一种抗SARS-CoV-2病毒S1蛋白的禽源单链抗体及其应用
技术领域
本发明涉及细胞免疫学、分子生物学
技术领域
，具体说是一种针对新冠病毒SARS-CoV-2 S1蛋白的单克隆抗体及其应用。背景技术
SARS-CoV-2属于冠状病毒科(Coronaviridae)、正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae) 的β冠状病毒属(Coronavirus)，与严重急性呼吸综合症相关冠状病毒(SARS-CoV)和中 东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)近缘，都会导致严重肺炎症状。该病毒经飞沫、 接触等途径传播，潜伏期患者即具备传播性。研究发现，新冠肺炎患者在病程早期、症状 轻微时即有极强的传染性。
SARS-CoV-2病毒直径为75-160纳米，其基因组为连续性单链RNA，依次编码核蛋白(nucleoprotein)、包膜蛋白(envelope protein)、膜蛋白(membrane protein)及棘突蛋白 (spike protein，又称S protein或S蛋白)，其中棘突蛋白是其表面最重要的蛋白，主要功能 为决定病毒的宿主范围和特异性，与宿主细胞膜受体结合并融合，实现对细胞的侵染。棘 突蛋白包括S1和S2两个亚基，S1中的受体结合区(receptor binding domain,RBD)与人类 SARS-CoV受体血管紧张素转化酶II(ACE2)分子互作，而S2则含有膜融合过程所需要的 基本元件，实现病毒与细胞的融合。从冠状病毒结构上看，棘突蛋白暴露于病毒表面，含 有大量的抗原决定簇，可以产生针对病毒的保护性抗。
单链抗体(single chain antibody fragment,scFv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通 过15-20个氨基酸短肽(linker)连接而成。禽源单链抗体(IgY-scFv)具有更有效的病毒中 和效应，其优点是：可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，避免抗体检测假阳性；由于 IgY和IgG的结构差异和系统发育距离的原因，禽源scFv在哺乳动物体内免疫源性小；体 内循环半衰期短，易清楚，利于解毒排出；易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫 毒素或酶标抗体等用于快速检测，可以一定程度上弥补PCR检测过程消耗时长、检测流程 复杂，以及避免检测窗口期的问题。通过噬菌体展示文库选择针对靶标病原体具有更高亲 和力的scFv基因，在家禽中生产的抗体是产生scFv最简单、最方便和最有效的方法。这 种针对SARS-CoV-2S蛋白的禽源IgY-scFv生产方法将更加标准化、可重复性、并且适合 大规模生产，有效的抑制SARS-CoV-2与人体细胞膜上的ACE2结合，从而防止病毒进入宿主细胞进行复制。针对性的开发特异性抗体对用于SARS-CoV-2病原微生物抗原检测， 对于完善检测手段、丰富检测方法，提高检测结果的准确度、灵敏度和特异性有着非常重 要的帮助。
因此，亟需开发用于针对SARS-CoV-2病毒S1蛋白的禽源单链抗体。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种针对新冠病毒SARS-CoV-2S1蛋白的单克 隆抗体禽源scFv及其应用。
一种抗SARS-CoV-2病毒S1蛋白的禽源单链抗体，其特征在于，所述单链抗体能识别SARS-CoV-2病毒S1蛋白，包括重链可变区的互补决定区域CDRH1、CDRH2、CDRH3 和轻链可变区的互补决定区域CDRL1、CDRL2、CDRL3；
重链可变区的互补决定区域CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3；
轻链可变区的互补决定区域CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。
一种抗SARS-CoV-2病毒S1蛋白的禽源单链抗体，其特征在于，氨基酸序列如SEQID NO：7所示；或者，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
所述单链抗体还包括所述单链抗体的N端和/或C端连接标签得到的抗体。
一种分离的核酸分子，核酸分子包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6之一的氨基酸序列。
一种禽源单链抗体的核酸分子，包括编码SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的核酸分子。
一种抗SARS-CoV-2病毒S1蛋白的禽源单链抗体，开发了以CDR-FR结构域融合的模拟肽。
