具体实施方式

本发明使用绿色荧光的荧光素作为荧光指示剂，英文缩写为FL，使用具有聚集诱导发光性质的红色荧光碳量子点作为内部参照，英文缩写为RQDs。两者通过物理沉积法修饰在有机相滤膜表面。当生物胺分子存在时，FL分子构象发生改变，绿色荧光增强，而RQDs对于生物胺没有响应，荧光不受干扰。两种荧光信号强度的改变与生物胺的浓度密切相关，且可以通过裸眼识别，因此，该比率荧光膜可以作为智能标签用于生物胺的可视化、实时监测。

溶剂热法是在水热法的基础上发展起来的，指密闭体系如高压釜内，以有机物或非水溶媒为溶剂，在一定的温度和溶液的自生压力下，原始混合物进行反应的一种合成方法。

本发明中所用的实验试剂包括二硫代水杨酸、荧光素和三聚氰胺由阿拉丁化学有限公司提供。氨(25％)和乙酸从广东光华科技有限公司获得。

有机相滤膜(0.22μm)从上海新亚净化设备厂购买。

检测仪器设备等均为常用的仪器，自动凯氏定氮仪测定虾肉样品中的总挥发性盐基氮(TVB-N)检测方法均为现有常规方法。肉食品的水浸液中在碱性条件下能与水蒸气一起蒸馏出来的总氮量即TVB-N，TVB-N值用来体现食品的新鲜程度。

生物胺(biogenic amine，BA)是一类具有生物活性含氮的低分子量有机化合物的总称。可看作是氨分子中1-3个氢原子被烷基或芳基取代后而生成的物质，是脂肪族，酯环族或杂环族的低分子量有机碱，常存在于动植物体内及食品中。

本发明的R-F滤膜对生物胺表现出敏感的荧光响应，体现食品的新鲜程度，通过本发明的荧光检测与常用的TVB-N检测方法进行相互验证，证明本发明的R-F滤膜在检测生物胺方面的应用可靠性。

RGB是指光学三原色：R是红色(Red)、G是绿色(Green)、B是蓝色(Blue)。RGB的值是指其亮度，数值越大，亮度越大。本发明的实施例中的RGB值为3个平行数值求出的平均值和标准偏差。

实施例1：

遵从上述技术方案，给出一种基于荧光素和碳量子点的比率荧光滤膜及制备方法，包括以有机相滤膜作为基底材料，以荧光素为指示剂，以碳量子点为内部参照，将荧光素和碳量子点沉积在有机相滤膜上，形成比率荧光滤膜，所述的荧光指示剂为绿色荧光的荧光素，所述的碳量子点在聚集状态下发射红色荧光，所述的碳量子点由三聚氰胺和二硫代水杨酸，通过溶剂热法制备得到。

该比率荧光滤膜的制备方法包括将碳量子点的乙醇溶液和荧光素的乙醇溶液混合，并将有机相滤膜浸没在混合溶液中，后取出干燥即得。

所述碳量子点的制备方法包括：

将三聚氰胺和二硫代水杨酸通过超声分散在乙酸溶液中，然后将得到的溶液转移至聚四氟乙烯反应釜中加热，冷却后依次经过洗涤、真空过滤、纯化后即得。

所述的碳量子点的乙醇溶液和荧光素的乙醇溶液的浓度比为4:0.5，体积比为4:(0.1～1.5)。

所述的三聚氰胺的质量分数为0.4～0.6％，二硫代水杨酸的质量分数为1～1.5％，反应温度为175～185℃，反应时间为8～12h。

作为一种优选的实施例，比率荧光滤膜的制备方法包括如下步骤，

首先，配制(red quantum dots,RQDs)RQDs(4mg/mL)的乙醇溶液和绿色荧光的荧光素FL(0.5mg/mL)的乙醇溶液，然后将4mLRQDs溶液与1mL FL溶液均匀混合，并将有机相滤膜完全浸没在溶液中。100s后，取出有机相滤膜并在室温下自然干燥。得到比率荧光滤膜，简称R-F滤膜。碳量子点的乙醇溶液和荧光素的乙醇溶液的浓度比为4:0.5，体积比为4:(0.1～1.5)。

