一种生产十一烷基灵菌红素的培养基及方法
技术领域
本发明属于生物质转化和微生物发酵
技术领域
，具体涉及生产十一烷基灵菌红素的培养基及方法。背景技术
十一烷基灵菌红素（Undecylprodigiosin, UP）是一种具有抗菌、抗肿瘤以及免疫抑制等多种生物学活性的抗生素，在医药行业具有巨大的应用前景，因此受到人们的广泛关注。UP可由天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）、浅天青链霉菌（Streptomyces coelescens）和粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）通过发酵合成。而S. marcescens是一种条件致病菌，安全性相对较低，在机体免疫力低时会引起尿道和肺部感染以及败血症等问题。因此，UP目前主要由链霉菌属微生物发酵生产得到。
基于特定的生产菌株，添加UP前体是一种操作简单、灵活的提高UP生产效率的方法，对于UP的生产非常重要。UP的生物合成前体主要包括脯氨酸（Proline, Pro）、甘氨酸（Glycine, Gly）、丝氨酸（Serine, Ser）、乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A。乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A来源较广，易于从一般的底物中获取。UP及其前体氨基酸和中间体的结构如图1所示，Pro和Gly等前体氨基酸对于UP的合成十分重要，但在常规的发酵底物中含量有限，且直接添加游离氨基酸对UP的工业生产而言成本较高，因此亟需寻找和开发新的UP前体氨基酸资源。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产十一烷基灵菌红素的培养基，旨在利用胶原多肽为微生物的生长和十一烷基灵菌红素的生产提供丰富的营养物质和前体氨基酸，以开拓合成十一烷基灵菌红素的前体资源，提高十一烷基灵菌红素的产量，提升发酵效率。
本发明的另一目的在于提供一种利用胶原多肽发酵生产十一烷基灵菌红素的方法，开发胶原多肽特征性的生物转化功能，拓展胶原多肽在抗生素生产领域的应用，实现胶原多肽的资源化和高值化利用。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
第一方面，本发明采用的技术方案为：一种生产十一烷基灵菌红素的培养基，该培养基包含重均分子量为0.2k Da-20k Da的胶原多肽。优选地，所述胶原多肽的重均分子量为0.3k Da-5k Da。
进一步地，所述胶原多肽在培养基中的添加量为0.1-80 g/L。
进一步地，所述胶原多肽是由酶水解、碱水解、酸水解或高温水解中的至少一种方式，对胶原蛋白进行水解制备得到。
进一步地，所述培养基中无机盐成分包含钾盐、钠盐和镁盐中的至少一种。
进一步地，所述钾盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、氯化钾和硫酸钾中的至少一种；所述钠盐选自磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、氯化钠和硫酸钠中的至少一种；所述镁盐选自磷酸氢镁、氯化镁和硫酸镁中的至少一种。
第二方面，本发明采用的技术方案为：一种利用胶原多肽发酵生产十一烷基灵菌红素的方法，包含将具有生成十一烷基灵菌红素能力的链霉菌接种至第一方面任一所述的培养基中进行十一烷基灵菌红素的生产发酵。
进一步地，所述具有生成十一烷基灵菌红素能力的链霉菌包含天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor和/或浅天青链霉菌Streptomyces coelescens。
进一步地，所述链霉菌的接种量为0.5%-10%。
进一步地，所述发酵的温度为26-34 ℃、pH为6-9、转速为150-250 rpm。
进一步地，所述十一烷基灵菌红素生产发酵后还包含将发酵生产得到的发酵液进行分离的步骤。
与现有技术相比，本发明的有益效果包含：
本发明提供一种生产十一烷基灵菌红素的培养基，其包含重均分子量为0.2k Da-20k Da的胶原多肽。胶原多肽氨基酸组成特殊，包含大量的十一烷基灵菌红素前体氨基酸，可精简发酵培养基的成分，减少该抗生素生产成本。本发明实施例提供一种利用胶原多肽发酵生产十一烷基灵菌红素的方法，将具有生成十一烷基灵菌红素能力的链霉菌接种上述含有胶原多肽的培养基中进行该抗生素的发酵生产。发明人创造性地发现：上述重均分子量的胶原多肽可以促进微生物的生长，提高十一烷基灵菌红素的产量，大幅缩短发酵时间，提高十一烷基灵菌红素的发酵效率。
