具体实施方式

下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不局限于这些实施例。

实施例1鼠单抗的制备

1.动物免疫

以NGAL蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：1，优化后的密码子序列如SEQ ID NO：2所示)按照一般免疫程序免疫BALB/c雌性小鼠(购自常州卡文斯实验动物有限公司)。具体免疫情况参见《抗体制备与使用实验指南》。采用间接ELISA法跟踪免疫小鼠血清滴度，选取血清效价最高的免疫小鼠，进行小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合实验。

2.细胞融合

(1).脾脏细胞的制备

将免疫小鼠，摘眼球取血，经断颈椎处死后置于75％(v/v)的酒精中浸泡10分钟，于无菌操作台中取出其脾脏，置于细胞筛网中，充分研磨细胞，过筛网，用无菌1640培养基(购自Gibco公司)离心洗涤数次后，重悬细胞以制成单细胞悬液，并计数，备用。

(2).饲养细胞的制备

取8～10周龄的雌性BALB/c小鼠一只，摘眼球获取阴性血清，经断颈椎处死后置75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌揭开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器将约10mL 1640HT培养基(购自SIGMA公司)注入小鼠腹腔，轻轻按摩腹部并吹打数次。吸取含有巨噬细胞的培养基注入20％1640HAT培养基中备用；

取2～3周龄的雌性BALB/c小鼠一只，经断颈椎处死后置于75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌取胸腺于细胞筛网中，研磨，过筛网，获得胸腺细胞置于上述含有巨噬细胞的20％1640HAT培养基中，备用。

(3).细胞融合

选择处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0，收集并计数。取约10⁸个上述脾细胞与2×10⁷个上述SP2/0细胞株加入融合管中混合，1000rpm离心10分钟后弃上清(尽量弃净)，将融合管置手掌上来回轻轻摩擦以使沉淀松散。60秒内先慢后快地加入1mL预热的PEG1450(聚乙二醇1450，购自SIGMA公司)，加入1640HT培养基30mL终止，1000rpm离心10分钟，去上清，轻轻摩擦使沉淀松散，加入步骤2所获得的20％的1640HAT培养基中。

将上述HAT培养基充分混匀后，以200μL/孔分装至96孔细胞培养板中，置37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。一周后用10％1640HT培养基替换20％1640HAT培养基，3天后取上清进行检测。

3.抗人NGAL特异性杂交瘤株筛选

(1).检测板的准备：用CB包被液稀释重组人NGAL蛋白至1μg/mL，包被96孔ELISA酶标板，100μL/孔，2～8℃包被过夜，洗涤一次拍干；含2％牛血清白蛋白的PBST缓冲液封闭(200ul/孔)，37℃封闭2小时；拍干，备用。

(2).阳性克隆的筛选：将待检细胞培养上清100μL/孔加入上述检测板中，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μL/孔的HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μL/孔的TMB显色液，于37℃避光显色15分钟，每孔加入50μL的2M H₂SO₄终止反应，并于OD450处读取数值。阳性孔确定原则：OD450值/阴性对照值≥2.1。选取阳性克隆株进行细胞克隆化筛选。经过三至四轮的克隆化筛选后，单克隆细胞株阳性率100％即确定为稳定细胞株，对细胞株进行定株。杂交瘤细胞株NGAL08、NGAL19、NGAL20及NGAL37均具有较高的效价，遂后续进一步对上述杂交瘤细胞株进行抗体可变区序列测序分析。

实施例3.单链抗体重组表达及纯化

根据实施例2中测序结果，将杂交瘤细胞株NG08、NG19、NG20及NG37的抗体重链及轻链可变区之间加入连接肽(GGGGS)3，引入六个组氨酸，并将其全基因直接融合并用毕赤酵母表达系统进行单链抗体的重组表达。所表达得到的单链抗体分别命名为NG08、NG19、NG20及NG37。上述单链抗体的重组表达具体如下：

a)单链抗体基因表达载体构建

单链抗体NG08的基因序列如SEQ ID NO:12所示、氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；单链抗体NG19的基因序列如SEQ ID NO:22所示、氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；单链抗体NG20的基因序列如SEQ ID NO:32所示、氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示；单链抗体NG37的基因序列如SEQ ID NO:42所示、氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示。将单链抗体NG08、NG19、NG20及NG37基因片段上游引入XhoI酶切位点以及pPICZαA载体中XhoI序列，下游引入组氨酸标签和XbaI酶切位点，进行全基因合成并构建到pUC57质粒(购自南京金斯瑞生物科技有限公司)中，得到一种长期保存质粒，质粒记为pUC57-NG08-scFv、pUC57-NG19-scFv、pUC57-NG20-scFv、pUC57-NG37-scFv。进行PCR扩增，其中

