一种高价值活性寡肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种高价值活性寡肽的制备方法，属于涉及食品、药品淀粉糖生产领域。
背景技术
高F值寡肽是指分子量在200～1000Da之间且所含的BCAA/AAA(支链氨基酸/芳香族氨基酸)摩尔比值大于20的混合寡肽(2～9个氨基酸组成的肽链)。BCAA是指缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)三种氨基酸；AAA是指色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)三种氨基酸。高F值寡肽作为一种含高比例支链氨基酸低芳香族氨基酸的寡肽在功能型食品和医药行业都具备广泛应用价值。现代营养学研究表明，寡肽比氨基酸更容易被生物体吸收利用，而且有些寡肽还可以作为活性物质被直接吸收，进而参与生理代谢调节。根据研究发现部分二肽和三肽可以由寡肽转运蛋白直接转运至细胞内，还有小部分寡肽可以通过细胞旁途径和载体转运系统完整吸收进入体循环。高F值寡肽功能型食品上可以抗疲劳、解醉酒、抗氧化和改善病人蛋白营养状况等
玉米黄粉(CGM)是湿法生产玉米淀粉的主要副产物，根据国家统计局数据玉米为我国单产最大的农作物，2020年产量为26,067万吨，并且玉米的产量仍在逐年增加。根据中国淀粉工业协会统计报道，2019年玉米淀粉产量为3,097.4万吨，同比增长10％，而且玉米淀粉工业成逐年上升趋势。CGM的年产量也随之增加，但其本身缺乏两种人体必须氨基酸(赖氨酸、色氨酸)，所以在食品工业应用价值较低。目前对其后续利用主要在于饲料加工，附加值较低。随着国家经济由高速发展到高质量发展，对CGM的深入利用就更加迫切。根据其自身高蛋白的特点，目前对CGM深加工利用主要方向为提取玉米蛋白和生产制备玉米肽，若能够提升玉米肽的营养价值，将对于玉米的利用及可持续发展有重要的意义。
发明内容
针对目前存在的问题，本发明提供了一种制备高F值寡肽的方法，先以纳豆芽孢杆菌发酵产物水解玉米黄粉原料，将酶解之后得到的产物利用米曲霉发酵，实现了玉米黄粉的利用，并成功制备得到高F值寡肽。
本发明提供了一种利用微生物发酵制备高F值寡肽的方法，所述方法是以纳豆芽孢杆菌的发酵产物和风味蛋白酶酶解含玉米黄粉的原料，将酶解后得到的产物利用米曲霉发酵生产高F值寡肽。
在一种实施方式中，所述米曲霉为米曲霉CICC40214，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
在一种实施方式中，所述纳豆芽孢杆菌为经纳豆芽孢杆菌CICC10023诱变得到，公开于张振洋等《高产碱性蛋白酶纳豆芽胞杆菌的诱变筛选》(公开于2021年4月)，申请人承诺自申请日起20年内向合法途径下实施本发明的公众发放该菌株。
在一种实施方式中，所述纳豆芽孢杆菌的发酵产物包含碱性蛋白酶和中性蛋白酶，所述碱性蛋白酶不低于50U/mL，所述中性蛋白酶不低于100U/mL。
在一种实施方式中，所述发酵产物中碱性蛋白酶为50～60U/mL，中性蛋白酶为100～130U/mL。
在一种实施方式中，将OD600在7～8的纳豆芽孢杆菌以7mL/100mL的量接种至发酵培养基中进行发酵。
在一种实施方式中，所述纳豆芽孢杆菌的发酵产物是纳豆芽孢杆菌在温度35～39℃，pH8.5～9.5的条件下获得的纳豆蛋白酶。
在一种实施方式中，所述纳豆芽孢杆菌的发酵产物是纳豆芽孢杆菌在温度37℃，pH 9.5的条件下获得的纳豆蛋白酶。
在一种实施方式中，所述发酵培养基成分为：葡萄糖8～10g/L，鱼粉蛋白胨15～20g/L，氯化钙1～2g/L，硫酸镁1～2g/L。