需要说明的是，本发明实施例中所提供的胶原多肽之所以能够提升十一烷基灵菌红素的产量，主要是由于胶原多肽不仅能为微生物的生长提供丰富的营养，还可以为十一烷基灵菌红素的生产提供必需的前体氨基酸。胶原多肽中含有大量的十一烷基灵菌红素的前体氨基酸（甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸），可诱导和刺激微生物发酵生产十一烷基灵菌红素，从而提高该抗生素的生产效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应该被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为UP及其前体氨基酸和中间体的结构；
图2为链霉菌SLL-523的表型特征和细胞形态；
图3为胶原多肽对链霉菌CGMCC 4.7172发酵生产十一烷基灵菌红素的影响；
图4为胶原多肽和2种植物生物质中十一烷基灵菌红素前体氨基酸的含量；
图5为胶原多肽对链霉菌SLL-523发酵生产十一烷基灵菌红素的影响；
图6为胶原多肽对链霉菌SLL-523胞内前体氨基酸含量的影响；
图7为胶原多肽和4种肉类蛋白多肽对链霉菌CGMCC 4.7172发酵生产十一烷基灵菌红素的影响；
图8为4种肉类蛋白多肽中十一烷基灵菌红素前体氨基酸含量。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
可了解到的是，有关发酵培养的操作条件会进一步随着所使用的具有生成十一烷基灵菌红素能力的微生物而被变动，以便达到最佳培养效果。而这些操作条件的选择是本领域技术人员能例行性地自行决定的。
下面对本发明实施例提供的生产十一烷基灵菌红素的培养基及方法进行具体说明。
本发明实施例提供了生产十一烷基灵菌红素的培养基，其包括胶原多肽，胶原多肽的重均分子量为0.2k Da-20k Da，优选地，胶原多肽的重均分子量为0.3k Da-5k Da。胶原蛋白具有可再生、易获取、以及氨基酸组成特殊的特点，但由于结构紧密、分子量较大且溶解度较低，导致其不易被细胞吸收和利用。相对于胶原蛋白和明胶而言，胶原多肽拥有更低的相对粘度、更小的分子量、更高的自由氨基含量和更大的溶解度等优异性能。
发明人创造地发现氨基酸组成特殊的胶原多肽可以作为链霉菌生长和抗生素生产的唯一碳和氮来源。采用重均分子量范围为0.2k Da-20k Da的胶原多肽发酵生产十一烷基灵菌红素，并且通过不断的试验探索发现，上述重均分子量范围的胶原多肽用于微生物十一烷基灵菌红素发酵中，能明显促进微生物的生长，提高十一烷基灵菌红素的产量。值得注意的是，本申请实施例中所提供的胶原多肽还能缩短发酵时间，提高发酵效率。
本发明实施例中所提供的胶原多肽源于世界上最大的可再生动物生物质资源之一—胶原蛋白。胶原蛋白广泛存在于动物的皮、骨骼、肌腱、韧带和血管等部位中，采用常规方法就可方便提取。胶原多肽是胶原蛋白的水解产物，更容易被微生物所利用。胶原多肽氨基酸组成特殊，含有大量的甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸。事实上，十一烷基灵菌红素是一种具有三吡咯环骨架结构的重要抗生素，每个吡咯环上均含有一个N，分别来自甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸，因此这三种氨基酸是十一烷基灵菌红素生物合成的必需前体。尤其是，脯氨酸作为十一烷基灵菌红素的初始前体，贡献了自身的吡咯环到十一烷基灵菌红素的三吡咯骨架结构中。因此，胶原多肽能为十一烷基灵菌红素的生产提供丰富的前体氨基酸。
胶原多肽是采用酸水解、碱水解、高温水解和酶水解中至少一种水解方法制备得到；优选地，采用酶水解的方式对胶原蛋白进行水解，制备得到胶原多肽。一般常用的水解方式均适合制备胶原多肽。
需要补充的是，酸水解、碱水解、高温水解和酶水解为现有的成熟工艺，可以参照现有技术。
需要补充的是，胶原多肽可以采用市购产品，不限于本发明实施例中所提及的制备方法。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
以下实施例的发酵过程中链霉菌生物量采用细胞干重法测定，十一烷基灵菌红素产量采用高效液相色谱法测定，不同生物质特定氨基酸的含量及链霉菌胞内氨基酸的含量采用氨基酸分析仪进行测定。
