具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1.制备艰难梭菌GDH抗原

取艰难梭菌C.difficile-630菌株扩增培养后，采用DNA提取试剂盒(天根)提取DNA。以菌液全基因组为模板，通过PCR扩增GDH基因并将其与原核表达载体pET-30a相连，此表达载体命名为“pET-30a-GDH”。将重组表达质粒pET-30a-GDH转化感受态细胞，培养12～14h后，挑取阳性单菌，于LB(kana+)液体培养基2mL/管，37℃条件下180r摇速过夜摇菌，第二天，将菌液与LB冻存液1:1混匀，作为种子菌，-80℃储存备用。取种子菌500μl，复苏后进行扩大培养，摇菌约4h后，待其进入对数增长期，OD600约为0.6～0.8，加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG进行诱导，继续摇菌4h后，收集菌液。用超声裂解液(含有4M尿素)复悬沉淀，在冰浴条件下超声裂解菌体，超声后10000rpm离心，吸取上清液，用0.22μm滤器过滤，放置于4℃备用。将5mL规格Ni柱(预装柱)连接于于纯化仪通路上，并用25mL体积Bingdingbuffer平衡柱子，流速1mL/mL，同时将收集盘收集体积设置为2mL/tube。将超声后的上清液5mL从仪器上样孔上样，流速0.5mL/min，待样品流穿柱体后，分别用25mL的Washing buffer和Elution buffer进行洗涤、洗脱，收集洗脱液，经超滤管脱盐浓缩，测得浓度并分装储存于-80℃备用。

实施例2.制备生物素化标记的艰难梭菌GDH抗原

按照说明书，采用生物素化连接酶B0101A(GnenCopoia)对GDH抗原进行生物素化标记。生物素化的GDH抗原被命名为Biotin-GDH。将GDH抗原中加入BufferA/B和BirA连接酶，30℃孵育2h。采用ELISA方法检测生物素化效率。即将起始浓度为500ng/ml的Biotin-GDH按1：2倍比稀释，并包被ELISA板，随后采用SA-HRP孵育。以生物素化标准品作为对照，最终确定Biotin-GDH生物素化标记效率为75％。

实施例3.抗艰难梭菌GDH抗体制备

采用实施例1纯化的重组蛋白GDH作为抗原，免疫Balb/c雌性小鼠。重组蛋白与弗氏佐剂等体积(1mL：1mL)混合，用注射器法充分乳化，腹部多点注射法免疫小鼠，免疫剂量为60μg/只。二免、三免分别用弗氏不完全佐剂与重组蛋白GDH等体积混合，腹部多点注射法免疫小鼠，免疫剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天取小鼠血清检测效价,效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫,抗原用生理盐水混匀,剂量为50μg/只。取免疫后的Balb/c小鼠脾细胞，使用PEG法将其与骨髓瘤Sp2/0细胞株融合，将融合后的细胞用20％FBS-HAT-DMEM培养基重悬，然后均匀铺于96孔板内，37℃，5％CO₂培养。融合后的细胞在培养一周左右后用10％FBS-HT-DMEM培养基进行半量换液，当细胞菌落覆盖孔底的面积达到1/3～1/2时，取培养上清，用间接ELISA方法进行阳性克隆的检测。经过克隆化筛选和培养的杂交瘤细胞株，采用有限稀释法进行克隆化培养。同样以ELISA方法进行筛选，最终获得阳性杂交瘤细胞株并将其命名为G5-8。扩大培养后，冻存杂交瘤细胞。

实施例4.单克隆抗体的纯化

取BALB/c小鼠，在接种杂交瘤细胞前1周，经腹腔注射降植烷，0.5ml/只。1周后，每只小鼠经腹腔接种约1X10⁶个杂交瘤细胞；7～10d后，收集腹水。将腹水经10000×g离心30min后，弃沉淀，用50％硫酸铵盐析粗提,PBS溶解，流水透析5h；用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)透析平衡过夜；上样，用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)洗脱杂蛋白，用不同pH值的柠檬酸盐洗脱液洗脱，分段收集洗脱峰，浓缩后，得到纯化后的抗艰难梭菌抗体G5-8。

实施例5.抗艰难梭菌抗体亚型鉴定

根据亚类测定试剂(sigma公司)对间接ELISA筛选出的阳性鼠单克隆细胞株进行亚类测定。试剂盒中提供的酶标板上已经预包被了针对小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM、kappa轻链、lambda轻链的特异性抗体，将实施例4中纯化的抗艰难梭菌抗体G5-8样品加入样品孔中，每孔50μl，无需孵育。将1X羊抗鼠IgA+IgM+IgG-HRP加入样品孔中，每孔50μl，轻轻混匀后，孵育1h。扣去孔中液体加入1XPBST洗孔3次，吸水纸吸干多余水分。加入显色液，每孔100μl，室温避光显色15min。加入100μl终止液，终止显色反应。结果如图1所示，本发明的单克隆抗体为IgG2a亚型。

