一种精制微生物发酵法制备的氨基葡萄糖复合盐的工艺
技术领域
本发明涉及氨基葡萄糖制备
技术领域
，尤其涉及一种精制微生物发酵法制备的氨基葡萄糖复合盐的工艺。背景技术
研究表明：氨基葡萄糖硫酸盐作为氨糖类骨关节炎治疗药物的最新一代产品可被人体直接吸收、用于补充蛋白多糖合成基质的营养物质对关节退行性改变原发及继发性骨关节炎运动性关节软骨损伤具有结构改善作用是国际公认的治疗骨关节炎的高特异性药物。及早补充氨基葡萄糖硫酸盐能很好的预防、治疗关节软骨病变。
然而，由于氨基葡萄糖硫酸盐极易吸湿发生非酶褐变反应或者氧化反应。因此，规模化生产和存贮高纯氨基葡萄糖硫酸盐是非常困难的。而且氨基葡萄糖硫酸盐的这种不稳定性大大限制了其大规模的生产应用，相对而言，含有氯化钠的氨基葡萄糖硫酸盐(即复盐)的稳定性则显著提高。相对于采用浓盐酸水解从虾壳等生物质中提取氨基葡萄糖而言，采用微生物发酵法制取氨基葡萄糖更加环保。这种方法一般是在培养基中经过微生物发酵合成，然后从发酵液中提取代谢产物，得到氨基葡萄糖粗品。目前，在对氨基葡萄糖粗品进行精制时，采用的一些方法是将粗品溶解后加热浓缩，然后在浓缩液中加入乙醇并降温进行重结晶。但这种方法普遍存在以下几方面的不足：(1)面临乙醇的分离和回收的问题。(2)产品品质有待提高。(3)重结晶收率较低，面临母液的循环利用问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种精制微生物发酵法制备的氨基葡萄糖复合盐的工艺，这种方法不仅能够得到精制的氨基葡萄糖复合盐，而且避免了重结晶收率较低和母液循环利用的问题。为实现上述发明目的，本发明公开了以下技术方案：
一种精制微生物发酵法制备的氨基葡萄糖复合盐的工艺，包括如下步骤：
(1)将发酵菌剂接种至培养基中发酵，完成后得到含有氨基葡萄糖的发酵液，去除得到的发酵液中的菌体，得到清液，在该清液中加入盐酸溶液进行水解，完成后加入中和剂中和多余的盐酸，得含有氨基葡萄糖盐酸盐的水解液。
(2)在所述水解液中加入脱色剂搅拌后静置，然后分离出脱色液，备用。
(3)将所述脱色液进行超滤处理，然后将得到的滤液进行浓缩，得到的浓缩液备用。
(4)将所述浓缩液中加入氯化钠，然后将浓缩液制成冻干粉，即得精制的氨基葡萄糖复合盐。
进一步地，步骤(1)中，所述盐酸溶液的浓度控制在30～35％之间为宜，且所述盐酸溶液加入量为水解液体积的25％以上，如25～30％等。
进一步地，步骤(1)中，所述水解温度为60～80℃，水解时间为3～5小时。相对于采用浓盐酸水解，采用硫酸水解时反应温度较低，反应更加温和，而且在加热条件下水解时浓盐酸更容易挥发，而采用硫酸可避免上述问题。
进一步地，步骤(1)中，所述中和剂包括氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠中的至少一种。通过这些碱性中和剂去除水解液中多余的盐酸得到氨基葡萄糖硫酸钠，同时生成的二氧化碳从水解液中溢出，避免了产品中引入新的杂质。
进一步地，步骤(2)中，所述脱色剂为活性炭，可选地，所述活性炭与水解液的质量体积比(m/v)为0.3～0.8g：10ml。活性炭能够有效去除水解液中的色素和部分杂质。
进一步地，步骤(3)中，所述超滤处理在超滤设备中完成，其中的超滤膜的孔径为35～50nm。通过超滤处理可以去除脱色液中的大分子杂质，提高产品纯度。
进一步地，步骤(4)中，所述冻干粉的制备方法为：将浓缩液冷冻成固体，然后抽真空将该固体中的水分升华，完成后将固体研磨成微粉，即得。
