毒、细菌、细胞、细胞团、组织。
进一步的，所述射频复温模块耦合射流复温模块，进一步提高了复温速率，并且可以防止射频复温芯片在射频场中的过热现象。
进一步的，模块化生物样本低温保存及快速复温装置的使用方法，具体如下所示：
首先将生物样本转移至射频复温芯片中，然后利用热封机进行封装；
在进行慢速低温保存时，将射频复温芯片转移至程序降温盒中，再转移至深低温冰箱进行慢速降温，过夜后将射频复温芯片从程序降温盒中取出，转移至液氮中进行低温保存；
在进行生物样本玻璃化保存时，直接将封装有生物样本的射频复温芯片转移至液氮中进行降温，然后保存在液氮罐中；
在进行复温操作时，首先将射流生成器更换为需要的型号，然后在智能恒温循环器中设置射流复温的温度，设置高压泵和循环泵的工作参数，设置完成后待智能恒温循环器的恒温槽在设定温度稳定后，开启手动阀，开启高压泵和循环泵，在射流生成器中形成射流；
然后开启射频发生器的冷却水循环装置，待冷却水温度降低到20℃以下时，在射频发生器中设定射频场的频率、强度和时长，开启射频发生器，待射频达到设定强度并稳定后，将射频复温芯片利用液氮转移至复温设备旁，然后快速转移至射频复温芯片放置位置中，进行快速复温，复温结束后，关闭射频发生器，关闭冷却水循环装置，关闭射流复温系统；在进行复温时，配合使用射频复温及射流复温，可提高复温速率，达到抑制重结晶及反玻璃化对生物样本的损伤，提高生物样本复温后的质量。
进一步的，所述射流复温是指将温水形成射流高速冲击在被复温对象表面进行复温，由于射流边界层极薄，射流复温具有很高的换热效率，可进一步提高复温速率，并可抑制射频复温可能产生的过热现象，可进一步提高生物样本复温后的质量。
进一步的，所述模块化生物样本低温保存及快速复温装置的流程是使生物样本实现大体积玻璃化，配合射频及射流进行复温，抑制复温过程中的反玻璃化现象，减小对生物样本的损伤。
进一步的，所述模块化生物样本低温保存及快速复温装置的流程是通过慢速冻结保存生物样本，配合射频及射流进行复温，减轻复温过程中的重结晶现象，减小对生物样本的损伤。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)采用复合膜结构的射频复温芯片，可以同时提供良好的生物相容性、优秀的机械强度、印刷性能，并可以配合射频场进行快速复温；采用高比表面积及超薄壁面的设计，在实现快速降复温的同时可以容纳毫升级的样品悬液，可实现生物样本的快速玻璃化保存；
(2)射流复温系统采用可更换的射流发生器，不同的射流发生器腔体采用不同的孔径、角度以及分布方式，可以形成多种射流，此外还可调节泵的流量和流速，从而提供丰富的射流参数调节选择，适应不同生物样本的复温要求；
(3)采用改进的程序降温盒，可以适配方形的射频复温芯片；
(4)采用射频场加热金属复合膜的方式来进行生物样本的快速复温，无需引入磁纳米粒子等其他加热介质到生物样本体系中，可避免后续复杂的洗脱过程和残留风险；
(5)采用射频复温耦合射流复温，能够实现低温保存的生物样本快速均匀复温，有效抑制生物样本体系中的重结晶和反玻璃化现象；
(6)本发明能够抑制慢速低温保存的复温过程中的重结晶现象，提高生物样本的慢速低温保存质量；
(7)本发明设计了高比表面积及超薄壁面的射频复温芯片，可以实现生物样本的大体积玻璃化保存，突破传统玻璃化容器的体积限制，为实现生物样本高质量保存提供新型方法；
(8)本发明设计了联合射频复温、射流复温与低温保存流程。
附图说明
图1为一种模块化生物样本低温保存及快速复温装置的部分示意图。
图2为一种模块化生物样本低温保存及快速复温装置的结构框图。
图3为一种模块化生物样本低温保存及快速复温装置使用的流程图。
图4为一种模块化生物样本低温保存及快速复温装置中射频复温芯片的结构示意图。
图5为一种模块化生物样本低温保存及快速复温装置中射流生成器的结构示意图。
图6为一种模块化生物样本低温保存及快速复温装置中射流生成器的剖视图。
图7为一种模块化生物样本低温保存及快速复温装置中射流生成器的另一角度的剖视图。
图8为一种模块化生物样本低温保存及快速复温装置中射频发生器的结构试图。