以下实施例中胶原多肽是采用市购产品，水解方法不做具体限定，但是要求胶原多肽的重均分子量满足要求。链霉菌（Streptomyces coelicolor CGMCC 4.7172），购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。链霉菌（Streptomyces coelescens SLL-523），四川大学轻工科学与工程学院筛选保藏，此链霉菌SLL-523的16s rDNA序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
实施例1
测试胶原多肽对S. coelicolor生长的影响，具体如下：（1）对照组：液体培养基：4g/L葡萄糖，4 g/L 酵母浸粉，10 g/L 麦芽浸粉，0. 05 g/L K2HPO4，8.0 g/L NaH2PO4，0.02g/L MgCl2。（2）实验组：向对照组培养基中分别添加30 g/L、40 g/L和50 g/L的重均分子量为10k Da的胶原多肽，编号为实验组1-1、实验组1-2和实验组1-3。以S. coelicolor CGMCC4.7172为实验菌株，将CGMCC 4.7172菌株活化增殖后，以8% (v/v)的接种量接入各培养基中，发酵温度30 ℃、转速为200 r/min，初始pH为6.0。发酵时间为3 d，测定各培养基在2 d和3 d的细胞干重，结果如表1所示。
表1 胶原多肽对CGMCC 4.7172菌株生长的影响
。
由表1可知，CGMCC 4.7172菌株在添加了胶原多肽的实验组中的细胞干重明显高于未添加胶原多肽的对照组，且细胞干重随胶原多肽添加量的增加而增加。可见，胶原多肽可以促进该菌株的生长。
实施例2
测试胶原多肽对S. coelescens生长的影响，具体如下：（1）对照组：4 g/L葡萄糖，4 g/L 酵母浸粉，10 g/L 麦芽浸粉，0. 25 g/L KH2PO4，0.15 g/L NaCl，2.0 g/L MgSO4。（2）实验组：向对照组培养基中分别添加1 g/L、10 g/L和20 g/L的重均分子量为15 k Da胶原多肽，编号为实验组2-1、实验组2-2和实验组2-3培养基。以S. coelescens SLL-523为实验菌株，该菌的表型特征和细胞形态如附图2所示。将SLL-523菌株活化增殖后，以2% (v/v)的接种量接入各培养基中，发酵温度34 ℃、转速为180 r/min，初始pH为8.0。发酵时间为5d，测定各培养基的细胞干重，结果如表2所示。
由图2可知，SLL-523菌株在平板培养基上培养一段时间后，表面起粉，开始生成孢子，且随时间的延长，孢子的颜色由白变灰。SLL-523菌株的菌丝经SEM观察，可看到明显的气生菌丝和孢子丝，孢子呈链状排列，孢子的长度为1-2μm，具有链霉菌典型的菌丝形态特点。将该菌株的16S rDNA序列，上传至NCBI和EzbioCluod数据库进行Blast比对分析，发现与该菌同源性最高的菌株为Streptomyces coelescens DSM 40421 (AF503496)，相似度为100.00%。
表2 胶原多肽对SLL-523菌株生长的影响
。
由表2可知，SLL-523菌株在含有胶原多肽的实验组中的细胞干重明显高于未添加胶原多肽的对照组，且细胞干重随胶原多肽添加量的增加而增加。可见，胶原多肽也可以促进该菌株的生长。
实施例3
测试胶原多肽对链霉菌CGMCC 4.7172菌株发酵产十一烷基灵菌红素的影响，具体如下：（1）对照组：基本培养基（Minimal medium, MM）：0. 5 g/L KH2PO4，1.5 g/L Na2HPO4，1.0 g/L NaCl，0.1 g/L MgSO4。（2）实验组：向MM培养基中分别添加40 g/L的黄豆粉、麦芽浸粉和重均分子量为3k Da的胶原多肽，分别编号为4SP、4ME和4CP培养基。以CGMCC 4.7172为实验菌株，将CGMCC 4.7172菌株活化增殖后，离心去上清，用无菌生理盐水洗涤和悬浮菌体，以1% (v/v)的接种量接入各培养基中，发酵温度32 ℃、转速为220 r/min，初始pH为7.5。发酵时间为2 d，测定各培养基中十一烷基灵菌红素的产量，并分析黄豆粉、麦芽浸粉和胶原多肽这3种生物质中脯氨酸、甘氨酸和丝氨酸的含量，结果如图3和图4所示。
由图3可知，CGMCC 4.7172菌株在引入胶原多肽的MM培养基中发酵2 d后，十一烷基灵菌红素的浓度超过500 μg/L，而4SP和4ME培养基中并未检测到十一烷基灵菌红素的存在。
由图4可知，胶原多肽中脯氨酸、甘氨酸和丝氨酸这3种十一烷基灵菌红素前体氨基酸的含量明显高于黄豆粉和麦芽浸粉。可见，富含前体氨基酸的胶原多肽比黄豆粉和麦芽浸粉更适合CGMCC 4.7172菌株发酵生产十一烷基灵菌红素。
实施例4