实施例6.单克隆抗体序列确定

从液氮中取出G5-8杂交瘤细胞细胞冻存管，于37℃快速融解，1000rpm，5min离心去除冻存液，置于100mm孔板，培养至占培养板约80％，加入1ml Trizol试剂(Thermo公司)，并依据说明书提取杂交瘤细胞总RNA。取2.5μg上述总RNA，加入DECP水，使体积达到11μl，加入1.0μl oligo(dT)(10μM)，加入1μl dNTPs(10mM)，混合均匀，65℃孵育5分钟后置冰上1分钟，然后加入4μl RT buffer(5×)，1.0μl DTT(100mM)，1μl Ribonuclease Inhibitor及1μl逆转录酶(takara公司)，50℃反应10min。80℃孵育10分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20℃。设计特异性的巢式PCR引物，该扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区和恒定区互补，采用常规PCR方法扩增目的基因。其中，引物序列的设计按照文献(Bodo Brocks.Species-Crossreactive scFv Against the Tumor Stroma Marker“Fibroblast Activation Protein”Selected by Phage Display From an ImmunizedFAP^-/-Knock-Out Mouse)进行。

测序结果显示,本发明所述的抗艰难梭菌抗体G5-8的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；该抗体的重链可变区3个CDR的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示；轻链可变区3个CDR的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。

实施例7.抗艰难梭菌抗体亲和力测定

生物层干涉技术(biolayer interferoinetry)用来测量GDH抗原和抗艰难梭菌GDH抗体之间的相互作用。Octet QKe仪器(ForteBio)配备了链霉亲和素(SA)生物传感器。40μg/m1的Biotin-GDH抗原偶联到SA传感器，从100nM至1.56nM系列稀释的艰难梭菌GDH单克隆抗体与GDH抗原包被的生物传感器反应10分钟，随后在PBS缓冲液中解离10分钟。之后用ForteBio数据分析软件分析结果以确定解离常数(Kd)，解离常数是用于描述抗体和抗原之间的结合强度的量度，Kon(1/Ms)是抗体抗原复合物形成的结合速率(on-rate)，Koff(1/s)是抗体抗原复合物解离的解离速率(off-rate)。如表1所示，本发明的抗体亲和力较高，亲和力K_D值达到6.76x10^-10M。

表1

实施例8.抗艰难梭菌多克隆抗体的制备

采用实施例1纯化的重组蛋白GDH作为抗原，免疫雌性家兔。重组蛋白与弗氏佐剂等体积(1m L：1m L)混合，用注射器法充分乳化，颈后、背部多点注射法免疫兔子，免疫剂量为500μg/只。二免、三免分别用弗氏不完全佐剂等体积混合，采用颈后、背部多点注射法免疫，免疫剂量为400μg/只。四免用耳缘静脉注射法，五免耳缘静脉加强免疫一次，免疫剂量为100μg/只。五免后一周心脏采血，采集的血清先在室温静置2h后转移至4℃静置过夜，4000rpm离心15min，收集上清分装于5mL离心管，-80℃备用。取部分血清进行血清效价检测。剩余血清自-80℃取出后室温融解，准确取0.5m L血清用平衡液1:20稀释为10mL后，经0.45μl滤器过滤于新离心管。将Protein A预装柱连接入纯化仪通路，10mL平衡液1mL/min流速平衡柱子。取处理后的血清上样，0.5mL/min流速。同时点击开启收集盘，将收集体积设置为1.5mL/tube。分别用10mL的平衡液和洗脱液进行洗涤、洗脱，同时向收集盘收集管内添加300μl/tube的中和液，以免纯化抗体在酸性洗脱液中变性、降解。纯化结束后将洗脱液汇总，经过超滤管超滤脱盐浓缩，得到抗艰难梭菌GDH多克隆抗体，检测抗体浓度并分装储存于-80℃备用。

实施例9.艰难梭菌荧光量子点快速检测试纸的制备及验证

将实施例4纯化的G5-8单克隆抗体标记量子点，实施例8纯化的抗艰难梭菌多克隆抗体包被硝酸纤维素膜搭配检测。将其制备成快速检测试纸后，对其进行特异性检测。将产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肠炎沙门菌、金黄葡萄球菌、绿脓杆菌、霍乱弧菌、艰难梭菌、PBS稀释重组抗原分别用所述艰难梭菌荧光量子点快速检测试纸检测，观察是否存在交叉反应。(+)代表检测结果阳性，(-)代表检测结果阴性。检测结果如表2所示，结果表明艰难梭菌荧光量子点快速检测试纸与产气荚膜梭菌、肠炎沙门菌、金黄葡萄球菌、绿脓杆菌、霍乱弧菌的反应结果均为阴性，与艰难梭菌和重组抗原的反应结果为阳性，所以可以初步确定试纸条具有良好的特异性。