上游引物P1为TGT AAA ACG ACG GCC AGT；

下游引物P2为:CAG GAA ACA GCT ATG AC。

常规PCR程序后，琼脂糖凝胶电泳分析，显示产物大小与预期大小一致。

分别将PCR获得基因产物回收纯化后，采用XhoI(#R0146S,购自New EnglandBiolabs公司)和XbaI(#R0145V,购自New England Biolabs公司)双酶切，用T4连接酶连接到pPICZαA(V19520，购自Invitrogen)质粒中，转化到DH5α感受态细胞中，在含有Zeocin(R250-01，购自Invitrogen公司)的LB平板中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到单链抗体表达载体，记为pPICZα-NG08-scFv、pPICZα-NG19-scFv、pPICZα-NG20-scFv、pPICZα-NG37-scFv。

b)单链抗体基因在毕赤酵母宿主工程菌株的构建、筛选及表达

YPDS固体培养基配制：参照Invitrogen公司EasySelect Pichia Expression Kit说明书；毕赤酵母感受态细胞：参照EasySelect Pichia Expression Kit说明书；BMGY培养基配制：参照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit说明书；BMMY培养基配制：参照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit说明书。

分别将pPICZα-NG08-scFv、pPICZα-NG19-scFv、pPICZα-NG20-scFv、pPICZα-NG37-scFv质粒，用SacI限制性内切酶酶切线性化。乙醇沉淀后将线性化载体，电转化进入到X-33感受态酵母细胞，涂布到含有Zeocin的YPDS固体培养基，30℃培养3-5天，就有阳性克隆产生。

将上述获得的重组单链抗体基因工程菌株接种于BMGY培养基中，30℃，220rpm培养至菌体密度到OD₆₀₀＝2.0～6.0，每隔24小时补加甲醇至终浓度为1.0％(v/v)。一周后，收集发酵培养液。

c)单链抗体纯化

采用组氨酸标签亲和柱纯化单链抗体NG08、NG19、NG20及NG37，预装柱子选择为HisTrap HP，具体步骤如下：

(1)发酵液的除杂预处理：将上述表达得到单链抗体NG08、NG19、NG20及NG37发酵液上清，离心收集上清，并加入结合缓冲液，使得上清终浓度为300mM NaCl，20mM NaH2PO4，10mM Imidazole，调pH7.5，0.45μm滤膜过滤。

(2)HisTrap HP亲和柱纯化：运用全自动智能蛋白纯化系统(AKTA avant150，购自GE healcare公司)对预处理获得的单链抗体NG08、NG19、NG20及NG37发酵液进行亲和纯化，柱子为HisTrap HP(17-5248-02,购自GE healcare公司)。结合缓冲液为300mM NaCl，20mMNaH₂PO₄，10mM Imidazole，pH7.5，洗脱缓冲液为300mM NaCl，20mM NaH₂PO₄，500mMImidazole，pH7.5。洗脱时进行线性洗脱，并收集各个洗脱峰。纯化后的蛋白纯度均达到95％以上；合并符合要求的收集管，更换缓冲液为PBS溶液并超滤浓缩(1mg/ml)，过滤除菌于-20℃保存备用。

实施例3检测试剂盒的制备及使用方法

本发明的检测试剂盒是液体双试剂，其中包括R1试剂、R2试剂和校准品，具体见下：

1、R1试剂：在缓冲液1中加入稳定剂(例如：NaCl)、增凝剂(例如：PEG10000)、保护剂(例如：BSA)、防腐剂(例如：Proclin 300)、表面活性剂(例如：Tritonx100)，搅拌混匀，即为R1试剂。

