具体实施方式

为了更加容易理解本发明，描述实施例之前，先对本发明某些技术和科学术语作以下说明：

本文所使用的术语“LAP(Latency-associated peptide)”，是TGFβ前体蛋白N端的一部分多肽序列。TGFβ前体蛋白在体内合成后，分解成成熟的具有生物活性的TGFβ细胞因子与LAP蛋白质，后者呈笼子状将TGFβ包裹在内形成小复合物，并通过二硫键与5种不同的锚定蛋白形成大复合物，从而将TGFβ局限在不同类型的细胞或细胞外基质中；当LAP被蛋白酶水解或其RGD区域构改变时，TGFβ从潜伏复合物中释放出，表现出其细胞因子活性。

本文所使用的术语“抗体”，包含全抗体及其任一抗原结合片段，抗体包括鼠源抗体、人源化抗体、双特异抗体或嵌合抗体，抗体也可以是Fab、F(ab)2、Fv或ScFv(单链抗体)，抗体可以是天然存在的抗体也可以是通过改变(例如突变、缺失、置换等)的抗体。

本文所使用的术语“可变区”和“恒定区”，即为抗体重链和轻链靠近N段的序列区为可变区(V区)，靠近C段的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)，可变区包括3个互补性决定区(CDR)和4个框架区(FR)，每条轻链可变区和重链可变区均有3个CDR区和4个FR区组成，重链的3个CDR区分别通过HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，轻链的3个CDR区分别通过LCDR1、LCDR2和LCDR3表示。

本文所使用的术语“抗体分子”，其来源是用LAP抗原免疫注射小鼠后得到的抗体。

术语“CHO细胞”为中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cell)；术语“HEK293细胞”为人胚肾293E细胞(human embryonic kidney 293E cell)，术语“NS0细胞”为小鼠NS0胸腺瘤细胞。

下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

本发明实施例1提供了一种抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的HCDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQID NO:13、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:30；所述重链可变区的HCDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25或SEQID NO:31；所述重链可变区的HCDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:32；所述轻链可变区的LCDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:27或SEQ IDNO:33；所述轻链可变区的LCDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:17或SEQ ID NO:28；所述轻链可变区的LCDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:34。

实施例2

本发明实施例2通过用LAP抗原免疫小鼠，优化免疫方法，创建噬菌体展示库，获得了一种抗LAP单克隆抗体，筛选得到的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段选自以下任意一种：

实施例3

本发明实施例3在实施例2的基础上具体的提供了抗LAP单链抗体的筛选方法如下：步骤一：LAP抗原免疫小鼠

1、实验动物：

种属品系：BALB/c，雌性，小鼠；体重：18-20g；

实验动物提供商：北京华阜康生物科技股份有限公司。

2、免疫：对小鼠进行免疫，免疫抗原为人LAP(南京金斯瑞生物科技有限公司合成基因，本公司构建载体并表达纯化)。

步骤二：噬菌体抗体库的构建

取效价较高的小鼠脾细胞，利用Trizol试剂(购买自Ambion，货号：15596026)，提取小鼠脾细胞中的总RNA，RT-PCR获得cDNA，以cDNA为模板，采用简并引物(所用简并引物参考文献：Journal of Immunological Methods233(2000)167-177)进行PCR扩增，从而获得免疫小鼠抗体重链可变区基因库(VH)及轻链可变区基因库(VL)，轻重链分别双酶切，连接至同样分步骤酶切处理过的载体上，构建pScFv-Disb-HS-VH-VL基因库，PscFv-DisB-HS载体是采用一系列基因克隆的方法对载体pComb3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名pScFv-Disb-HS载体，获得其质粒图谱如图1所示，并以此载体为基础，构建小鼠免疫噬菌体抗体库。

步骤三：以LAP为抗原包被免疫管，抗原包被量为4μg/500μl/管，4℃包被过夜，再用4％脱脂奶粉/PBST分别封闭免疫管和免疫噬菌体抗体库，室温封闭1h。封闭后的免疫噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，噬菌体投入量约为10⁹～10¹²个，室温反应1h后，使用PBST-PBS洗去未结合的噬菌体，通过0.1MpH2.2的Glycine-HCl洗脱，最后使用1.5MpH 8.8的Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至pH7.0左右。

步骤四：将上述中和后的噬菌体感染10ml生长至对数期的TG1菌液，37℃培养箱中静置30min，取出部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG平板上，用于计算噬菌体产出量。剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，吸出后涂布于2YTAG大平板，为下一轮筛选做准备。