在一种实施方式中，先将玉米黄粉利用α-淀粉酶酶解得到玉米蛋白，再利用纳豆芽孢杆菌的发酵产物酶解玉米蛋白，将酶解得到的产物作为米曲霉的发酵培养基。
在一种实施方式中，所述含玉米黄粉的原料经过下述预处理：以1:5～1:12的固液比将玉米黄粉加入pH 5.0～6.0的PBS缓冲液中，加入150～200U/g添加中温ɑ-淀粉酶55～60℃保温酶解4～6h，酶解后在100℃灭酶10min，再加入终浓度为0.5～0.7mg/mL的亚硫酸钠还原剂，置于115℃～125℃温度下加热处理1.5～2.5h，洗涤、烘干并粉碎，得到预处理后的玉米蛋白。
在一种实施方式中，纳豆芽孢杆菌的发酵产物中含有碱性蛋白酶，按每克玉米蛋白添加3500～4500U的量添加纳豆蛋白酶；在45～55℃，pH 9.0～9.5条件下酶解4h，酶解后加入1.0％～2.0％的蔗糖和0.1％～0.2％硝酸钠，并灭活，作为米曲霉的发酵培养基。
在一种实施方式中，在55℃，pH 9.0条件下酶解4h，酶解后加入1.5％(1.5g/100mL)的蔗糖和0.15％(0.15g/100mL)硝酸钠。
在一种实施方式中，每克玉米蛋白添加4000U的量添加纳豆蛋白酶。
在一种实施方式中，将米曲霉按5～7％的量接种至所述发酵培养基，在pH6.0～7.0、25～34℃下发酵60～76h得到发酵液。
在一种实施方式中，将每毫升含有1.0×108个孢子的米曲霉孢子液按6mL/100mL的量接种至制备得到的米曲霉的发酵培养基中，在pH6.0～7.0、25～34℃下发酵60～76h得到发酵液。
在一种实施方式中，使用活性炭对发酵液进行吸附脱芳。
在一种实施方式中，以1:(10～15)的炭液比(每10～15毫升发酵液中添加1g活性炭)加入改性活性炭，在20～25℃，pH 2.0～3.0条件下吸附2h，最后过滤得到吸附液中即含有高F值寡肽。
在一种实施方式中，以1:10的炭液比加入改性活性炭。
本发明提供了应用所述方法制备获得的高F值寡肽。
本发明提供了所述的高F值在制备食品、药品、保健品方面的应用。
有益效果：本发明以玉米黄粉为原料制备玉米蛋白，利用纳豆芽孢杆菌的发酵产物酶解玉米蛋白制备得到可用于米曲霉发酵的培养基，将米曲霉在培养基中发酵，发酵后得到的发酵液经活性炭吸附脱芳后得到寡肽，其中小于1000Da的寡肽大于85％，F值大于22，寡肽含量为9.43g·L-1，寡肽占比86％。充分利用了玉米黄粉，并且制备得到了高F值寡肽，具备广阔的应用前景。
附图说明
图1为不同温度下的纳豆蛋白酶水解效果。
具体实施方式
玉米黄粉的组分主要为：60％的蛋白、17％的淀粉、2-5％的粗脂肪、1％的纤维素。
米曲霉CICC40214购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
实施例中所使用的纳豆芽孢杆菌是由纳豆芽孢杆菌CICC10023经诱变得到，公开于张振洋等《高产碱性蛋白酶纳豆芽胞杆菌的诱变筛选》(公开于2021年4月)。
蛋白酶活测定：参照标准GB/T 23527-2009。
肽含量测定：双缩脲法测定。
双缩脲试剂的配制
a)NaOH溶液：用烧杯称取NaOH 6g，量取蒸馏水25mL加入烧杯溶解NaOH，配置成6mol/L浓度备用。
b)双缩脲试剂：称取以0.75g硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶于新鲜制备的500mL的蒸馏水，加入2.25g酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O，用于结合Cu2+，用于防止CuO在碱性条件下沉淀)并加入KI 1.5g(防止碱性酒石酸铜自动还原并防止Cu2O的离析)，等到完全溶解后，在搅拌下加入6g/L NaOH溶液25mL，并用水定容到250mL，放置塑料瓶中盖紧保存。