测试胶原多肽对链霉菌SLL-523菌株发酵产十一烷基灵菌红素的影响，具体如下：（1）对照组：MM培养基。（2）实验组：向MM培养基中分别添加20 g/L的麦芽浸粉和重均分子量为2k Da的胶原多肽，分别编码为2ME和2CP培养基。以SLL-523菌株为实验菌株，将SLL-523菌株活化增殖后，离心去上清，用无菌生理盐水洗涤和悬浮菌体，以5% (v/v)的接种量接入各培养基中，发酵温度28 ℃、转速为250 r/min，初始pH为7.0。发酵时间为1 d，测定各培养基中十一烷基灵菌红素的产量和细胞干重，并分析胞内脯氨酸、甘氨酸和丝氨酸的含量，结果如附图5和附图6所示。胞内氨基酸含量以%细胞干重（DCW）来表示。
由图5可知，SLL-523菌株在MM培养基中培养1 d后，细胞干重为0.31 g/L，而添加麦芽浸粉和胶原多肽后，细胞干重分别提高到了0.71和1.19 g/L。可见，胶原多肽可以促进细胞的生长。并且2CP培养基在1 d的十一烷基灵菌红素的浓度约为600 μg/L，而MM和2ME中均未检测到UP的存在。这表明，胶原多肽可以提高SLL-523菌株的十一烷基灵菌红素的产量。
由图6可知，2CP培养基中SLL-523菌株胞内脯氨酸、甘氨酸以及丝氨酸的含量均大于2ME和MM培养基。可见，胶原多肽可以大幅提高胞内十一烷基灵菌红素前体氨基酸的含量，从而诱导和刺激该菌株生产十一烷基灵菌红素。
实施例5
比较胶原多肽和4种肉类蛋白多肽对链霉菌CGMCC 4.7172菌株发酵产十一烷基灵菌红素的影响，具体如下：向MM培养基中分别添加20 g/L的兔、牛、鸡和鸭肉蛋白多肽和重均分子量为5k Da的胶原多肽，分别编号为2Rabbit、2Beef、2Chicken、2Duck和2CP培养基。以CGMCC 4.7172菌株为实验菌株，将CGMCC 4.7172菌株活化增殖后，离心去上清，用无菌生理盐水洗涤和悬浮菌体，以4% (v/v)的接种量接入各培养基中，发酵温度29 ℃、转速为240r/min，初始pH为8.5。发酵时间为16 d，测定各培养基中十一烷基灵菌红素的产量，分析各肉类蛋白多肽的脯氨酸、甘氨酸和丝氨酸的含量，结果如附图7和附图8所示。
由图7可知，CGMCC 4.7172菌株在2Rabbit、2Beef、2Chicken和2Duck培养基中发酵13 d后检测到十一烷基灵菌红素，而该菌在2CP培养基中培养2 d就可以检测到该抗生素。可见，这四种肉类蛋白多肽与胶原多肽相比，十一烷基灵菌红素生产的起始时间更晚，产量也更低。
由图8可知，与胶原多肽相比，这4种肉类蛋白多肽的丝氨酸含量相差不大，但脯氨酸和甘氨酸含量相对较少。这表明，十一烷基灵菌红素的生物合成主要依赖于底物中氨基酸的可利用性，胶原多肽特殊的氨基酸组成使其比这4种肉类蛋白多肽更有利于促进链霉菌生产十一烷基灵菌红素。
实施例6
胶原多肽的添加对链霉菌CGMCC 4.7172菌株发酵性能的影响，具体如下：（1）对照组培养基：5 g/L葡萄糖，5 g/L 酵母浸粉，10 g/L 麦芽浸粉，2.0 g/L KCl，0. 5 g/LNa2SO4，1.0 g/L MgHPO4。（2）实验组培养基：向实验组培养基中加入0.5 g/L的胶原多肽，得到实验组6-1。将CGMCC 4.7172菌株活化增殖后，离心去上清，用无菌生理盐水洗涤和悬浮菌体，得到种子液，具体发酵条件和实验结果如表3所示。
表3胶原多肽的添加对链霉菌CGMCC 4.7172菌株发酵性能的影响
。
由表3可知，胶原多肽的添加可以提高CGMCC 4.7172菌株的十一烷基灵菌红素的产量。同时，引入胶原多肽后，pH从对照组的8.57增到了9.00，可见，胶原多肽还可提高发酵液的pH。这表明，胶原多肽的确可以改变链霉菌的发酵环境，从而影响抗生素的生物合成。
实施例7
胶原多肽的添加对链霉菌CGMCC 4.7172菌株发酵性能的影响，具体如下：（1）对照组培养基：5.0 g/L K2SO4，4.0 g/L Na3PO4，0.5 g/L MgCl2。（2）实验组培养基：向实验组培养基中加入5.0 g/L的20k Da的胶原多肽，得到实验组7-1。将CGMCC 4.7172菌株活化增殖后，离心去上清，用无菌生理盐水洗涤和悬浮菌体，得到种子液，具体发酵条件和实验结果如表4所示。
表4胶原多肽的添加对链霉菌CGMCC 4.7172菌株发酵性能的影响
。
由表4可知，向不含碳源和氮源的无机盐培养基引入重均分子量为20k Da的胶原多肽，可于5 d检测到70.78 μg/L的十一烷基灵菌红素。
综上，本发明提供的利用胶原多肽发酵生产十一烷基灵菌红素的方法，其包括重均分子量为0.2k Da-20k Da的胶原多肽。发明人创造性地发现：胶原多肽不仅可为微生物的生长提供丰富的营养，还可以为十一烷基灵菌红素的生产提供大量的前体氨基酸，从而诱导和刺激微生物发酵生产十一烷基灵菌红素，提高产量，缩短发酵时间，提升发酵效率。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