表2

实施例10.RPA特异性检测引物的设计

针对艰难梭菌毒素B的基因序列设计检测艰难梭菌毒素B的RPA引物组，其序列如下所示：

上游引物(SEQ ID NO:9)：

CATTAATACATGATGGTCAATATTATTTTAATG

下游引物(SEQ ID NO:10)：

Biotin-CTATATTCAACTGCTTGTCCGTAAATATTATC

探针序列(SEQ ID NO:11)：

FAM-CTGGAGTACAAAACATAGATGATAATTATTTCTATATAGATGAGAAG，探针在中间距5’端36bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的距5’端35bp和37bp位置的胸腺嘧啶(dT)分别被荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1取代，并且在探针的3’末端通过阻塞基团C3Spacer修饰。

实施例11.艰难梭菌DNA提取

按细菌基因组DNA提取试剂盒(天根)说明书进行操作，具体操作步骤为:取毒素B阳性的艰难梭菌培养液1-5ml，10,000rpm(～11,500×g)离心1min，尽量吸净上清。向菌体沉淀中加入110μl缓冲液(20mM Tris,pH 8.0；2mM Na2-EDTA；1.2％Triton)，和70μl溶菌酶溶液(50mg/ml)，37℃处理30min。加入4μl RNase A(100mg/ml)溶液，振荡15s，室温放置5min。向管中加入20μl Proteinase K溶液，混匀。加入220μl缓冲液GB，振荡15s，70℃放置10min。加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15s。将所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中，所的溶液即为提取的艰难梭菌基因组DNA,-20℃保存备用。

实施例12.RPA反应灵敏度检测

以实施例11提取的毒素B阳性的艰难梭菌DNA作为模板，进行RPA试验，采用筛选的引物进行RPA扩增，同时设置超纯水为阴性对照，反应温度为35℃，反应时长为18min，RPA反应体系为50μl，其中，2μl正反向引物(10μM)，2μl反向引物(10μM)，0.6μl探针，25μl含重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、核酸内切酶IV的缓冲液，1μl模板和17.9μl ddH2O，充分振荡混匀并且瞬离，最后加入2.5μl的280mM醋酸镁，将反应管置于实时荧光PCR仪中36℃恒温反应相应时长；结果如图2所示。如图2所示，当模板浓度为50pg，5pg，0.5pg时，均出现明显扩增曲线，但模板浓度低于0.5pg时无明显扩增曲线，即说明RPA的检测最低限为0.5pg，具有较好的检测精度。

实施例13.艰难梭菌RPA检测试纸条的制备及检测

链霉亲和素包被的纳米金颗粒的制备:取1ml纳米金颗粒溶液(0.15pmol/mL)，加入200mM的硼砂溶液,调整pH值至9.5。同时,在另一个试管中将2μl的链霉亲和素(2mg/ml)与398μl的硼砂溶液(2mM)混合；将稀释的链霉亲和素加入到前述的纳米金颗粒溶液中,以50μl的量递加，边加边搅拌。将混合物置室温放置45分钟,加入含有155.6μl含10％BSA的2mM硼砂溶液,继续将溶液在室温放置10分钟，4500g离心15分钟，吸弃液体，用1ml的洗涤液(含有10g/L BSA的2mM硼砂溶液)重悬沉淀，4500g离心15分钟,吸弃液体,将红色的沉淀重悬在250μl含有5％BSA、137mM NaCl和0.025％吐温-200的缓冲液中。按照此比例制备足量的链霉亲和素包被的纳米金颗粒,取250μl上述包被的纳米金颗粒滴加到7mm×300mm激光切割的玻璃纤维垫上,使之扩散均匀,在实验台上干燥过夜。

胶体金侧向流免疫层析试纸条的制备:用含有5％甲醇、2％蔗糖的100mM碳酸氢钠缓冲液将抗羧基荧光素抗体和生物素化的抗鼠IgG分别稀释到终浓度为0.5mg/ml和1.0mg/ml。所有抗体均用侧向流试剂分配器,分配器头的速度设定在1～3厘米/分钟,优选为2厘米/分钟,注射泵的流速设定在0.1～0.3ml/分钟,优选为0.1ml/分钟。当两种抗体在纸条上点样完成后,将试纸条在37℃干燥1小时。然后按照如下步骤进行试纸卡的装配:首先将一个17mm×300mm的吸收垫放在塑料支撑的硝酸纤维素膜的右手下游端,二者重叠2毫米；随后将一个7mm×300mm含有干燥金纳米颗粒的玻璃纤维垫放在硝酸纤维素膜的左手上游端,二者重叠2毫米；最后将一个12mm×300mm的玻璃纤维样品垫放在金纳米颗粒垫的左手端,二者重叠2毫米。装配完成后,将试纸卡立即裁成3mm宽的试纸条即得到胶体金侧向流免疫层析试纸条,密封、干燥保存。

