一种用于可视化检测五氯硝基苯的分子印迹比率荧光探针及荧光试纸
技术领域
本发明属于比率荧光探针的
技术领域
，具体涉及一种用于可视化 检测五氯硝基苯的分子印迹比率荧光探针及荧光试纸。背景技术
五氯硝基苯(Pentachloronitrobenzene，PCNB)作为一种有机氯 保护性杀菌剂，因其具有毒性、难降解性、紊乱人体内分泌、可通过 食物链富集到生物体内等危害而被列入致癌物清单中。面对这一危害， 欧美等国家采取禁止或限制使用PCNB的措施，而国内虽然没把 PCNB列入禁用农药清单中，但建立了许多针对不同样品中PCNB的 分析检出方法。
近年来，色谱法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)和光谱法等应 用于PCNB的检出。例如，Li等建立了一种采用QuEChERS前处理 结合GC-MS/MS的检测方法，该方法已成功应用于分析检测贝类样 品中84种PCBs和OCPs类农药残留；Xu等报道了一种竞争性ELISA 用来检测PCNB，实验结果表明该方法能有效替代GC法用来监测环 境中的农药残留PCNB。虽然上述方法都具有灵敏度高、选择性强的 优点，但需要专门、昂贵的仪器和专业技术人员，这就大大限制了其 应用，不适用于现场检测。
每种检测方法都有其优缺点，而可视化检测是目前热门研究方向。 比率荧光法具有灵敏度高、操作简便、成本低和可视化等优势，适合 应用于目标物的快速简便检测。因此，本发明建立一种基于分子印迹 比率荧光试纸的检测方法用于PCNB的可视化检测。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于可视化检测五氯 硝基苯的分子印迹比率荧光探针及荧光试纸，基于发射橙色荧光的荧 光材料BPDN提供良好的荧光响应信号，以及发射绿色荧光的 [email protected]2提供稳定的参考信号，所得分子印迹比率荧光探针具有 良好的选择性、较高的灵敏度，制成试纸具有显著的可视化检测效果。
本发明的技术内容如下：
本发明提供了一种用于可视化检测五氯硝基苯的分子印迹比率 荧光探针(Molecularly imprinted ratiometric fluorescent probe，MIRF probe)，所述分子印迹比率荧光探针为基于上述的发射橙色荧光的荧 光材料BPDN以及发射绿色荧光的[email protected]2、模板分子PCNB， 采用分子印迹技术制备的MIRF探针；
所述荧光材料BPDN的结构如下所示：
所述荧光材料BPDN为席夫碱化合物1,1'-{4,4'-联苯二基双[亚氨 基(E)]}二(2-萘酚)，简称为BPDN，其在探针制备过程中，所用 水-DMF溶液中水体积分数超过40％时，聚集诱导形成，发射橙色荧 光。
所述[email protected]2的结构为BPDN包裹在SiO2中，发射绿色荧 光。
本发明还提供了一种用于可视化检测五氯硝基苯的分子印迹比 率荧光试纸，其为上述分子印迹比率探针吸附到滤纸上得到。
本发明还提供了一种用于可视化检测五氯硝基苯的分子印迹比 率荧光探针的制备方法，包括如下步骤，将发射橙色荧光的BPDN 和发射绿色荧光的[email protected]2混合，加入模板分子PCNB、交联剂 以及引发剂，混合搅拌均匀，之后在氮气环境下，加热反应得到分子印迹聚合物，洗脱除去PCNB，即得到分子印迹比率荧光探针；