针对新冠病毒SARS-CoV-2的禽源单链抗体在制备新冠病毒SARS-CoV-2检测产品中 的应用。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种针对新冠病毒SARS-CoV-2的单克隆抗体禽源scFv，该scFv与新冠病毒 SARS-CoV-2棘突蛋白特异性结合；包括重链可变区的互补决定区域CDRH1、CDRH2、 CDRH3和轻链可变区的互补决定区域CDRL1、CDRL2、CDRL3；重链可变区的互补决定 区域CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3；轻链可变区的互补决定区域CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别如 SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。
优选的一种针对新冠病毒SARS-CoV-2的单克隆抗体禽源scFv，所述scFv重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8 所示。
本发明还包括一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码上述任一项所述的单克隆抗体 禽源scFv。
本发明还包括一种包括上述的核酸分子的表达载体，除了前面所述的核酸分子之外， 表达载体还包括与所述核酸分子序列操作性相连的表达调控序列。
表达载体是指可将编码禽源scFv抗体的多聚核苷酸插入其中并使scFv抗体得到表达 的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件 在宿主细胞内得以表达。载体的种类包括本领域熟知的细菌质料、噬菌体、酵母质料、植 物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。原则上，只要能在宿主体内复制和稳定，任何载体都可以用。在表达载体中，除了含有复制起点外，还可含有 标记基因和其他翻译调控元件。
本发明还包括一种包括上述核酸分子或上述的表达载体的宿主细胞。
表达禽源scFv抗体的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如 酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞； CHO、COS、293细胞或Bowes黑素瘤细胞等动物细胞。
本发明还包括一种抗体模拟肽，以抗SARS-CoV-2病毒S1蛋白的禽源单链抗体scFv为基础，设计和生成了以CDR-FR结构域融合的模拟肽。
本发明还包括针对新冠病毒SARS-CoV-2的单克隆抗体禽源scFv在制备新冠病毒SARS-CoV-2检测产品中的应用。
所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述结合 分子的能够检测出SARS-CoV-2的检测产品均包括在本发明的范围之内。
本发明所用的术语“新冠病毒SARS-CoV-2”与“SARS-CoV-2病毒”、“新冠病 毒”“SARS-CoV-2”可以互换使用。
本发明所涉及的序列具体信息如下：
SEQ ID NO：1(即<210>1)：
SGGGLQTPGGGLGLVCKAPGFSIGGYIMH
SEQ ID NO：2(即<210>2)：
WVRQTPGKGLEYVAGIDAGGGVTWYGAAVKG
SEQ ID NO：3(即<210>3)：
RATISRDNGQSTVRLQLNDLRAEDTGIYYCARSTGSDYYDWNYAGEIGA
SEQ ID NO：4(即<210>4)：
SGGGGSALTQPSSVSANPGETVKITCSGGGSSSYYG
SEQ ID NO：5(即<210>5)：
WYQQKSPGGAPVTVIYSNTGRPS
SEQ ID NO：6(即<210>6)：
DIPSRFSGSKSGSTHTLTITGVQVDDEAVYYCGSEDSSTHDGI
SEQ ID NO：7(即<210>7)：
SGGGLQTPGGGLGLVCKAPGFSIGGYIMHWVRQTPGKGLEYVAGIDAGGGVTWYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNDL
RAEDTGIYYCARSTGSDYYDWNYAGEIGAWGHGTEVIVSS
SEQ ID NO：8(即<210>8)：
SGGGGSALTQPSSVSANPGETVKITCSGGGSSSYYGWYQQKSPGGAPVTVIYSNTGRPSDIPSRFSGSKSGSTHTLTITG
VQVDDEAVYYCGSEDSSTHDGIFGAGTTLTVLG
本发明的针对新冠病毒SARS-CoV-2的单克隆抗体禽源scFv，效价高、特异性强，可以高效表达，能与新冠病毒SARS-CoV-2表面的S1蛋白特异性结合，可用于新冠病毒SARS-CoV-2的检测。