具体在本实施例中，可以为：(1)4mL RQDs溶液与0.1mL FL溶液混合；(2)4mL RQDs溶液与0.2mL FL溶液混合；(3)4mL RQDs溶液与0.6mL FL溶液混合；(4)4mL RQDs溶液与1mLFL溶液混合；(5)4mL RQDs溶液与1.5mL FL溶液混合。

碳量子点的乙醇溶液和荧光素的乙醇溶液的体积比为4:1为最佳配比。

其中，FL可在胺分子存在下通过构象变化引起荧光增强，从而充当指示剂。RQDs具有疏水性，荧光强度不受胺分子的干扰。因此，RQDs充当内部参考。

在本实施例中，碳量子点的制备方法具体包括：

将三聚氰胺(MA)和二硫代水杨酸(DTSA)以0.5％和1.36％的质量分数通过超声分散在60mL乙酸溶液中，然后将得到的溶液转移至100mL的聚四氟乙烯反应釜中在180℃条件下加热10h。待溶液冷却至室温后，将其添加至1L的沸水中去洗掉残余的物质和溶剂。通过真空过滤得到固体的量子点，然后在60℃干燥。为了进一步纯化制备的RQDs，将RQDs重新分散在乙醇溶液中，通过离心去除不溶物。上清液再次进行真空干燥以得到纯化的RQDs。

制备的滤膜如图1所示。在环境光下，由RQDs和R-F(RQDs和FL)修饰的滤膜均显示粉色，而FL修饰的滤膜为绿色。这一系列的颜色变化意味着可以将两种荧光材料RQDs和FL沉积在滤膜上。

对三种荧光滤膜的荧光性能进行研究。可以看出，在254nm和365nm的UV光下，未经修饰的滤膜无荧光，而FL修饰的滤膜则显示绿色荧光。RQDs滤膜和R-F滤膜均显示明亮的粉色荧光。再次证明RQDs和FL已成功沉积在滤膜上。

表1展示了不同滤膜分别在Daylight日光、254nm和365nm紫外光条件下的RGB值变化。其中，blank表示空白膜、RQDs film表示RQDs修饰的滤膜、FL film表示FL修饰的滤膜、R-F film表示RQDs和FL修饰的滤膜。

可以看出在三种光线条件下，修饰后的滤膜均呈现出不同于空白膜的RGB值，验证了RQDs和FL在滤膜上的成功修饰。

表1 RQDs和FL修饰后的滤膜的RGB值

实施例2：

本实施例以氨水作为模型生物胺，以研究制备的比率荧光滤膜检测生物胺蒸气的能力。即公开了一种基于荧光素和碳量子点的比率荧光滤膜用于检测生物胺的应用。

首先，通过用去离子水稀释市售氨水制备一系列已知浓度的氨溶液。之后，将氨溶液添加至24孔板(每孔1mL)，并将制备的滤膜立即置于24孔板的顶部。用照相机记录荧光的颜色变化。

如图2所示，当将RQDs滤膜暴露于浓度为25mg/mL的氨气中时，无论是在254nm还是365nm的紫外光下，荧光颜色均保持不变。这表明RQDs对氨没有响应，可以作为内部参考。然而，在相同条件下，FL滤膜的绿色荧光显著增强。这主要是由于FL的质子在暴露于氨气后被剥夺，从而导致分子结构发生变化。因此FL可用作氨的指示剂。对于R-F滤膜，紫外光下荧光从粉色变为绿色。表2中相应的RGB值与上述颜色变化一致，共同表明所制备的R-F滤膜可用作双信号比率荧光标签用于可视化检测氨。

表2中，RQDs-before表示未暴露在氨气中的RQDs滤膜，RQDs-after表示暴露在氨气环境中，检测响应后的RQDs滤膜；FL-before表示未暴露在氨气中的FL滤膜，FL-after表示暴露在氨气环境中，检测响应后的FL滤膜；R-F-before表示未暴露在氨气中的RQDs和FL修饰的滤膜，R-F-after表示暴露在氨气环境中，检测响应后的RQDs和FL修饰的滤膜。