图9为一种模块化生物样本低温保存及快速复温装置中盒托的结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
请参阅图1-9，一种模块化生物样本低温保存及快速复温装置，包括生物样本封装系统100、慢速程序降温系统200、液氮降温系统300、射频复温系统400和射流复温系统500；还包括控制系统600；
所述生物样本封装系统100包括射频复温芯片110和热封装置；
所述生物样本封装系统包括射频复温芯片110和热封装置；所述射频复温芯片为金属复合膜构成的矩形袋装结构，其中射频复温芯片的最内层111为生物相容性材料，可将生物样本与金属层隔离开来，避免金属材料对于生物样本潜在的毒性；射频复温芯片的中间层113为金属材料，在交变磁场中产生热效应，可提高生物样本的复温速率，降低重结晶及反玻璃化现象对于生物样本的损伤，此外还可以提供良好的避光和隔绝氧气的作用，更好的保护生物样本；射频复温芯片的最外层113为聚对苯二甲酸乙二醇酯，可提供良好的机械性能，使芯片具有良好的机械强度，防止样本泄露，且聚对苯二甲酸乙二醇酯具有良好的印刷性能，可以很好的展示样本信息；
在本实施例中，射频复温芯片的中间层113的金属材料为铝箔；
此外射频复温芯片采用高比表面积及超薄壁面的设计，在实现快速降复温的同时可以容纳毫升级的样品悬液。射频复温芯片中的金属层在射频场中可产生感应涡流，在射频场中可以提供超过1000℃/min升温速率；
具体的，所述热封装置为现有的热风机；
慢速程序降温系统200包括程序降温盒210、异丙醇、深低温冰箱以及液氮罐；
所述程序降温盒210包括外壳211、盒托212和盒盖213，外壳211和盒盖213相互扣合，盒托212位于外壳211内，其中盒托212内设有若干间隔设置芯片放置腔214，同时芯片放置腔214对应的外壁之间设有间隔；
液氮降温系统300包括液氮、杜瓦瓶和储藏架；
射频复温系统400包括射频发生器401和冷却水循环装置402，冷却水循环装置402用于冷却射频发生器401；
具体的，所述射频发生器401为NanoScale Biomagnetics的D5交变射频发生器；
具体的，所述冷却水循环装置402为恒兴和的YT1冷却循环水机；
所述射流复温系统500包括射流生成器510、高压泵520、循环泵530、水槽540和恒温槽550；
所述射流生成器510包括壳体，壳体内竖直设有一上下贯穿的芯片放置槽511，芯片放置槽511的底部两侧一体成型限位块519，该限位块519的作用是用于承接射频复温芯片110使射频复温芯片110不会从芯片放置槽511的底部脱出，又不阻止水流从芯片放置槽511的底部排出；
芯片放置槽511的两侧设有布水槽512，布水槽512与芯片放置槽511之间设有隔板513，隔板513上开设有若干倾斜向下设置的通孔，布水槽512与芯片放置槽511通过该通孔连通设置，其中布水槽512的顶部连通有连接管514，连接管514与进水管521连通设置；
所述恒温槽550为上海知信实验仪器技术优先公司的ZX-20B智能恒温循环器；
所述水槽540和恒温槽550通过进水管521和回水管531构成循环，进水管521和回水管531上均安装有手动阀，其中进水管521上安装有高压泵520用于水流的进水，回水管531上安装有循环泵530用于水流的回水，恒温水从恒温槽550中通过进水管521进入射流生成器中；
进水管521和回水管531的进口均安装有过滤器，过滤器为DF钻芯的过滤器，同时采用PPF聚丙烯纤维滤芯；
其中射频发生器401的线圈位于水槽540内，射流生成器510位于射频发生器401的线圈内；
所述控制系统600包括温度传感装置、压力传感器、水位检测器以及控制器；
模块化生物样本低温保存及快速复温装置的使用方法，具体如下所示：
首先将生物样本转移至射频复温芯片110中，然后利用热封机进行封装；
在进行慢速低温保存时，将射频复温芯片110转移至程序降温盒210中，再转移至深低温冰箱进行慢速降温，过夜后将射频复温芯片110从程序降温盒210中取出，转移至液氮中进行低温保存；
在进行生物样本玻璃化保存时，直接将封装有生物样本的射频复温芯片110转移至液氮中进行降温，然后保存在液氮罐中；