步骤五：将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下，接菌至2YTAG液体培养基，摇至对数期后加入M13KO7辅助噬菌体超感染，在28℃条件下，220rpm培养过夜制备噬菌体，PEG/NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选，共进行一轮噬菌体库富集筛选。

步骤六：LAP噬菌体单链抗体阳性克隆的筛选：经过一轮筛选后，挑取分隔良好的单克隆菌落，接种于加有2YTAG液体培养基的96孔深孔板，在37℃条件下，220rpm的条件下培养至其对数生长期，每孔加入约10¹⁰的辅助噬菌体M13KO7，在37℃的温度条件下静止感染30min。4000rpm，离心15min，弃去上清，菌体用2YTAK重悬沉淀，在28℃且220rpm的条件下培养过夜。4000rpm，4℃的条件下离心15min后，吸取扩增后的噬菌体上清进行ELISA鉴定，最终筛选得到六个亲和力较高的抗LAP的单克隆抗体分子，分别命名为A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6，将上述得到的单克隆抗体进行基因测序确定为正确的抗体序列，经过测序，上述筛选到的6个单克隆抗体序列如下：

具体的，SEQ ID No:35(A-1的重链可变区的氨基酸序列)；

EVQLEQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTSYGMNWVKQAPGKALKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAYSLEATANTAYLQIYNLKNEDTATYFCARSGRYTRPLYYIMDFWGQGTSVTVSS；

SEQ ID No:36(A-1的轻链可变区的氨基酸序列)；

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGNSYMNWHQQKPGQPPKLLIYGASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK；

SEQ ID No:37(A-2的重链可变区的氨基酸序列)；

EVQLEESGAELVRSGASVKLSCTASGFNFNDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQVKATMTADTSSNTAYLHLSSLASEDTAVYYCNTPTEDMDYWGQGTSVTVSS；

SEQ ID No:38(A-2的轻链可变区的氨基酸序列)；

DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLFNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRGSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLLTFGAGTKLELK；

SEQ ID No:39(A-3的重链可变区的氨基酸序列)；

EVKLQESGAELVMPGASVKMSCKASGYTFTDYWMHWVKQRPGQGLEWIGAIDTSDSYTSYNQKFKGKATLTVDESSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARKALSGYFDVWGAGTTVTVSS；

SEQ ID No:40(A-3的轻链可变区的氨基酸序列)；

DIVLTQTPSSLSASLGGKVTITCKASQDIYKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLRTFGGGTKLEIK；

SEQ ID No:41(A-4的重链可变区的氨基酸序列)；

EVKLQESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTTYGVSWVRQPPGKGLEWLGIIWGDGTTIYQSGLISRLSISKDDSKSQVFLKLSSLQTDDTATYYCAKHYFVMDYWGQGTSVTVSS；

SEQ ID No:42(A-4的轻链可变区的氨基酸序列)；

DIVLTQSPSSLAVSAGEKVTMNCKSSQSLLNSRIRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLWTFGGGTKLEIK；

SEQ ID No:43(A-5的重链可变区的氨基酸序列)；

EVQLQQSGAVLVRPGDSVKLSCKASGYSFTRSWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLRSPTSEDSAVYYCTNYYLYYFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVY；

SEQ ID No:44(A-5的轻链可变区的氨基酸序列)；

DIVLTQSPSSLAVSTGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKSYLAWYQQKPGQSPKLLIYWTSIRESGVPDRFTGNGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLFTFGGGTKLEMKRADAAPTVS；

SEQ ID No:45(A-6的重链可变区的氨基酸序列)；

QVKLQESGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKSLEWIGYFYPYNGGTGYKQKFKSKATLTVDNSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARNHYYYYAMDYWGQGTSVTVSS；

SEQ ID No:46(A-6的轻链可变区的氨基酸序列)；

DIVMTQTPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLPWTFGGGTKLEIK。

实施例4梯度稀释ELISA比较抗LAP噬菌体单克隆抗体的亲和力

用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被LAP，50ng/孔/100μl，在4℃温度条件下包被过夜，使用PBST洗涤三次，将实施例3中筛选得到的6个噬菌体单克隆抗体和阳性对照抗LAP单克隆抗体28G11(该抗体选自专利申请号为US20190144549A1，专利名称为抗搭接抗体及其用途的专利中)，上述单克隆抗体分别用PBST三倍梯度稀释，每孔加入100μl稀释后的样品，在室温下静置1小时。用PBST洗涤ELISA板，将PBST稀释后的HRP-anti-M13单克隆抗体加入ELISA板中，在室温放置1h。TMB显色试剂盒显色，室温显色10分钟，用2M H₂SO₄终止后，在450nm/630nm下读数，采用GraphPad Prism 5.0作图软件做出抗原抗体结合曲线图，如图2所示，并计算对应的EC50值，具体数据如下：