取十个10mL的容量瓶，用5％的TCA依次配制0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8mg/mL的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准溶液，然后分别取6.0mL标准溶液，加入4.0mL双缩脲试剂，混合均匀，静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于540nm下测定OD值(以第一管做空白对照)。以肽的浓度为横坐标X(mg/mL)，OD值为纵坐标Y，制作标准曲线。
多肽含量的测定步骤：取2.5mL样品溶液，加入2.5mL 10％(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，然后在4000r/min下离心15min，将上清液全部转移到50mL容量瓶中，并用5％的TCA定容至刻度，摇匀。然后取6.0mL上述溶液置另一试管中，加入双缩脲试剂4.0mL(样液:双缩脲试剂＝3:2，V/V)，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于540nm下测定OD值，对照标准曲线求得样品溶液中的多肽浓度C(mg/mL)，进而可求得样品中多肽含量。
酶解液F值测定：使用高效液相色谱OPA在线衍生法进行检测分析。
分子量分布检测：使用高效液相色谱法对样品分子量的分布进行检测分析。
蛋白转化率：
式中：蛋白含量为83.1％。
实施例1
(1)以1:10的固液比在玉米黄粉加入pH 5.2的PBS缓冲液中，以165U/mL的量添加中温ɑ-淀粉酶在57℃保温酶解4h，酶解结束后100℃水浴灭酶10min，再并加入终浓度为0.7mg/mL的亚硫酸钠还原剂，置于120℃温度下加热处理2.0h，最后进行洗涤烘干并粉碎，得到预处理后的玉米蛋白；
(2)以纳豆芽孢杆菌为蛋白酶发酵菌株，将OD600在7-8的纳豆芽孢杆菌以7％(7mL/100mL)的量接种至发酵培养基中，发酵条件为温度37℃，pH 9.5，摇床转速180～220r/min，发酵培养基为葡萄糖10g/L，鱼粉蛋白胨20g/L，氯化钙1g/L，硫酸镁1g/L，发酵44h取出；
(3)将步骤(2)中发酵液以8000r/min离心20min，除去菌体及杂质，得到纳豆蛋白酶；
(4)测定步骤(3)纳豆蛋白酶的酶活，其中碱性蛋白酶50～60U/mL，中性蛋白酶100～130U/mL；
(5)使用步骤(4)中纳豆蛋白酶酶解步骤(1)得到的玉米蛋白，玉米蛋白的添加量为5％(m/v)，酶的添加量为200U/mL，在55℃，pH 9.0条件下酶解4h，酶解之后加入1.5％(1.5g/100mL)的蔗糖和0.15％(0.15g/100mL)的硝酸钠，湿热灭活，作为米曲霉发酵培养基；
(6)米曲霉种子液的制备：先将米曲霉CICC40214活化，将活化后的菌种接种斜面培养基，28℃培养至长满孢子，用无菌生理盐水水将菌丝冲洗至预置玻璃珠的三角瓶中，震荡充分后用纱布过滤，过滤液即为米曲霉的孢子液。将孢子液用生理盐水稀释合适倍数，用血球计数板进行计数，经计数在OD600为0.148时孢子数大约为1×108个/mL。
接种米曲霉进行发酵，将孢子液(每毫升有1.0×108个孢子)按6mL/100mL的量接种至步骤(5)制备得到的米曲霉发酵培养基中，装液量为70/250mL，发酵初始pH6.5，发酵温度28℃，发酵时间68h。发酵结束后过滤去除菌体，获得发酵液。