噬菌体展示技术把外源DNA插入噬菌体编码外壳蛋白的基因中，使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的外壳蛋白中形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面。具有如下显著的优点：建立了基因型和表型之间直接的物理联系，从而使筛选简便高效。本发明从构建的噬菌体展示抗体库中筛选到了一株能够跟新冠病毒SARS-CoV-2的S1蛋白结合的禽 源scFv抗体，该抗体在新冠病毒的检测及减弱病毒毒性方面具有重要的应用价值。
附图说明
图1为禽抗体重链可变区(VL)、轻链可变区(VL)以及组装成scFv的PCR结果的 示意图；scFv基因的组装；
图2为从第四轮淘选滴度测定板上选10个Phage的ELISA结果示意图，NC为阴性对照PBS，C为空白对照CBS；ELISA检测scFv-Phage与S1蛋白的结合反应；
图3为选取的10个单克隆scFv氨基酸序列之间的比对示意图；10个单克隆scFv氨基酸序列相似性比对；
图4为与S1结合力最高单克隆噬菌体的scFv抗体聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析图；最高结合力的scFv的表达与纯化的SDS-PAGE；
图5为scFv与抗原S1蛋白特异性与灵敏性检测结果示意图；scFv抗体的灵敏性与特 异性检测。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种针对新冠病毒SARS-CoV-2S1蛋白的单克隆抗体禽源scFv 及其应用，通过以下实施例进一步说明本发明。本发明的实施例用于说明而非限制，根据 本发明的实质对其进行的简单改进都属于要求保护的范围。
具体实施例1.新冠病毒SARS-CoV-2S1蛋白免疫
选取生产状态良好的60日龄未开产母鸡5只，将新冠病毒SARS-CoV-2S1蛋白与免疫佐剂等体积混合、乳化后，通过胸肌四点肌注对母鸡进行初次免疫，免疫剂量为200 μg/kg，免疫佐剂为完全弗氏佐剂。初次免疫14天后，母鸡依次进行四次加强免疫，每次 加强免疫的间隔时间为14天，加强免疫时，将S1蛋白与免疫佐剂等体积混合、乳化后， 通过胸肌四点肌注对母鸡进行加强免疫，免疫剂量为250μg/只，免疫佐剂为不完全弗氏佐 剂；
具体实施例2.禽源单链抗体的噬菌体抗体库的建立
待母鸡五次免疫完成后，收集其脾脏组织，-80℃储存；使用总RNA提取试剂盒提取脾脏组织的总RNA，对总RNA进行反转录，得到脾脏组织cDNA。使用两对特异性引物 以脾脏组织cDNA为模板分别扩增禽卵黄抗体(IgY)轻链可变区(VL)和重链可变区 (VH)，接着使用重叠聚合酶链式反应组装成禽源单链抗体片段(scFv)，其中两对特异性引 物包括引物HF-Sif I、引物HR-Linker、引物LF-Linker和引物LR-Not I：
将获得的禽源单链抗体片段scFv分别用限制性内切酶Sif I和Not I进行酶切，再将 pCANTAB5E噬菌粒载体分别用限制性内切酶Sif I和Not I进行酶切，将酶切产物经核酸胶回收后，使用T4 DNA连接酶将酶切后的禽源单链抗体片段scFv与酶切后的pCANTAB5E噬菌粒载体连接在一起。将连接产物转化入TG1大肠杆菌中，并将其涂布于 SOBAG固体培养基上，37℃，培养12小时，其中该SOBAG固体培养基中加入了2μL 氨苄霉素和400μL 20wt％的葡萄糖水溶液。将SOBAG固体培养基上的菌落用无菌磷酸盐 缓冲液(PBS)洗脱下来，加入等体积的100％灭菌甘油，即为TG1细菌抗体库，放入-80℃ 保存备用。
取3mL得到的TG1细菌抗体库加入到250mL 2×YT培养基中，37℃，持续震荡培养，该2×YT培养基含有5mL 20wt％的葡萄糖溶液。每隔一小时，用分光光度计测定培养基 的细菌浓度，待培养基的菌液OD600为0.4～0.6时，向培养基中加入1×1012pfu的M13KO7 辅助噬菌体及250μL的浓度为100mg/mL的氨苄霉素溶液，37℃，100转/分钟轻摇感染 0.5小时之后，再37℃，220转/分钟振荡培养0.5小时。将培养基5000g进行离心15分钟， 去上清，得到细菌沉淀，用500mL的2×YT培养基重悬细菌沉淀，37℃，250转/分钟振 荡培养过夜。将培养基以5 000g离心20分钟，将上清移至另一灭菌的锥形瓶中，再向该 锥形瓶中加入100mLPEG8000/NaCl，冰浴8小时以沉淀噬菌体。将锥形瓶中的溶液以 10000g，4℃离心20分钟，弃去上清，得到白色沉淀，用500μL无菌重悬白色沉淀，加 入等体积甘油保存于-80℃冰箱，此为噬菌体抗体库。
具体实施例3.噬菌体展示抗体库的淘筛
用碳酸盐缓冲液(CBS)包被新冠病毒SARS-CoV-2S1蛋白到酶标条中，4℃过夜孵育后，先用PBST(PBS中加入0.1％Tween 20)洗涤5次，拍干，再用PBS溶液洗涤5次， 拍干。用5％脱脂奶粉溶液加入到酶标条中，每孔200μL，37℃封闭处理2小时后，先用 PBST洗涤10次，拍干，再用PBS溶液洗涤10次，拍干。将2％脱脂奶粉溶液与噬菌体 抗体库混合室温去干扰化20分钟后，将混合溶液加入酶标条中，每孔200μL，37℃孵育2 小时后，先用PBST洗涤10次，拍干，再用PBS溶液洗涤10次，拍干。向酶标条中每孔 加入100μL甘氨酸盐酸(Gly-HCl)(pH 2.2)，震荡8min，立即加入50μL三羟甲基氨基甲 烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)(pH 9.0)中和。