表2不同滤膜对氨响应的RGB值

为了获得最佳的检测性能，优化了两种荧光材料的比例，以及在氨环境中的暴露时间。具体如下：RQDs溶液浓度为4mg/mL，FL溶液浓度为0.5mg/mL。

(Ⅰ)4mL RQDs溶液与0.1mL FL溶液混合；

(Ⅱ)4mL RQD溶液与0.2mL FL溶液混合；

(Ⅲ)4mL RQD溶液与0.6mL FL溶液混合；

(Ⅳ)4mL RQD溶液与1mL FL溶液混合；

(Ⅴ)4mL RQD溶液与1.5mL FL溶液混合；

如图3所示，无论在254nm还是365nm的紫外光下，测试的FL的添加量在与氨反应之前对R-F滤膜的荧光颜色的影响都很小。当暴露于氨环境中时，低浓度FL制备的R-F滤膜的荧光没有明显变化，仍保持粉色。随着FL浓度的增加，R-F滤膜逐渐出现绿色荧光。

在综合考虑了R-F滤膜在两种不同的紫外线下反应前后的荧光颜色变化及表3中RGB值变化之后，选择4mL RQDs溶液(4mg/mL)和1mL FL溶液(0.5mg/mL)的混合液(Ⅳ组)用于制备滤膜。表3中表示R-F滤膜由两种荧光材料以上述Ⅰ～Ⅴ五种比例制备而成，然后与氨反应前后的RGB值，control表示空白对照膜。

表3不同两种荧光材料的比例制备得到的R-F滤膜的RGB值

反应时间也是影响检测性能的重要因素。我们记录了20min内R-F滤膜对氨的荧光变化。

如图4所示，在254nm和365nm的紫外光下，R-F滤膜的荧光在1至20min内没有显著变化，表明制备的荧光膜对氨的响应在1min内达到了平衡。因此，在综合考虑表4中RGB值变化之后，将1min设置为最佳响应时间。

表4不同响应时间下R-F滤膜的RGB值

在上面讨论的最佳实验条件下，探索了在两种激发波长下，R-F比率荧光膜对不同浓度的氨的荧光响应。

如图5所示，在254nm紫外灯下，随着氨气浓度的增加，FL的绿色荧光逐渐占主导地位。观察者无需进行任何培训即可清楚地识别出从粉色到绿的独特荧光颜色变化，这表明比率荧光膜具有可视化检测氨气的潜力。R-F比率荧光膜在365nm的紫外光下的荧光颜色的变化趋势与254nm下的基本相同。并且表5中的RGB数值与上述荧光颜色变化相一致。表5表示R-F滤膜对不同NH₃浓度(0～25000ppm)的荧光响应前后的RGB值。

以上结果共同表明R-F比率荧光膜对氨具有灵敏和快速的颜色响应，并且无需借助精密仪器就可以用肉眼观察到颜色变化。所制备的荧光膜具有巨大的潜力，可以作为监测BAs的荧光标签而开发。

表5 R-F滤膜对不同浓度的氨的荧光响应的RGB值

在本实施例中，R-F滤膜与氨的反应是可逆的。将R-F比率荧光膜从NH₃气氛中取出并在空气中放置1min后，FL的荧光被猝灭，膜的颜色恢复到原始状态。因此，该荧光膜可重复使用。

具体试验结果如图6和表6所示，该R-F比率荧光膜在用于2.5mg/mL氨气检测的重复五个循环(1、2、3、4、5表示5个循环)后没有明显的荧光强度衰减，证明了其优异的稳定性、氨反应性和可逆性。因此，R-F比率荧光膜适用于传感系统中的实际应用。这种比率荧光策略可以避免环境因素的影响，从而获得更可靠的结果。

表6 R-F比率荧光膜的不同循环检测后的RGB值

实施例3：

本实施例给出R-F滤膜在虾贮存过程中产生的生物胺的荧光检测效果。以市售鲜虾为真实样品，进行生物胺的检测。R-F滤膜由实施例1的制备方法制备得到，两种荧光材料采用最佳配比。