所述荧光材料BPDN的制备为采用以联苯胺、羟基-1-萘甲醛为 原料制得，具体操作为，将联苯胺、羟基-1-萘甲醛分别溶于有机溶剂 (无水乙醇)中，混合搅拌反应过夜，得到橙色沉淀，洗涤、离心、 干燥之后即得到1,1'-{4,4'-联苯二基双[亚氨基(E)]}二(2-萘酚) (BPDN)。其性质为：BPDN溶解在DMF中会发出蓝色荧光，当 BPDN的浓度从1.0×10-7M增大到1.0×10-5M时，BPDN的最大发射 波长(λmax)从420nm红移到518nm，并且溶液的荧光颜色也随之 由蓝色变为绿色。在上述体系中加入不良溶剂水后，所得溶液的最大 发射波长从518nm红移到560nm，溶液发出橙色荧光(图4)。此现 象也可以通过改变水-DMF的体积分数比来实现(图5)。浓度为1.0×10-5M的BPDN在DMF中发出绿色荧光，对应的紫外-可见吸收 光谱中具有较宽的吸收。当水体积分数增加到20％时，溶液的荧光颜 色从绿色变为蓝色，其紫外吸收发生红移。当水体积分数超过40％ 时，溶液发出橙色荧光；
所述[email protected]2的制备为将BPDN与硅烷类有机物混合，加入 到微乳液体系中反应得到，所述硅烷类有机物包括乙烯基三乙氧基硅 烷(VTES)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)；
所述微乳液体系为磺酸钠盐溶解，与有机溶剂(包括正丁醇)和 水混合得到的溶液，所述磺酸钠盐包括丁二酸二辛酯磺酸钠(AOT)；
所述交联剂包括乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)；
所述引发剂包括偶氮二异丁腈(AIBN)。
本发明的有益效果如下：
本发明的检测五氯硝基苯的分子印迹比率荧光探针，其制备为基 于席夫碱荧光材料BPDN得到，并以发射绿色荧光的[email protected]2提供稳定的参考信号以及发射橙色荧光BPDN提供良好的荧光响应 信号；本发明的分子印迹比率荧光探针具有良好的选择性和较高的灵 敏度，该探针成功地应用到土壤、自来水和桂圆肉样品中PCNB的分 析检测，所制备的荧光试纸对PCNB具有显著的可视化检测效果；
本发明的荧光探针的制备，首先合成多色荧光席夫碱化合物 BPDN作为荧光材料，在此基础上合成发射绿色荧光的参考信号材料 和发射橙色荧光的响应信号材料，再结合分子印迹技术制备得到 MIRF荧光探针，将本发明的分子印迹比率荧光探针吸附到滤纸上构 建MIRF试纸，应用于可视化检测农药残留PCNB，试纸荧光颜色随 模板分子浓度增加而发生变化，实现可视化检测。
附图说明
图1为本发明分子印迹比率荧光探针及其检测试纸的制备流程 图；
图2为本发明的荧光材料BPDN的合成路线图；
图3为荧光材料BPDN的红外光谱图；
图4为荧光材料BPDN的荧光发射光谱图；
图5为荧光材料BPDN在不同混合溶剂中的荧光发射光谱图和 紫外-可见吸收光谱图；
图6为本发明的[email protected]2(A)、MIRF探针(B)和非分子 印迹比率荧光探针(NIRF探针)(C)的SEM图；
图7为本发明的MIRF探针、BPDN和[email protected]2的荧光发射 光谱图及可视化图；
图8为本发明的MIRF探针和NIRF探针检测PCNB的荧光发射 光谱图及线性图；
图9为本发明的MIRF探针溶液、MIRF探针与PCNB的混合溶 液在室温下的稳定性考察结果图；
图10为本发明的MIRF探针检测PCB、PCBCN和PCBA的荧 光发射光谱图；
图11为本发明的MIRF探针溶液、MIRF探针与PCNB的混合 溶液抗离子干扰图；
图12为本发明的MIRF荧光试纸在日光下(a)和在紫外灯下(b) 检测PCNB的可视化图。
具体实施方式
以下通过具体的实施案例对本发明作进一步详细的描述，应理解 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅 读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均 落于本申请所附权利要求所限定。
若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、 试剂。