通过上述数据及如图2所示，实施例2筛选出的6个不同的单克隆抗体分子均能够与LAP进行结合，其亲和力与抗LAP单克隆抗体28G11接近，但抗LAP单克隆抗体A-1的亲和力高于阳性对照抗LAP单克隆抗体28G11。

实施例5

本发明实施例5在实施例3基础上进一步限定了抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段还包括重链恒定区，所述重链恒定区为鼠的IgG1、IgG2a、IgG3、IgG4型中的一种；

优选的，所述重链恒定区为鼠的IgG2a型；鼠的IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:47所示；具体序列如下：

SEQ ID No:47(鼠的IgG2a型的重链恒定区序列)

AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK。

选择实施例4中抗LAP单克隆抗体进行全抗制备，抗体制备方法具体如下：

1、将实施例3中筛选出来的6个抗LAP单克隆抗体和阳性对照抗LAP单克隆抗体28G11的重链VH和轻链VL的编码基因分别克隆至装有重链和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，重链恒定区优选为鼠的IgG2a型恒定区(氨基酸序列如SEQ ID No:47所示)，轻链恒定区均为鼠源C_k链(氨基酸序列如SEQ ID No:48所示)，pTSE载体结构如图3所示(pTSE载体制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段)。

SEQ ID No:48(鼠源C_k链的轻链恒定区)

ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC；

2、瞬时转染HEK293E细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所，货号为GNHu43)，进行抗体表达，细胞摇床培养3-4天，收集细胞上清，用proteinA柱进行纯化，即得到纯化后的全抗体。

实施例6抗LAP单克隆抗体与抗原LAP的结合实验

用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被LAP-TGFβ1抗原，50ng/孔/100μl，在4℃的温度条件下过夜包被；用300μl/孔PBST洗涤五次，加入100μl含有2％BSA-PBST封闭液，在37℃温度条件下封闭2小时；弃去板中液体，用PBST洗涤三次，在纸巾上拍干检测板；加入不同稀释浓度的抗LAP单克隆抗体A-1，A-2，A-3，A-4，A-5和A-6抗体及阳性对照抗体28G11，抗体的起始最高浓度均为10μg/ml，分别经过5倍浓度梯度稀释后，每种抗体均设置7个浓度梯度，在37℃温度条件下孵育1h；弃去板中液体，用300μl/孔PBST洗涤三次，在纸巾上拍干检测板；用封闭液稀释二抗(HRP-anti mIg,1:2000)，加入ELISA检测板，每孔100μl，室温避光放置1小时；弃去板中液体，用PBST洗涤三次，在纸巾上拍干检测板；加入预制的ABTS底物液(购买自Thermo，货号002024)显色，每孔100μl，室温显色10-30min，然后用2MH₂SO₄终止显色。在450nm/630nm下读数，采用GraphPad Prism 5.0作图软件做出抗原抗体结合曲线图，如图4所示，并计算对应的EC50值，具体数据如下：

通过上述数据和图4得知，筛选出的6个不同的单克隆抗体均能与LAP进行结合，此外，这6个抗体分子中抗LAP单克隆抗体A-1的EC50值最小，且小于阳性对照抗体28G11，说明其与LAP结合能力最好。