2、R2试剂：将4种重组抗人NGAL单克隆抗体等质量混合物用磷酸盐缓冲液将抗体稀释至1.0mg/mL，制备成抗体稀释液；用乙磺酸缓冲液将胶乳微球(聚苯乙烯胶乳，购自日本JSR公司，粒径220nm)稀释至1％(质量浓度)，再加入0.04(EDC/胶乳微球的质量比)的活化剂EDC，在30℃下搅拌反应30min，反应结束后通过离心去除未反应的EDC，然后加入0.05抗体/胶乳微球的质量比)重组抗人NGAL单克隆抗体混合物稀释液，在37℃下搅拌反应60min，反应结束后通过离心去除未反应的抗体，再加入终止反应液终止反应，离心，最后加入由缓冲液2、防腐剂(例如：Proclin300)、稳定剂(例如：NaCl，蔗糖)、保护剂(例如：BSA、Tween20)组成的缓冲液搅拌混匀，即为R2试剂(其中标记有NGAL抗体的胶乳微球质量浓度为0.125～0.33％)。

3、校准品：将NGAL标准品分别加入由缓冲液3、保护剂(例如：BSA)稳定剂(例如：NaCl)、防腐剂(例如：Proclin 300)组成的缓冲液中，制备得到终浓度为4524、2162、1075、237、0ng/mL的一组校准品。

优选地，为了提高试剂盒的准确度，制备了不同的R1、R2、校准品试剂进行准确度(回收率)、分析灵敏度的性能检测和比对，具体评价结果见下表1。选择本发明的各种缓冲液、稳定剂、保护剂、防腐剂、螯合剂等制备的试剂盒有更好的检测性能。

分析灵敏度：以已知中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(或简称NGAL)含量为(100～300)ng/mL的样本作为检测样本，重复测定3次，记录试剂盒在规定参数下的吸光度差值。换算为200ng/mL NGAL所引起的吸光度差值。

准确度(添加回收)：选择合适浓度的人血清样本(简称：常规样本)中加入一定体积的校准品(NGAL理论浓度为C_理论)制作成回收样本，在常规样本中加入相同体积的去离子水制作成基础样本，其中加入的校准品量不超过总体积的1/10，每个回收样本和基础样本检测3次，测定平均浓度对应为C₁和C₀。根据计算公式：回收率＝(C₁-C₀)/C_理论*100％计算出各自的回收率。

表1试剂盒的制备比对结果

实施例4检测试剂盒的性能测试

对照试剂盒：试剂R2中所使用的重组抗体替换为A厂家商品化兔抗人NGAL多克隆抗体，其他试剂及实验方案均同实施例3制备例；

本发明试剂盒：具体见实施例3制备例制备的NGAL检测试剂盒；

商品化试剂盒：购买于知名C公司的临床用NGAL胶乳增强比浊试剂盒；

对上述试剂盒关键性能进行比较。

1、线性范围

采用贝克曼全自动生化分析仪AU480测定4个不同浓度的NGAL标准品在540～600nm处的吸光度，绘制校准品的工作曲线(见图1)。结果可以看出，本发明试剂盒的检测范围较对照试剂盒具有更宽的线性范围，更加有利于高浓度的病理样本直接检测，而不需要进行样本的稀释，操作简易化。此外，线性关系也比商品化试剂盒的更好。

因对照试剂盒的线性范围均无法满足临床应用需求，遂未对其进行进一步研究。下述性能评价仅针对本发明试剂盒及商品化试剂盒展开。

2、精密度

重复性：用本发明试剂盒检测NGAL浓度为100～200ng/mL、400～600ng/mL的临床血清样本，重复测试10次，分别计算变异系数(CV)。检测结果可见，本发明试剂盒和商品化试剂盒的重复性完全达到CV≤10％，但本发明试剂盒CV值更低，表明均一性优于商品化试剂盒(见表2)。

批间差：分别用四个不同批号的本发明的检测试剂，NGAL浓度为100～200ng/mL、400～600ng/mL的临床血清样本，每个批号至少重复测试3次，计算试剂(盒)批间差R。商品化试剂盒标注的10％，检测结果表明本发明试剂盒批间差异较小，工艺稳定。