实施例1
一种荧光材料BPDN的制备：
称取0.64g联苯胺(3.5mmol)置于圆底烧瓶中加入30mL无 水乙醇，搅拌溶解；称取1.20g 2-羟基-1-萘甲醛(7.0mmol)溶于30 mL无水乙醇后，逐滴加入到上述圆底烧瓶中。随后将混合溶液搅拌 反应过夜，得到橙色沉淀。产物用无水乙醇洗涤3次，于4000r离心 5min后置于60℃烘箱中干燥，最终得到1.40g BPDN(产量为 82.4％)。称取0.0050g BPDN(0.01mmol)溶解在10.0mL N，N-二 甲基甲酰胺(DMF)中，得到BPDN储备液(1.0mM)；
所述BPDN 1,1'-{4,4'-联苯二基双[亚氨基(E)]}二(2-萘酚)的 合成路线如图2所示。
如图3所示，为BPDN材料的红外光谱图，从图中可见席夫碱 特征吸收峰(-C＝N，1623cm-1)，表明席夫碱化合物BPDN成功合成。
如图4所示，图中的插图从左至右分别为0.10μM BPDN在DMF 溶液、10.0μM BPDN在DMF溶液和10.0μM BPDN在40％H2O-DMF 混合溶剂的可视化图，图中，BPDN溶解在DMF中会发出蓝色荧光。 当BPDN的浓度从1.0×10-7M增大到1.0×10-5M时，BPDN的最大发 射波长从420nm红移到518nm，并且溶液的荧光颜色也随之由蓝色 变为绿色。在上述体系中加入不良溶剂水后，所得溶液的最大发射波 长从518nm红移到560nm，溶液发出橙色荧光。
如图5所示，图A中，浓度为1.0×10-5M的BPDN在DMF中 发出绿色荧光，对应的紫外-可见吸收光谱(图B)中具有较宽的吸 收。由图A-B可见，当水体积分数增加到20％时，溶液的荧光颜色 从绿色变为蓝色，其紫外吸收发生红移。当水体积分数超过40％时， 溶液发出橙色荧光，并且其荧光强度随水的体积分数增加而变得越来 越弱，同时其溶液的紫外吸收也发生了红移，之后就基本没有变化。 这是由于激基缔合物的形成才导致BPDN的最大荧光发射波长从516 nm红移到560nm；此外由于J-聚集体的形成才导致BPDN的紫外吸 收发生红移，然后随着BPDN的浓度增大或者加入不良溶剂水后， 溶液中的分子会聚集产生沉淀，导致荧光强度降低。图C中，浓度 为1.0×10-5M的BPDN在MeOH中的最大发射波长为516nm，对应的紫外-可见吸收光谱(图D)中具有较窄的吸收。由图C-D可见， 当水体积分数增加到20％时，BPDN的最大荧光发射波长从516nm 红移到560nm，其紫外吸收发生蓝移；随水的体积分数增加变得其 荧光强度越来越弱，同时其溶液的紫外吸收也发生了蓝移，之后就基本没有变化。这是由于激基缔合物的形成才导致BPDN的最大荧光 发射波长从516nm红移到560nm；此外由于H-聚集体的形成才导致 BPDN的紫外吸收发生蓝移，然后随着水的体积分数增加，溶液中的 分子会聚集产生沉淀，导致荧光强度降低。图E中，浓度为1.0×10-5 M的BPDN在THF中的最大发射波长为510nm，对应的紫外-可见 吸收光谱(图F)中具有较宽的吸收。由图E-F可见，当水体积分数 增加到20％时，BPDN的最大荧光发射波长从510nm红移到516nm， 其紫外吸收发生红移；当水体积分数超过60％时，BPDN的最大荧光 发射波长从516nm红移到560nm，其紫外吸收发生蓝移；随水的体 积分数增加变得其荧光强度先增强后减弱，同时其溶液的紫外吸收也 发生了蓝移，之后就基本没有变化。这是由于激基缔合物的形成才导 致BPDN的最大荧光发射波长从510nm红移到516nm，此外由于J- 聚集体的形成才导致BPDN的紫外吸收发生红移；然后随着水的体 积分数增加60％，另一个激基缔合物的形成才导致BPDN的最大荧 光发射波长从516nm红移到560nm，此外由于H-聚集体的形成才导 致BPDN的紫外吸收发生蓝移；而后随着水的体积分数增加，溶液 中的分子会聚集产生沉淀，导致荧光强度降低。
