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发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的不足，提供一种能够快速提取生物RNA、蛋白质及DNA、RNA和蛋白质三者中任意共提的样品处理方法、提取试剂盒及提取装置。

为了实现上述目的，一种优选方案，选用一种制冷的液化气体，在气化的过程中吸收大量的热，使周围环境短时间内急速降温，提供短时间内的低温冷冻环境。从安全性、成本价格和易获得性综合考虑，优先选择液氮作为制冷气体。本发明提供一种新的液氮研磨方法——液氮冷冻干燥研磨法。该方法利用传统液氮研磨法的优点：制冷作用，可以防止发生化学反应，更具体的说是防止待提取物的降解反应，而保持待提取物的完整性；同时，也避免了传统研磨方法的缺点：生物样品随着液氮流动而流动。当然在液氮保护下也可以把生物样品捣碎或研磨。在冷冻干燥后，生物样品可以被直接研磨，这样使研磨过程变得简单，而且易于操作可以缩短研磨时间，同时，研磨的生物样品颗粒达到非常细小的状态。

从理论上来说，首先，在0℃以下，研碎的生物样品处于固体状态，固体之间发生化学反应包括降解反应的速率是非常小的。其次，根据范特霍夫规则：反应温度每升高10K，其反应速率变为原来的2～4倍；反之，温度每下降10K，其反应速率变为原来的1/4～1/2倍。在实际操作中，整个研磨过程大约3～5分钟就可以完成，降解反应的时间很短。综合上面3 个因素，生物样品中待提取物发生的降解反应可以忽略。

在冷冻干燥条件下，生物样品被研磨成非常细小的粉末。这可以极大增加待提取物与提取液的接触面积，使得待提取物容易进入提取液，因此可以缩短提取时间和增加待提取物的量。更准确的说待提取物为RNA、DNA和/或蛋白质。

为了证实上述实施方法的可行性，测定了，在室温约22℃时，研钵被液氮彻底冷却后，温度随时间变化关系。由图1可见，在前5分钟的范围之内，研钵壁附近的温度非常的低，从而使待提取物的降解反应的速率可以忽略不计。即使在研磨生物样品的时候，会产生少量的热量，也可根据实际情况，再添加液氮而使温度继续降低。因此，本发明实施方法是可行的。

作为一种优选方法，加入液氮的次数在一次或一次以上，一尤其优选次数在1～5次之间，更优选次数在2～3次最佳。

具体实施本发明的方案，选择一套研磨装置，优选地选择常见但不限于的研钵装置。

液氮和生物样品可以同时加入研钵，可以先加液氮后加生物样品，也可以先加生物样品后加液氮，使得研钵和生物样品冷却，在液氮干燥后开始研磨，把生物样品研磨成粉末状态。还可以通过一次以上添加液氮的方法，继续研磨生物样品，使粉末的颗粒变得更加细小。

对于含水量较高的生物样品，如植物组织，可以直接液氮冷冻干燥研磨成颗粒细小的粉末。也可以通过加入少许含有提取物抑制剂的溶液和植物组织一起研磨。通常，对于含水量高的生物样品来说，可以直接采用液氮冷冻干燥法研磨。

对于含水量不高的生物样品，如动物组织和细胞等，可以直接冷冻干燥研磨，也可以通过加入适量体积液体，尤其是含有防止待提取物降解的抑制剂溶液和含水量低的生物样品一起研磨。加入含有提取物抑制剂的溶液的作用，如下：1、防止待提取物降解；2、形成冰晶有利于含水量低的生物样品破碎；3、有利于被研碎后的生物样品分散到加入溶液形成的粉末内。更具体的来说涉及到DNA提取时，需要加入螯合剂或螯合剂的混合物，螯合剂为本领域技术人员所熟知的，包括但不限于N-乙酰-L-半胱氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺-N，N’-二琥珀酸(EDDS)、1，2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N ’-四乙酸(BAPTA)和膦酸盐螯合剂(例如包括但不限于次氮基三(亚甲基)膦酸(NTMP)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMP)、二亚乙基三胺五(亚甲基)膦酸(DTPMP)、1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸(HEDP)等)。在一些实施方案中，螯合剂包含EDTA或DTAP。在一些实施方案中，常用EDTA 水溶液。

更具体来说涉及到RNA提取时，加入一些还原剂和或RNase A的抑制剂或RNA抑制剂的混合物，如：包括但不限于美国专利第6825340号说明书或美国专利第677720号说明书中公开的一些还原剂。在一些实施方案中，常用的RNase A抑制剂为焦碳酸二乙酯(DEPC)。

更具体来说涉及到蛋白质提取时，加入一些蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂的混合物，如：包括但不限于苯甲基磺酰氟(PMSF)、乙二胺四乙酸(EDTA)、胃蛋白酶抑制剂(pepstantin)、亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、胰蛋白酶抑制剂(aprotinin)、奈非那韦、沙奎邦韦、茚地那韦、安泼那韦、利托那韦、洛匹那韦及复合制剂、氟化钠、原矾酸钠、甘油酸钠、焦磷酸钠等。在一些实施方案中，常用PMSF水溶液。

作为一种优选方案，加入待提取物的抑制剂浓度≥0；一尤其优选抑制剂浓度，一般为正常推荐工作浓度的0.1倍～200倍之间；更优选抑制剂浓度为1倍～2倍之间。具体来说，DNase I抑制剂为20mM EDTA；RNase A抑制剂浓度为0.2％DEPC水溶液；蛋白酶抑制剂浓度为50ug/ml PMSF。

作为一种优选方案，加入包含待提取物抑制剂溶液的体积≥0ul；一尤其优选抑制剂溶液体积在10ul～1000ul；一更优选抑制剂溶液体积20ul～200ul；更具体来说，抑制剂溶液体积为80ul/微柱。

通过上述操作，生物样品在约5分钟可以完成研磨。

所述记载前述生物样品处理方法的载体，典型地为纸质说明书，也可以是记载所述方法的电子版说明书的任意载体(包括但不限于可移动磁盘、光盘、电子墨水屏幕、网络资源及其地址等)，只要能通过读取该载体而获知该方法，则均在本概念范围内。

本发明在另一方面提供一种计算机可读载体，其记载包含用于实施前述生物组织DNA的样品处理方法的计算机程序。所述计算机作广义理解，包括但不限于单片机、PLC、单板机、工控机、PC机等形式。所述计算机可读载体包括但不限于Flash、EEPROM、磁盘(软盘或硬盘)、光盘等任何形式。所述计算机程序可以是任意语言编写的，例如汇编、JAVA、VB、VC、C++、Python，只要能够控制相关系统实施所述方法即可。

发明人在对生物组织DNA提取的样品处理方法的研究中惊讶地发现，生物样品经过液氮冷冻干燥法研磨处理后，组织样品的颗粒达到非常小的程度，使颗粒接触提取液的表面积增加很多，让待提取物：RNA、DNA和蛋白质快速进入提取液，极大缩短提取时间，同时还增加待提取物的量。还可以把传统RNA或蛋白质或DNA、RNA和蛋白质三者中任意共提的试剂盒改变成室温快速提取试剂盒。

本发明提出一种生物样品RNA或蛋白质或DNA、RNA和蛋白质三者中任意共提的快速提取样品的处理方法、提取试剂盒和提取装置，至少能产生如下有益效果：1、操作简单；2、极大缩短提取时间，提高工作效率；3、提高待提取物的质和量；4、改良传统试剂盒。