<110> 四川大学
<120> 一种生产十一烷基灵菌红素的培养基及方法
<160> 1
<210> 1
<211> 1434
<212> DNA
<213> 链霉菌(Streptomyces sp.)
<400> 1
tgcttacaca tgcagtcgaa cgatgaacca cttcggtggg gattagtggc gaacgggtga 60
gtaacacgtg ggcaatctgc ccttcactct gggacaagcc ctggaaacgg ggtctaatac 120
cggatactga ccctcgcagg catctgcgag gttcgaaagc tccggcggtg aaggatgagc 180
ccgcggccta tcagcttgtt ggtgaggtaa tggctcacca aggcgacgac gggtagccgg 240
cctgagaggg cgaccggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 300
gcagtgggga atattgcaca atgggcgaaa gcctgatgca gcgacgccgc gtgagggatg 360
acggccttcg ggttgtaaac ctctttcagc agggaagaag cgaaagtgac ggtacctgca 420
gaagaagcgc cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggc gcaagcgttg 480
tccggaatta ttgggcgtaa agagctcgta ggcggcttgt cacgtcggtt gtgaaagccc 540
ggggcttaac cccgggtctg cagtcgatac gggcaggcta gagttcggta ggggagatcg 600
gaattcctgg tgtagcggtg aaatgcgcag atatcaggag gaacaccggt ggcgaaggcg 660
gatctctggg ccgatactga cgctgaggag cgaaagcgtc gggagcgaac aggattagat 720
accctggtag tccacgccgt aaacggtggg cactaggtgt gggcaacatt ccacgttgtc 780
cgtgccgcag ctaacgcatt aagtgccccg cctggggagt acggccgcaa ggctaaaact 840
caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gcggagcatc tggcttaatt cgacgcaacg 900
cgaagaacct taccaaggct tgacatacgc cggaaagcat cagagatggt gccccccttg 960
tggtcggtgt acaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1020
gtcccgcaac gagcgcaacc cttgtcccgt gttgccagca agcccttcgg ggtgttgggg 1080
actcacggga gaccgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg ggacgacgtc aagtcatcat 1140
gccccttatg tcttgggctg cacacgtgct acaatggccg gtacaatgag ctgcgatacc 1200
gcaaggtgga gcgaatctca aaaagccggt ctcagttcgg attggggtct gcaactcgac 1260
cccatgaagt cggagtcgct agtaatcgca gatcagcatt gctgcggtga atacgttccc 1320
gggccttgta cacaccgccc gtcacgtcac gaaagtcggt aacacccgaa gccggtggcc 1380
caaccccttg tgggagggag ctgtcgaagg tgggactggc gatggacgaa gtcg 1434
- 上一篇：石墨接头机器人自动装卡簧、装栓机
- 下一篇：一种共培养促进红曲菌生产黄色素的方法