实施例2
一种绿色荧光的信号材料[email protected]2：
称取0.44gAOT(丁二酸二辛酯磺酸钠)溶解于20mL去离子水， 加入800.0μL正丁醇搅拌直至溶液澄清透明，形成微乳液体系，随后 加入800.0μLBPDN储备液(1.0mM)和200.0μLVTES(乙烯基三 乙氧基硅烷)。
搅拌反应4h后，加入10.0μLAPTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷) 再搅拌反应24h。待反应结束后，加入无水乙醇破乳，静置除去上清 液后，沉淀分别用丙酮和水各洗涤沉淀3次，于4000r离心5min后 置于60℃烘箱中干燥，得到发射绿色荧光的参考信号材料 [email protected]2。
实施例3
一种橙色荧光的信号材料BPDN：
称取10mg BPDN(0.02mmol)溶解在10.0mLN，N-二甲基甲 酰胺(DMF)中，得到BPDN储备液(2.0mM)，4.0mL BPDN储备 液(2.0mM)加入到DMF-水溶液(v/v 4:3，7.0mL)中产生聚集诱 导发光，得到发射橙色荧光的响应信号材料BPDN。
实施例4
一种分子印迹比率荧光MIRF探针的制备：
称取实施例2的参考信号材料[email protected]260.0 mg分散在4:3 (v/v)的DMF-水溶液(7.0mL)中，加入4.0mL实施例3的BPDN (2.0mM)溶液并搅拌10min同时得到响应信号材料，随后加入0.075 mmol模板分子PCNB、1.5mmol交联剂EGDMA和10.0mg引发剂 AIBN，在室温下搅拌12h形成自组装溶液。
用高纯氮气通气10min后，置于60℃水浴锅中反应6h，生成分 子印迹聚合物，最后用环己烷洗涤产物数次以洗脱PCNB，直到洗脱 液用紫外-可见分光光度计检测不到PCNB吸收峰为止，即得到MIRF 探针。
如图1所示，为本发明分子印迹比率荧光探针及其检测试纸的制 备流程图，通过席夫碱反应直接合成多色荧光席夫碱化合物BPDN 为荧光材料，在此基础上分别合成了发射绿色荧光的参考信号材料 [email protected]2和发射橙色荧光的响应信号材料BPDN，再结合分子印 迹技术制备得到MIRF荧光探针，将该探针吸附到滤纸上制备得到 MIRF试纸，并且该试纸已成功用于可视化检测PCNB，所得试纸荧 光颜色随模板分子浓度增加而发生变化，从而实现可视化检测。
非分子印迹比率荧光NIRF探针在相同条件下合成，但在制备过 程中不加模板分子PCNB。
如图6所示，采用SEM分别对[email protected]2、MIRF探针和NIRF 探针进行表征，图6A中，可见所合成的二氧化硅纳米颗粒都呈球形， 并且[email protected]2的粒径大小约为60nm，其在图7中所对应处可见 [email protected]2在440nm处具有最大发射波长，可见BPDN成功包埋 在二氧化硅纳米颗粒中；
图6B-C中，可见MIRF探针的表面粗糙，而NIRF探针相对平 滑，这表明模板分子PCNB的印迹孔穴已成功印迹在MIRF探针中。 此外，MIRF探针的荧光发射光谱(图7)显示其在440nm和516nm 具有双发射峰，说明发射绿色荧光的[email protected]2和发射橙色荧光的 BPDN均成功的被包裹在分子印迹聚合物中，表明MIRF探针制备成 功。
试验例
1.PCNB的荧光检测与可视化检测
采用荧光发射光谱和紫外灯(λex＝365nm)探究MIRF探针的分 析性能。
如图8所示，实施例4所制备的MIRF探针的荧光强度比与PCNB 浓度在50.0～600.0μmol/L之间呈线性关系，拟合得到的线性方程为 F516/F440＝-0.00155×[PCNB/μM]+1.785(R＝0.9984)，根据3σ/k规则计算 出检测限为14.7μM。