将酶标条中的液体全部吸出置于1.5mL灭菌离心管中，取出10μL用90μL灭菌PBS稀释保存在4℃，准备晚上用于滴度的测定，剩余的全部加入到5mL中处于对数生长期的TG1菌液中，37℃培养箱中静置30分钟，然后摇床中37℃220转/分钟摇30分钟。将培 养1小时后菌液全部倒入100mL 2YT-A培养基中，在摇床中37℃220转/分钟摇至 OD600＝0.5-0.6时，向锥形瓶中加入M13辅助噬菌体M13KO7，37℃培养箱内静置15分钟， 摇床内37℃220转/分钟摇30分钟，5000g离心15分钟，收集菌体，用100mL 2YT-AK 培基重悬菌体，30℃250转/分钟过夜摇。次日将菌液分装到3个灭菌50mL离心管中，4℃ 10000g离心15分钟，将上清液转移到另外3个灭菌的50mL离心管中，然后加入 PEG/NaCl，在冰上静置10小时。10小时后，4℃10000g离心15分钟，弃上清，将沉淀 重悬于500μL灭菌PBS中，取10μL做滴度的测定，滴定结束后加等量甘油保存于-20℃， 标记为一级扩增库。
用同样方法将一级扩增库用于第二轮的淘筛，得到二级扩增库；将二级扩增库用于第 三轮的淘筛，得到三级扩增库；将三级扩增库用于第四轮的淘筛，向四级扩增库中加入100 甘油-80℃冻存。
具体实施例4.特异性单链抗体的表达和纯化
从第四轮淘选结束后的SOBAG固体培养基上随机挑取10个单克隆，分别于5mL 2×YT培养基中培养12小时，通过噬菌体酶联免疫吸附试验选取一株特异性抗新冠病毒 SARS-CoV-2S1蛋白单链抗体细菌株并获得基因，其中该2×YT培养基中含有氨苄霉素。
将获得的特异性抗新冠病毒SARS-CoV-2S1蛋白单链抗体基因和pET-30a载体分别经 限制性内切酶BamH I和Hind III进行酶切2小时得到酶切产物，通过T4 DNA连接酶将酶切产物连接在一起构成重组质粒，并将此重组质粒转化入BL21(DE3)感受态细胞。向感受态细胞中加入900μL无菌无抗LB培养基，混匀后于恒温摇床上37℃，220转/分钟复苏1 小时。将复苏1小时后的菌液以3000g离心后，弃去900μL上清，余下100μL混合物重 悬沉淀均匀涂布于LB固体培养基平板，37℃恒温倒置过夜培养。
次日从固体培养基平板上挑取单菌落接种于3mL LB液体培养基，于恒温摇床上37℃，220转/分钟振荡培养12小时得到菌液。然后以1：100转接到150mL LB培养基中，37℃，220转/分钟，振荡培养至菌液的OD600为0.6，向培养基中加入IPTG，37℃，220 转/分钟，振荡培养5小时。将菌液以12000g，4℃离心10分钟，收集菌体沉淀，使用PBS 洗涤菌体沉淀两次后，再用10mL PBS重悬沉淀得到混合液，然后置于冰上使用超声破碎 仪裂解菌体至菌液澄清。将得到的澄清菌液以12000g，4℃离心10分钟，收集上清并用 PBS重悬沉淀，得到特异性抗新冠病毒SARS-CoV-2S1蛋白禽源单链抗体scFv。
具体实施例5.scFv和SARS-CoV-2S1蛋白结合力的ELISA检测
以SARS-CoV-2S1蛋白作为抗原、scFv作为一抗、抗His标签单克隆抗体作为二抗，建立间接ELISA方法，优化抗原包被浓度、一抗稀释度、封闭液的孵育时间、二抗稀释度 和显色时间。
用CBS溶液将S1蛋白配制成不同稀释比例的稀释液，将稀释液100μL/孔加入96孔酶标板进行包被，4℃过夜孵育，弃孔内液体，PBST清洗4次；用2％BSA 300μL/孔进行 封闭，PBST清洗4次；加入不同稀释比例的scFv蛋白溶液，37℃孵育1.5小时，PBST 清洗4次；辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗His标签单克隆抗体用PBS 1：5000稀释， 每孔加入100μL，37℃孵育1.5小时，PBST清洗4次；加入新鲜配制的TMB-H2O2底物 液100μL/孔，60℃水浴避光放置15分钟，PBST清洗4次，最后加入50μL 2M的H2SO4终止反应，在450nm波长处用酶标仪测其OD值，每孔重复三次。
具体实施例6.禽源单链抗体IgY-scFv模拟肽的设计与生成
利用针对SARS-CoV-2S1蛋白的单克隆抗体禽源单链抗体IgY-scFv的CDR和框架区序列，创建了一个抗体模拟肽，包括由两个相互作用的VH-(VHCDR1)和VL-(VLCDR3) 衍生的CDR，以及框架区(VHFR2)组成。模拟肽采用固相法进行了合成，利用HPLC法 测定模拟肽的纯度，利用质谱法测定模拟肽的分子量。
<110> 陕西理工大学
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<212> 氨基酸序列