3、准确度

添加回收：选择合适浓度的人血清样本(简称：常规样本)中加入一定体积的校准品(NGAL理论浓度为C_理论)制作成回收样本，在常规样本中加入相同体积的去离子水制作成基础样本，其中加入的校准品量不超过总体积的1/10，每个回收样本和基础样本检测3次，测定平均浓度对应为C₁和C₀。根据计算公式：回收率＝(C₁-C₀)/C_理论*100％计算出各自的回收率。结果表明本发明试剂盒的回收率均能满足90％-110％的要求，而商品化试剂盒的准确度(高浓度样本)超过110％，显示本发明试剂盒具有更好的的特异性和准确度(见表2)。

表2准确度和精密度性能评价结果

实施例5检测试剂盒的适用性

本发明的检测试剂盒应用于全自动生化仪，但不局限于此，其中主要参数设置及检测方法如下(举例贝克曼全自动生化分析仪AU5800)：

检测波长：主波长540～600nm，副波长无；检测温度：37℃；

检测方法：取180μL试剂R1与1.5μL样本混匀，孵育5min后，加入45μL试剂R2，立即读取吸光度A1，孵育5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化△A＝A2-A1。使用多点非线性校准，绘制校准品的工作曲线，样品中NGAL含量可根据△A变化值在工作曲线上计算获得。

本发明试剂盒在贝克曼AU5800生化分析仪上进行精密度、准确度等性能评价(具体见实施例4，其中准确度采用相对偏差法)，结果见表3。结果显示本发明试剂盒精密度和准确度满足要求，表明本发明试剂盒也可以应用于贝克曼生化分析仪其他机型，具有较广的适用性。

表3本发明试剂盒在AU5800上的性能

序列表

<110> 江苏众红生物工程创药研究院有限公司

<120> 一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒及其临床应用

<130> 一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒及其临床应用

<160> 42

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 179

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys

1 5 10 15

Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp

20 25 30

Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp

35 40 45

Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser

50 55 60

Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Trp

65 70 75 80

Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly

85 90 95

Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val

100 105 110

Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Ser

115 120 125

Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu

130 135 140

Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu

145 150 155 160

Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys

165 170 175

Ile Asp Gly

<210> 2

<211> 543

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atgcaggata gcacctctga cctgattccg gcaccgccgc tgagcaaagt gccgctgcag 60

caaaactttc aagataatca gttccaaggc aaatggtatg tggttggcct ggcgggtaac 120

gccattctgc gtgaagataa agacccgcag aaaatgtatg ctaccatcta cgaactgaaa 180

gaagataaat catacaacgt tacgtcggtc ctgtttcgta agaaaaaatg cgactactgg 240

attcgcacct ttgttccggg ctgtcagccg ggtgaattta cgctgggcaa catcaaaagc 300

tatccgggtc tgacctctta cctggtccgt gtcgtgagta cgaactacaa tcagcatgcg 360

atggtgtttt tcaagaaagt gagccagaat cgtgaatatt tcaaaatcac cctgtacggt 420

cgcaccaaag aactgacgag cgaactgaaa gaaaacttca tccgcttcag taaatccctg 480

ggcctgccgg aaaatcatat cgtgtttccg gttccgattg atcagtgcat cgacggttaa 540

tga 543

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Ile Asn Thr Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Tyr

1 5

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Ala Arg Trp Ala Ile Tyr Tyr Gly Asn Phe Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10 15

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Ser Ser Val Ser Tyr

1 5

<210> 7

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

Asn Thr Ser

1

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 9

<211> 123

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser

1 5 10 15

Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Thr Leu Glu

35 40 45

Trp Met Gly Tyr Ile Asn Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Trp Ala Ile Tyr Tyr Gly Asn Phe Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 106

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Asn Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 244

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 11

Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser

1 5 10 15

Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Thr Leu Glu

35 40 45

Trp Met Gly Tyr Ile Asn Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Trp Ala Ile Tyr Tyr Gly Asn Phe Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln

130 135 140

Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr

145 150 155 160

Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys

165 170 175

Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Asn Thr Ser Asn Leu Pro

180 185 190

Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr

195 200 205

Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr

210 215 220

Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys

225 230 235 240

Leu Glu Ile Lys

<210> 12

<211> 735

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 12

tctgatgtgc agcttcagga gtcaggacct gacctggtga aaccttctca gtcactttca 60

ctcacctgca ctgtcactgg ctactccatc accagtggtt attactggca ctggatccgg 120

cagtttccag gaaacacact ggaatggatg ggctatataa ataccagtgg tagcactaac 180

tacaacccat ctctcaaaag tcgaatctct atcactcgag acacatccaa gaaccagttc 240

ttcctgcagt tgaattctgt gactactgag gacacagcca catattactg tgcaagatgg 300

gctatctact atggtaactt ctggtacttc gatgtctggg gcgcagggac cacggtcacc 360

gtctcctcag gtggtggtgg atccggaggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctcaaatt 420

gttctcaccc agtctccagc aatcatgtct gcatctccag gggagaaggt caccataacc 480

tgcagtgcca gctcaagtgt aagttacata cactggttcc agcagaagcc aggcacttct 540

cccaaactct ggatttataa cacatccaac ctgccttctg gagtccctgc tcgcttcagt 600

ggcagtggat ctgggacctc ttactctctc acaatcagcc gaatggaggc tgaagatgct 660

gccacttatt actgccagca aaggagtagt tacccattca cgttcggctc ggggacaaag 720

ttggaaataa aataa 735

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 13

Asp Ser Glu Val Phe Pro Ile Ala Tyr

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

Ile Leu Pro Ser Ile Gly Arg Thr

1 5

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 15

Ala Arg Ser Arg Tyr Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 16

<211> 6

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 16

Gln Asp Val Ala Thr Ala

1 5

<210> 17

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 17

Trp Ala Ser

1

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 18

His Gln Tyr Ser Phe Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 19

<211> 118

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 19

Asn Ser Ile Met Ala Trp Val Trp Asn Leu Leu Ile Pro Gly Ser Ser

1 5 10 15

Val Lys Leu Ser Cys Lys Asp Phe Asp Ser Glu Val Phe Pro Ile Ala

20 25 30

Tyr Ile Ser Trp Ile Arg Gln Lys Pro Gly His Gly Phe Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Leu Pro Ser Ile Gly Arg Thr Asn Tyr Gly Glu Lys Phe

50 55 60

Glu Asp Lys Ala Thr Leu Asp Ala Asp Thr Val Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Arg Tyr Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 20

<211> 108

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 20

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ala Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys His Gln Tyr Ser Phe Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 21

<211> 240

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 21

Asn Ser Ile Met Ala Trp Val Trp Asn Leu Leu Ile Pro Gly Ser Ser

1 5 10 15

Val Lys Leu Ser Cys Lys Asp Phe Asp Ser Glu Val Phe Pro Ile Ala

20 25 30

Tyr Ile Ser Trp Ile Arg Gln Lys Pro Gly His Gly Phe Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Leu Pro Ser Ile Gly Arg Thr Asn Tyr Gly Glu Lys Phe

50 55 60

Glu Asp Lys Ala Thr Leu Asp Ala Asp Thr Val Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Arg Tyr Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met

130 135 140

Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln

145 150 155 160

Asp Val Ala Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser

165 170 175

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro

180 185 190

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Ser Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys His Gln Tyr

210 215 220

Ser Phe Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235 240

<210> 22

<211> 723

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 22

aattcgatta tggcttgggt gtggaacttg cttattcctg ggtcttcagt aaagctttca 60

tgcaaggatt ttgattcaga agtcttccct attgcttata taagttggat tagacagaag 120

cctggccatg gatttgaatg gattggagac atactcccaa gtattggtag aacaaactat 180

ggagagaagt ttgaggacaa ggccacactg gatgcagaca cagtgtccaa cacagcctac 240

ttggagctca acagtctgac atctgaagac tctgctattt actattgtgc aaggagcagg 300

tacgaggact actttgacta ctggggccaa ggctccactc tcacagtctc ctcaggtggt 360

ggtggatccg gaggtggtgg ttctggtggt ggtggttctg acattgtgat gacccagtct 420

cacaaattca tgtccacatc agttggagac agggtcagca tcacctgcaa ggccagtcag 480

gatgtggcta ctgctgttgc ctggtatcaa cagaagccag gtcaatctcc taaacttctg 540

atttactggg catccacccg gcacactgga gtccctgatc gcttcacagg cagtggatct 600

gggacagatt tcactctcac cattagcagt gtgcagtctg aagacttggc agattatttc 660

tgtcaccaat atagcttcta tccgtacacg ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa 720