首先，将虾放入无菌培养皿中，然后将R-F滤膜放置在培养皿内，注意避免R-F滤膜与虾直接接触，接下来，将所有培养皿密封并在不同温度(-20℃、4℃和25℃)下放置1～5天。同时，为了消除环境湿度对膜荧光的干扰，将R-F滤膜置于含湿巾的容器中，同样在不同温度(-20℃、4℃和25℃)下放置1～5天，作为对照试验组。在此期间，通过摄像头记录了紫外光下R-F滤膜的荧光变化，以分析样品的新鲜度。此外，使用自动凯氏定氮仪测定虾肉样品中的总挥发性盐基氮(TVB-N)，所有测量均重复三次，结果见表7。

表7中，25℃-0day表示虾在25℃保存0天，即初始状态下的样品，25℃-1day表示虾在25℃保存1天后的样品，其余类推。

图7中看出，在254nm激发波长的紫外线下，粉色逐渐变淡至灰白色，表示虾由新鲜慢慢变质到严重变质的过程。可以看出，在25℃下保存1天和在4℃下保存3天后，R-F滤膜的原始粉色荧光变淡成灰白色，表明虾变质了。然而，当虾在-20℃下保存5天时，R-F滤膜的荧光颜色几乎没有明显变化，表明虾仍是新鲜的。

在365nm激发波长的紫外线下，粉色代表新鲜，黄绿色代表变质，绿色代表严重变质。可以看出，R-F滤膜仍对生物胺表现出敏感的荧光响应，在25℃下保存1天和在4℃下保存3天后，R-F滤膜的原始粉色荧光变成黄色，表明虾变质了。R-F滤膜在254nm和365nm激发波长的紫外线下，荧光变化的过程均能体现出虾从新鲜到变质的过程，且结果可靠。

表8中，25℃-0day表示R-F滤膜在25℃保存0天，即初始状态下的R-F滤膜，25℃-1day表示R-F滤膜在25℃保存1天，其余类推。图8结果显示，在254nm或365nm紫外光下，R-F滤膜的荧光强度在5天内几乎保持不变。

结合图7、表7、图8和表8，R-F滤膜置于含湿巾的容器中的对照试验组，说明R-F滤膜的荧光几乎不受环境湿度的影响，从而证明图7和表7中的荧光变化主要归因于R-F滤膜对生物胺的荧光响应，因此，该R-F滤膜可用于检测虾的新鲜程度。

表7 R-F滤膜用于生物胺的检测的RGB值

表8 R-F滤膜不同天数下荧光强度的RGB值

将R-F比率荧光膜的检测结果与标准TVB-N方法的检测结果进行了比较，以验证检测准确性。根据标准，当TVB-N含量低于120mg/kg时，生虾是新鲜的。当TVB-N含量在120～250mg/kg范围内时，虾已略微分解，但仍可食用。当TVB-N含量超过250mg/kg时，虾变质且不可食。

如图9所示，新鲜虾的TVB-N水平为53mg/kg。在25℃下保存1天后，该值增至1040mg/kg，表明虾已完全变质。同时，R-F滤膜的荧光在254nm紫外光下从粉色变淡，向灰白色变化，在365nm紫外光下从粉色变黄，向绿色变化。

将虾在4℃下放置3天后，TVB-N值为350mg/kg。荧光膜在254nm紫外线下颜色变淡，呈灰白色，在365nm紫外线下变成黄色，反映出虾的变质。

在-20℃下放置5天后，该值增加到86mg/kg，但R-F滤膜的荧光几乎不变，这意味着虾仍然新鲜可食。

上述实验结果表明，R-F滤膜的荧光颜色变化与标准TVB-N方法的结果一致。因此，R-F滤膜可以用作智能标签，以简单而准确地监控虾和蟹的新鲜度。利用此功能，可以将智能标签轻松应用于海鲜供应链，从而以实时和可视方式监控新鲜度。将来，还有望使用智能手机来捕获标签并通过更准确的颜色分析来评估新鲜度。