<213> 抗SARS-CoV-2 S1蛋白禽单链抗体重链可变区互补决定区域CDRH1
<220>
<221> misc_feature
<223> 抗SARS-CoV-2 S1蛋白禽单链抗体重链可变区互补决定区域CDRH1氨基酸序列
<400> SGGGLQTPGGGLGLVCKAPGFSIGGYIMH
<210> 2
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<212> 氨基酸序列
<213> 抗SARS-CoV-2 S1蛋白禽单链抗体重链可变区互补决定区域CDRH2
<220>
<221> misc_feature
<223> 抗SARS-CoV-2 S1蛋白禽单链抗体重链可变区互补决定区域CDRH2氨基酸序列
<400> WVRQTPGKGLEYVAGIDAGGGVTWYGAAVKG
<210> 3
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<212> 氨基酸序列
<213> 抗SARS-CoV-2 S1蛋白禽单链抗体重链可变区互补决定区域CDRH3
<220>
<221> misc_feature
<223> 抗SARS-CoV-2 S1蛋白禽单链抗体重链可变区互补决定区域CDRH3氨基酸序列
<400> RATISRDNGQSTVRLQLNDLRAEDTGIYYCARSTGSDYYDWNYAGEIGA
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<212> 氨基酸序列
<213> 抗SARS-CoV-2 S1蛋白禽单链抗体轻链可变区互补决定区域CDRL1
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<221> misc_feature
<223> 抗SARS-CoV-2 S1蛋白禽单链抗体轻链可变区互补决定区域CDRL1氨基酸序列
<400> SGGGGSALTQPSSVSANPGETVKITCSGGGSSSYYG
<210> 5
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<212> 氨基酸序列
<213> 抗SARS-CoV-2 S1蛋白禽单链抗体轻链可变区互补决定区域CDRL2
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<221> misc_feature
<223> 抗SARS-CoV-2 S1蛋白禽单链抗体轻链可变区互补决定区域CDRL2氨基酸序列
<400> WYQQKSPGGAPVTVIYSNTGRPS
<210> 6
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<212> 氨基酸序列
<213> 抗SARS-CoV-2 S1蛋白禽单链抗体轻链可变区互补决定区域CDRL3
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<221> misc_feature
<223> 抗SARS-CoV-2 S1蛋白禽单链抗体轻链可变区互补决定区域CDRL3氨基酸序列
<400> DIPSRFSGSKSGSTHTLTITGVQVDDEAVYYCGSEDSSTHDGI
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<212> 氨基酸序列
<213> 抗SARS-CoV-2 S1蛋白禽单链抗体重链可变区VH
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<221> misc_feature
<223> 抗SARS-CoV-2 S1蛋白禽单链抗体重链可变区VH氨基酸序列
<400> SGGGLQTPGGGLGLVCKAPGFSIGGYIMHWVRQTPGKGLEYVAGIDAGGGVTWYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNDLRAEDTGIYYCARSTGSDYYDWNYAGEIGAWGHGTEVIVSS
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<212> 氨基酸序列
<213> 抗SARS-CoV-2 S1蛋白禽单链抗体轻链可变区VL
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<223> 抗SARS-CoV-2 S1蛋白禽单链抗体轻链可变区VL氨基酸序列
<400> SGGGGSALTQPSSVSANPGETVKITCSGGGSSSYYGWYQQKSPGGAPVTVIYSNTGRPSDIPSRFSGSKSGSTHTLTITGVQVDDEAVYYCGSEDSSTHDGIFGAGTTLTVLG
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