在进行复温操作时，首先将射流生成器510更换为需要的型号，然后在智能恒温循环器500中设置射流复温的温度，设置高压泵和循环泵的工作参数，设置完成后待智能恒温循环器500的恒温槽在设定温度稳定后，开启手动阀，开启高压泵501和循环泵502，在射流生成器510中形成射流；
然后开启射频发生器401的冷却水循环装置402，待冷却水温度降低到20℃以下时，在射频发生器401中设定射频场的频率、强度和时长，开启射频发生器401，待射频达到设定强度并稳定后，将射频复温芯片110利用液氮转移至复温设备旁，然后快速转移至射频复温芯片110放置位置22中，进行快速复温，复温结束后，关闭射频发生器401，关闭冷却水循环装置402，关闭射流复温系统500；在进行复温时，配合使用射频复温及射流复温，可提高复温速率，达到抑制重结晶及反玻璃化对生物样本的损伤，提高生物样本复温后的质量。
射流复温是指将温水形成射流高速冲击在被复温对象表面进行复温，由于射流边界层极薄，射流复温具有很高的换热效率，可进一步提高复温速率，并可抑制射频复温可能产生的过热现象，可进一步提高生物样本复温后的质量。
模块化生物样本低温保存及快速复温装置的流程是通过慢速冻结保存生物样本，配合射频及射流进行复温，减轻复温过程中的重结晶现象，减小对生物样本的损伤。
该发明一方面可实现低浓度保护剂的生物样品慢速低温保存，抑制复温过程中冰晶再生长，提高低温保存后的样品质量。
另一方面可以实现生物样本的保存，突破传统玻璃化容器的体积限制，为实现生物样本高质量保存提供新型方法。
实施例1、A549细胞团的冷冻实验，本实施例中的生物相容性材料为聚乙烯(polyethylene，简称PE)；
在4℃下，将A549细胞团在2.5％DMSO，2.5％EG，0.05M海藻糖的DMEM溶液中平衡10min，然后在5％DMSO，5％EG，0.1M海藻糖的DMEM溶液中平衡5min。然后将细胞团悬液分为两份各1mL分别加入射频复温芯片(15mm宽，70mm长，1.5mm厚)和1.5mL冻存管中，分别转移至配套的程序降温盒以及商用的程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜，然后转移至液氮中保存24h；冻存后的样品射频复温芯片采用射频-射流快速复温，冻存管采用水浴复温。复温后利用显微明场照片结合图像处理手段定量化分析细胞团结构完整性，并使用CCK-8试剂盒分析冻存后细胞团的活力。结果见表1。
表1低温保存A549细胞团复温后的结构完整性和相对活力比较
组别
结构完整性
相对活力
新鲜组
85％
100％
冻存管组
73％
30％
射频复温芯片组
82％
78％
复温期间用光纤测温记录复温过程中从-196℃到20℃所需的时间，结果见表2。
表2射频复温芯片射频-射流复温所需时间与冻存管水浴复温时间对比
组别
复温所需时间
冻存管水浴复温
140s
射频复温芯片射频-射流复温
8s
结果显示射频复温芯片组的细胞团在结构完整性和相对活力两个方面都显著优于冻存管组。
实施例2、A549细胞团的冷冻实验，本实施例中的生物相容性材料为聚乙烯(polyethylene，简称PE)；
在4℃下，将A549细胞在10％DMSO的DMEM溶液中平衡10min。然后将细胞悬液分为两份各1mL分别加入射频复温芯片(15mm宽，70mm长，1.5mm厚)和1.5mL冻存管中，分别转移至配套的程序降温盒以及商用的程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜，然后转移至液氮中保存24h。冻存后的样品射频复温芯片采用射频-射流快速复温，冻存管采用水浴复温。复温后利用AO/PI荧光染色分析冻存后细胞团的存活率。结果见表3。
表3低温保存A549细胞复温后的存活率比较
组别
存活率
新鲜组
98％
冻存管组
94％
射频复温芯片组
97％
结果显示射频复温芯片组的细胞存活率显著明显优于冻存管组。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下做出各种变化。