此外，艰难梭菌的RPA试剂盒包括实施例10中设计的引物和探针、水解缓冲液、酶混合物、醋酸镁(280mM)、无核酸酶纯水以及侧向层析试纸条，试纸条带有检测线，检测线上固定有分子链霉亲和素，能够与引物SEQ ID NO:10末端的生物素特异性结合。

将所述的试纸条分别检测实施例11提取的艰难梭菌DNA、肠炎沙门菌、金黄葡萄球菌、绿脓杆菌、霍乱弧菌的基因组DNA(方法如实施例11所述)，以确定本发明RPA检测方法的特异性。RPA反应体系为50μl，其中，2μl正反向引物(10μM)，2μl反向引物(10μM)，0.6μl探针，25μl含重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、核酸内切酶IV，1μl样品和17.9μl ddH2O，充分振荡混匀并且瞬离，最后加入2.5μl的280mM醋酸镁。反应温度设为35℃的水浴锅中进行，反应时间设定为18min。结果表明，艰难梭菌DNA的样本同时出现T线和C线为阳性(+)，其他病原体的DNA样本仅出现C线为阴性(-)，说明本发明的试纸条试剂盒可以有效检测艰难梭菌，结果如下表3所示。

表3

实施例14.实际样品检测

取艰难梭菌毒素患者粪便样本200个，同时取阴性对照样本200个，样本均来源于天津市人民医院。

根据粪便基因组DNA提取试剂盒(天根)说明书，提取粪便总DNA。具体步骤如下：称取粪便样本180-220mg至2ml离心管中，并将管子置于冰上。向样本中加入500μl缓冲液SA，100μl缓冲液SC，15μl Proteinase K，0.25g的研磨珠间歇振荡1min至样本充分混匀。70℃孵育15min，孵育期间震荡2-3次。涡旋15s，12,000rpm(～13,400×g)离心3min，转移上清液至新的离心管中，加入10μl的RNase A，震荡混匀后室温放置5min。加入200μl缓冲液SH，震荡混匀，置冰上5min。12,000rpm(～13,400×g)离心3min。将所得上清液转移至新的1.5ml离心管，加入等体积缓冲液GFA。将所得溶液加入到一个吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CR2放入收集管中。向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CR2放入收集管中。加入700μl漂洗液PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，吸附柱CR2放入收集管中。将吸附柱CR2放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR2置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。所的溶液即粪便基因组DNA。

取粪便提取液及粪便基因组DNA，分别采用荧光量子点快速检测试纸以及试纸条RPA进行检测，检测结果见表4。从表4结果可以看出，抗体荧光量子点试纸条和RPA试纸条的方法均可以较好的检测艰难梭菌阳性患者，荧光量子点快速检测试纸检测的阳性率为98％，试纸条RPA检测阳性率为83.5％，荧光量子点快速检测试纸检测与试纸条RPA联合检测艰难梭菌的阳性率达到为100％，两者联合检测高于其单独检测。此外，对健康患者样品检测时发现，抗体荧光量子点试纸条存在4.5％的误诊率，但试纸条RPA的正确率为100％，因此荧光量子点快速检测试纸检测与试纸条RPA的联合应用进一步提高诊断的正确率。将艰难梭菌GDH抗原检测与毒素B的DNA检测二者结合，可以起到良好的补充，加强检测结果的准确性。

表4

序列表

<110> 北京保图生物技术有限公司

<120> 一种快速炎症检测试剂盒

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asn Gly Lys Ile His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Val Ile Trp Asn Gly Tyr Asp Arg Ser Thr Thr Glu Ser Ala Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Asn Gly Gln Pro Thr Lys Tyr

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Ala Ser Gln Val Thr Thr Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asp Ala Arg Ser Glu Ala Thr

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Gln Ala Asn Ser Val Pro Gly Thr

1 5

<210> 7

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Gly

20 25 30

Lys Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Trp Asn Gly Tyr Asp Arg Ser Thr Thr Glu Ser Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Asn Gly Gln Pro Thr Lys Tyr Trp Gly Thr Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Glu Ala Ser Gln Val Thr Thr Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu Thr Ser Pro Lys Pro Trp Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Arg Ser Glu Ala Thr Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Val Pro Gly

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cattaataca tgatggtcaa tattatttta atg 33

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctatattcaa ctgcttgtcc gtaaatatta tc 32

<210> 11

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctggagtaca aaacatagat gataattatt tctatataga tgagaag 47