实施例7抗LAP单克隆抗体与抗原LAP的竞争实验

用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被LAP-TGFβ1抗原，50ng/孔/100μl，在4℃的温度条件下过夜包被；用300μl/孔PBST洗涤五次，加入100μl含有2％BSA-PBST封闭液，在37℃温度条件下封闭2小时；弃去板中液体，用PBST洗涤三次，在纸巾上拍干检测板；加入50μl使用Sulfo-NHS-LC-Biotin试剂(购自thermo，货号1854210)标记上生物素的28G11，加入不同稀释浓度的抗LAP单克隆抗体A-1，A-2，A-3，A-4，A-5和A-6抗体及阳性对照抗体28G11；生物素标记的28G11在体系中浓度为1μg/ml，七种抗体的起始最高浓度均为10μg/ml，分别经过5倍浓度梯度稀释后，每种抗体均设置7个浓度梯度，在37℃温度条件下孵育1h；弃去板中液体，用300μl/孔PBST洗涤三次，在纸巾上拍干检测板；用封闭液稀释二抗(HRP-anti mIg,1:2000)，加入ELISA检测板，每孔100μl，室温避光放置1小时；弃去板中液体，用PBST洗涤三次，在纸巾上拍干检测板；加入预制的ABTS底物液(购买自Thermo，货号002024)显色，每孔100μl，室温显色10-30min，然后用2MH₂SO₄终止显色。在450nm/630nm下读数，采用GraphPadPrism 5.0作图软件做出抗体竞争曲线图，如图5所示，并计算对应的IC50值，具体数据如下：

通过上述数据和图5得知，6个不同的单克隆抗体均能与28G11进行竞争。其中抗LAP单克隆抗体A-1、A-2、A-5的竞争抑制率与28G11非常接近，且IC50值低于28G11，说明它们能有效的阻碍28G11与抗原的结合，从而推论出它们的抗原结合位点可能与28G11的抗原结合位点相邻、重叠、甚至相同。

实施例8抗LAP单克隆抗体与表面表达LAP的细胞的结合实验

将过表达LAP-TGFβ1的CHO细胞按2x 10⁵个细胞/孔接种至96孔板。设置抗LAP单克隆抗体A-1、A-2、A-5和阳性对照抗体28G11的起始浓度均为200μg/ml，5倍梯度稀释，共8个梯度，每孔100μl加入细胞孵育一小时，然后加入FITC标记的羊抗鼠的荧光抗体(购买自southernbiotech，货号：1030-02)进行流式分析检测，并采用GraphPad Prism 5.0作图软件做出细胞的结合曲线，结果如图6所示。

结果表明，上述抗LAP单克隆抗体A-1、A-2、A-5和阳性对照抗体28G11都能与表面表达LAP的细胞结合，其中A-1抗体和阳性对照抗体28G11与自然状态下的LAP蛋白结合能力最强。

实施例9

本发明实施例9还提供了一种多核苷酸分子，多核苷酸分子编码的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段。

本发明还提供了一种重组DNA表达载体，重组DNA表达载体包含的多核苷酸分子。

本发明还提供了一种转染的重组DNA表达载体的宿主细胞，宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；

优选的，宿主细胞为哺乳动物细胞，哺乳动物细胞为HEK293细胞、CHO细胞或NS0细胞。

本发明还提供了一种药物，药物包含的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段。

本发明还提供了的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗癌症、纤维化疾病或自身免疫疾病药物中的应用；优选的，癌症选自：非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤或神经胶质瘤；纤维化疾病包括肺纤维化或肝纤维化；自身免疫疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症、皮肌炎、多肌炎、血管炎或干燥症。

本发明还提供了的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段和抗PD-1单克隆抗体联合用于制备治疗癌症药物中的应用；抗PD-1单克隆抗体选自Nivolumab、Pembrolizumab、特瑞普利单抗、信迪利单抗、替雷利珠单抗、卡瑞利珠单抗或专利号为ZL201510312910.8，专利名称为一种抗PD-1的单克隆抗体及其获得方法的专利文件中公开的DFPD1-9、DFPD1-10、DFPD1-11、DFPD1-12或DFPD1-13，这里不仅限于上述对抗PD-1单克隆抗体的限定，还可以为其他商业化用于实验中的抗PD-1单克隆抗体，只要靶点为PD-1的单克隆抗体均可以，在此不具体限定其他的抗PD-1单克隆抗体。

本发明中，抗PD-1单克隆抗体优选为专利号为ZL201510312910.8，专利名称为一种抗PD-1的单克隆抗体及其获得方法的专利文件中公开的DFPD1-9、DFPD1-10、DFPD1-11、DFPD1-12或DFPD1-13。优选的，癌症选自：非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤或神经胶质瘤。

实施例10纯化的全抗形式功能抗体抑制细胞表面TGFβ1的释放

提前一天接种过表达LAP-TGFβ1的细胞株50μl(1x 10⁶个细胞/ml)于96孔板中，并加入一系列浓度梯度稀释的抗LAP单克隆抗体A-1、A-2、A-5和阳性对照抗体28G11全抗药物50μl孵育过夜，起始浓度均为20μg/ml，然后3倍浓度梯度稀释，每种抗体均设置共7个浓度梯度。第二天加入50μl(1x 10⁶个细胞/ml)的稳定表达PAI-LUC的Mv.1.lu水貂肺上皮细胞(购买自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，货号：3111C0001CCC000195)，细胞培养箱孵育6小时后测试荧光素酶活性，并采用GraphPad Prism 5.0作图软件做出抗体抑制TGFβ1的释放的抑制曲线，如图7所示，并计算对应的IC50值，具体数据如下：