(7)检测步骤(6)的肽含量和分子量，寡肽含量为19.8g/L，寡肽占比84.6％。
(8)使用活性炭对步骤(6)中发酵液进行吸附脱芳，吸附过程中以1：10的炭液比(每10毫升发酵液中添加1g活性炭)加入改性活性炭，在20～25℃，pH 2.0～3.0条件下吸附2h，最后过滤得到吸附液。
(9)检测步骤(8)吸附液的分子量分布和F值，其中小于1000Da的寡肽大于85％，F值大于22，寡肽含量为9.43g·L-1，寡肽占比86％。
实施例2
具体实施方式同实施例1，调整步骤(5)酶解温度分别为45、50℃，结果如图1所示，在45～50℃范围下，酶解4～6h水解度达13～15％。
实施例3
具体实施方式同实施例1，将步骤(5)的蔗糖添加量为0、0.5％、1.0％、2.0％。发酵结束后检测寡肽含量和寡肽，寡肽含量分别为15.44、15.81、16.19、15.94g/L，寡肽占比分别为63.25、75.86、79.85、75.23％。
实施例4
具体实施方式同实施例1，将步骤(6)中的接种量更改为5％、7％，寡肽含量分别为16.55、16.44g/L，寡肽占比为分别为83.1、80.2％。
实施例5
具体实施方式同实施例1，将步骤(6)中的发酵时间更改为60、64、72、76h，，寡肽含量分别为15.33、16.12、15.88、14.91g/L，寡肽占比为72.61、82.13、82、78.56％。
实施例6
具体实施方式同实施例1，区别在于，步骤(6)中的发酵温度更改为25、31、34℃，结寡肽含量分别为15.33、17.68、16.35g/L，寡肽占比为分别为72.61、83.97、82％。
实施例7发酵罐制备高F值寡肽
在5L发酵罐中进行放大实验，纳豆芽孢杆菌发酵条件为：装液量2.5L、培养基与摇瓶发酵相同，通气量设置为200L·h-1，溶氧设为固定值60％，转速关联溶氧，范围为20-999r·min-1，发酵44h碱性蛋白酶活为132U·mL-1，按碱性蛋白酶活计算CGM添加量在发酵罐中酶解(4000U/g玉米黄粉)，酶解结束后取2L酶解液并添加1.5％(w/v)的蔗糖和0.15％(w/v)硝酸钠，将蛋白酶灭活后接种米曲霉发酵。发酵初始条件和摇瓶发酵相同，溶氧设为固定值60％，转速关联溶氧，范围为20-999r·min-1。在5L发酵罐进行米曲霉发酵，发酵66h，寡肽含量为22.36g·L-1，寡肽占比为84.2％。
对比例1
具体实施方式同实施例1，区别在于，调整步骤(5)酶解温度分别为35、40℃，结果如图1所示，在35～40℃范围下，酶解4～6h水解度达9～13％。
对比例2
具体实施方式同实施例1，区别在于，步骤(5)中取消湿热灭菌的过程。直接进行步骤(6)，检测步骤(6)的肽含量和分子量，寡肽含量为13.5g/L，寡肽占比为64.3％。
对比例3
具体实施方式同实施例1，区别在于，步骤(5)的蔗糖添加量为2.5％。发酵结束后检测寡肽含量和寡肽，寡肽含量为14.34g/L，寡肽占比为73.33％。
对比例4
具体实施方式同实施例1，将步骤(6)中的接种量更改为5％、7％，寡肽含量分别为16.55、16.44g/L，寡肽占比为分别为83.1、80.2％。
对比例5
具体实施方式同实施例1，将步骤(6)中的发酵时间更改为56h，寡肽含量为13.48g/L，寡肽占比为63.25％。
对比例6
具体实施方式同实施例1，区别在于，步骤(6)中的发酵温度更改为22℃，寡肽含量为13.50g/L，寡肽占比为分别为64.21％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