其中，图8A的插图中，MIRF探针溶液的荧光颜色从橙色渐变 到黄色最后变成绿色，表明它具有在现场进行可视化检测的潜力。反 观非分子印迹比率荧光探针(NIRF探针)，由图8B可见，PCNB对 NIRF探针的猝灭效率比较低，而且荧光颜色变化也不明显，基本为 橙色，这说明MIRF探针对PCNB的选择性识别能力比NIRF探针强 得多，表明相比于NIRF探针，MIRF探针具有良好的特异性识别能 力。
2.荧光探针MIRF的重复性和稳定性
选择荧光探针浓度为2.0mg/mL，PCNB浓度为300.0μM，并记 录溶液的荧光强度比F516/F440。
通过测定6批不同MIRF探针和PCNB的混合溶液来考察其重复 性，经重复测定每批样品3次后，得到荧光强度比F516/F440的相对标 准偏(RSD)差为1.5％。
为了研究其稳定性，考察MIRF探针溶液在室温下的荧光强度比 F516/F440，同时也考察MIRF探针与PCNB的混合溶液在室温下的荧 光强度比F516/F440，如图9所示，表明MIRF探针溶液，MIRF探针 与PCNB的混合溶液在2h内均保持稳定。
上述结果表明，本发明的荧光探针及其使用具有良好的重复性和 稳定性。
3.荧光探针MIRF的选择性和抗干扰能力
选择荧光探针MIRF浓度为2.0mg/mL，考察PCNB结构类似物 (PCB、PCBA和PCBCN)与金属离子对PCNB测定的影响，记录 各个结构类似物溶液的荧光发射光谱。
在最佳实验条件下，通过分别加入同等浓度的结构类似物来考察 其选择性，测定结果如图10所示，可见PCNB结构类似物的荧光猝 灭效率非常低，并且在紫外灯照射下观察不到明显的颜色变化(基本 为橙色)。结果表明，这些结构类似物均不影响MIRF探针对PCNB的分析检测，表明本发明所制备的MIRF探针具有良好的选择性。
还通过加入过量金属离子来研究干扰物质对PCNB测定的影响， 所选择的探针浓度为2.0mg/mL，PCNB浓度为300.0μM，并记录溶 液的荧光强度比F516/F440。测定结果如图11所示。与各自空白相比， MIRF探针溶液，MIRF探针与PCNB的混合溶液在过量金属离子存 在下，各自的荧光强度比F516/F440没有发生显著的变化，这说明MIRF 探针对金属离子没有响应，因此溶液的荧光强度比F516/F440不受金属 离子的干扰，结果表明MIRF探针具有良好的抗干扰能力。
4.荧光探针MIRF的试剂样品检测
将荧光探针MIRF应用到自来水、土壤以及桂圆肉样品中测定PCNB，结果如表1所示：
表1自来水、土壤和桂圆肉样品中PCNB的加标回收率
本发明的荧光检测方法的加标回收率在99.7％～111.3％之间，通 过平行检测3次，计算得到相对标准偏差(RSD)均小于3.0％，表 明这是一种可靠的测定实际样品PCNB的方法。
选择的探针浓度为2.0mg/mL，PCNB浓度为300.0μM，并记录 溶液的荧光强度比F516/F440。在最佳实验条件下，通过测定同一MIRF 探针与PCNB的混合溶液来研究其精密度，经重复测定6次后，得到 荧光强度比F516/F440的相对标准偏差为1.6％，表明，本发明的荧光探 针MIRF的检测方法具有良好的准确度和精密度。
5.荧光探针MIRF的试纸应用
将100.0μLMIRF探针溶液吸附在滤纸上，在室温下干燥制备得 到MIRF试纸，该试纸在紫外灯(λex＝365nm)照射下显示橙色荧光。 通过在一系列试纸上滴加不同浓度的PCNB(100.0～600.0μM)来进 行可视化检测。
在黑暗环境中以及在紫外光照射下，拍下各个试纸的荧光颜色。 从图12可以观察到在加入不同浓度PCNB后，试纸在紫外灯照射下 从橙色到黄色到绿色的荧光颜色变化，表明所制备的试纸用于可视化 检测PCNB是可行的。