结果表明，A-1和A-5两个抗体都能有效抑制细胞表面TGFβ1的释放，尤其是A-1抗体，其IC50值与阳性对照抗体28G11接近，且在同等浓度下对TGFβ1释放的抑制都略高于阳性对照抗体28G11。

实施例11体内单独给药抑瘤实验

1、实验动物：

种属品系：BALB/c，雌性，小鼠；周龄：6-8周；

实验动物提供商：北京华阜康生物科技股份有限公司。

2、实验方法：

每只小鼠右侧背部皮下接种3*10⁵个CT26肿瘤细胞(购买自ATCC；货号：CRL-2638)，成瘤后动物随机分若干组，每组10只，3天后进行腹腔注射本发明中提供的抗LAP单克隆抗体A-1(10mg/kg)，同时设置阳性对照度注射等量的阳性对照抗体28G11对照组(10mg/kg)，阴性对照组注射等量的同型IgG(10mg/kg)，每周给药两次，每周测三次瘤体积并一周测一次体重，观察记录瘤生长情况，瘤体积超过3000mm³，断颈法处死小鼠，用手术剪镊小心分离出各个肿瘤，称重，结果见图8所示。

通过图8可见，注射实验组的肿瘤体积与阳性对照组的肿瘤体积相当，都小于阴性对照组的肿瘤体积。但由于同组小鼠间肿瘤体积相差较大使得每组的标准偏差都较大，因而抗LAP单克隆抗体A-1及28G11的药效都不显著。考虑到本项目的一个目标是提高肿瘤免疫响应，下一步验证联合PD-1给药进行抑瘤实验。

实施例12体内联合给药抑瘤实验

1、实验动物：

种属品系：BALB/c，雌性，小鼠；周龄：6-8周；

实验动物提供商：北京华阜康生物科技股份有限公司。

2、设置不同给药组，具体如下：

抗鼠PD-1单克隆抗体(购买自Bio X Cell，货号BE0146)单独给药组、抗LAP单克隆抗体A-1单独给药组(10mg/kg)、抗LAP单克隆抗体A-1联合抗鼠PD-1抗体给药组(10mg/kg)和同型IgG对照组(10mg/kg)；

实验方法与实施例11方法相同，每只小鼠右侧背部皮下接种3*10⁵个CT26肿瘤细胞，成瘤后动物随机分若干组，每组10只，3天后进行腹腔注射上述给药组，每周给药两次，每周测三次瘤体积并一周测一次体重，观察记录瘤生长情况，瘤体积超过3000mm³，断颈法处死小鼠，用手术剪镊小心分离出各个肿瘤，称重。结果见图9和图10。

通过图9可见，PD-1抗体组和对照组相比，基本没有体现出抑瘤效果，这和文献中结肠癌对PD-1抗体不敏感是一致的。联合用药组与PD-1抗体组相比体现出了显著的抑瘤效果；与抗体A-1单独给药组相比也体现出了一定的抑瘤效果。通过图10可见，从生存曲线上看，联合用药组与PD-1抗体组或A-1抗体单独给药组相比都体现出了显著的抑瘤效果。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京东方百泰生物科技股份有限公司

<120> 一种抗LAP单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用

<160> 48

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro

1 5

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

Ala Arg Ser Gly Arg Tyr Thr Arg Pro Leu Tyr Tyr Ile Met Asp Phe

1 5 10 15

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asn Ser Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

Gly Ala Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 6

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 7

Gly Phe Asn Phe Asn Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 8

Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr

1 5

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 9

Cys Asn Thr Pro Thr Glu Asp Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 10

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Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Leu Thr

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Ala Lys His Tyr Phe Val Met Asp Tyr

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Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

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Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

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Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

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Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

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65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

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Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala

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Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Asp Tyr

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Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

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65 70 75 80

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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

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65 70 75 80

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65 70 75 80

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Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

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<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

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<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 46

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

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Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

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Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

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Lys

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<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 47

Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly

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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

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Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

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Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln

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His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn

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210 215 220

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<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 48

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

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Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

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Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

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