taa 723

<210> 23

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 23

Gly Phe Asn Ile Lys Tyr Asn Tyr

1 5

<210> 24

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 24

Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr

1 5

<210> 25

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 25

Ala Arg Glu Gly Gly Arg Tyr Asp Gly Phe Ala Asn

1 5 10

<210> 26

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 26

Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 27

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 27

Trp Ala Ser

1

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 28

Gln Asn Asp Tyr Ser Phe Pro Phe Thr

1 5

<210> 29

<211> 119

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 29

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Leu Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Tyr Asn

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Asp Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Met Pro Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Arg Tyr Asp Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 30

<211> 113

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 30

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 31

<211> 247

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 31

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Leu Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Tyr Asn

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Asp Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Met Pro Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Arg Tyr Asp Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

130 135 140

Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser

145 150 155 160

Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr

165 170 175

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser

180 185 190

Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly

195 200 205

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala

210 215 220

Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser

225 230 235 240

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

245

<210> 32

<211> 744

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 32

gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagaa cttttgaagc caggggcctc agtcaagttg 60

tcctgcacag cttctggctt caacattaaa tacaactata tacactgggt gaaacagagg 120

cctgaacagg gcctggactg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa tactaaatat 180

gacccgaagt tccagggcaa ggccactatg ccagcagaca tatcctccaa cacagcctac 240

ctgcacctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagagagggg 300

gggaggtacg acggttttgc taactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcaggt 360

ggtggtggat ccggaggtgg tggttctggt ggtggtggtt ctgacattgt gatgacacag 420

tctccatcct ccctgactgt gacagcagga gagaaggtca ctatgagctg caagtccagt 480

cagagtctgt taaacagtgg aaatcaaaag aactacttga cctggtacca gcagaaacca 540

gggcagcctc ctaaattgtt gatctactgg gcatccacta gggaatctgg ggtccctgat 600

cgcttcacag gcagtggatc tggaacagat ttcactctca ccatcagcag tgtgcaggct 660

gaagacctgg cagtttatta ctgtcagaat gattatagtt ttccattcac gttcggctcg 720

gggacaaagt tggaaataaa ataa 744

<210> 33

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 33

Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly

1 5

<210> 34

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 34

Ile Trp Ser Asp Gly Ser Thr

1 5

<210> 35

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 35

Ala Arg His Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 36

<211> 6

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 36

Gln Ser Ile Ser Asp Tyr

1 5

<210> 37

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 37

Tyr Ala Ser

1

<210> 38

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 38

Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Trp Thr

1 5

<210> 39

<211> 116

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 39

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Val Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg His Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 40

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 40

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 41

<211> 238

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 41

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Val Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg His Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val

130 135 140

Thr Pro Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile

145 150 155 160

Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg

165 170 175

Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser

195 200 205

Val Glu Pro Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser

210 215 220

Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235

<210> 42

<211> 723

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 42

aattcgatta tggcttgggt gtggaacttg cttattcctg ggtcttcagt aaagctttca 60

tgcaaggatt ttgattcaga agtcttccct attgcttata taagttggat tagacagaag 120

cctggccatg gatttgaatg gattggagac atactcccaa gtattggtag aacaaactat 180

ggagagaagt ttgaggacaa ggccacactg gatgcagaca cagtgtccaa cacagcctac 240

ttggagctca acagtctgac atctgaagac tctgctattt actattgtgc aaggagcagg 300

tacgaggact actttgacta ctggggccaa ggctccactc tcacagtctc ctcaggtggt 360

ggtggatccg gaggtggtgg ttctggtggt ggtggttctg acattgtgat gacccagtct 420

cacaaattca tgtccacatc agttggagac agggtcagca tcacctgcaa ggccagtcag 480

gatgtggcta ctgctgttgc ctggtatcaa cagaagccag gtcaatctcc taaacttctg 540

atttactggg catccacccg gcacactgga gtccctgatc gcttcacagg cagtggatct 600

gggacagatt tcactctcac cattagcagt gtgcagtctg aagacttggc agattatttc 660

tgtcaccaat atagcttcta tccgtacacg ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa 720

taa 723