进一步地，将所述浓缩液迅速冷冻至零下8～15℃形成固体，然后抽真空至0.1～0.25mbra，使固体中的水分升华，由于这一过程为物理变化的过程，不会对其中的氨基葡萄糖硫酸盐造成影响。
进一步地，步骤(4)中，所述氯化钠的添加量为浓缩液质量的0.1～0.15％。通过加入少量氯化钠可以提高氨基葡萄糖硫酸盐的稳定性，避免因氨基葡萄糖硫酸盐吸湿而发生非酶褐变反应或者氧化反应，导致产品变质。
现有技术相比，本发明取得的有益效果包括：在传统的利用水解甲壳素制备氨基葡萄糖产品的工艺中，在后续工序中对氨基葡萄糖粗品进行精制时，一般采用的是将粗品溶解后加热浓缩，然后在浓缩液中加入乙醇并降温进行重结晶的方法。但这种方法存在的主要不足是重结晶后的母液回收处理问题、乙醇的回收处理问题以及重结晶的收率较低的问题，进而带来了成本增大方面的问题。而在本发明中，首先通过活性炭和超滤处理有效去除了产品中的杂质，提高产品纯度。然后通过将除杂后的浓缩液直接制作成冻干粉，避免了母液的产生，也就是不需要再面临传统工艺中浓缩结晶后剩余母液的回收利用的问题，这是因为在传统的工艺中，将浓缩液降温后其中的部分产品逐渐结晶析出，然后通过过滤、离心等方法分离出这些结晶产物，但剩余的液体(即母液)中事实上仍然有10％以上的产品无法析出而残留在母液中，这部分母液常常被套用后再次进行重结晶，但这种方法并不能从根本上解决问题，因为本质上并没有提高母液中产品的结晶率，仅仅是机械式地对母液进行了多次重结晶而已。而本发明通过将纯化后的浓缩液制成冻干粉的技术思路，避免了传统的这种工艺会产生母液的问题，也就避免了因母液携带部分无法被回收的产品而导致产品收率较低的问题。同时，冻干粉的制作过程中也不需采用化学试剂，也就避免了传统工艺中用乙醇作为沉淀剂而带来的对乙醇需要进行回收利用的问题及其导致的工艺复杂化、成本提高的问题。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。现通过具体实施对本发明进一步说明。
下列实施例中，所述种子培养基统一采用现有的配方：蛋白胨11.5g/L、酵母浸粉20g/L、半胱氨酸10g/L、氯化钠5g/L、硫酸铵2g/L、甘油5.5g/L，pH用氨水调节至6.5。培养时，控制培养温度37℃，摇床速度230rpm，培养时间为12h。
所述发酵培养基统一采用现有的配方：葡萄糖25g/L、酵母浸粉20g/L、硝酸钠3g/L、磷酸氢二钾1.05g/L、氯化钠0.1g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.03g/L、乳糖3.2g/L、甘油5.5g/L。培养时，培养温度为37℃，摇床速度230rpm，培养时间为40h，葡萄糖的补料速度调节为3.8L/h。
所述发酵菌剂统一采用按照体积比3：0.6：1.5的比例混合而成的大肠杆菌、酿酒酵母、葡萄球菌。
实施例1
一种精制微生物发酵法制备的氨基葡萄糖复合盐的工艺，包括如下步骤：
(1)将所述混合发酵菌剂接种在种子培养基中活化培养，完成后将混合发酵菌剂按照13％的接种量接种至所述发酵培养基中进行发酵培养，完成后得到含有氨基葡萄糖的发酵液。
(2)对所述发酵液进行离心去除菌体等固体物，收集上清液，在所述上清液中加入质量浓度为30％的盐酸溶液，其中：盐酸溶液加入量为水解液体积的30％，然后在65℃的加热条件下对水解液水解4小时，水解结束后加入氢氧化钠中和掉多余的盐酸，然后过滤分离出含有氨基葡萄糖硫酸盐的水解液。
(3)按照活性炭与水解液的质量体积比为0.35g：10ml的比例，在步骤(2)得到的水解液中加入活性炭，然后在40℃下脱色25分钟，完成后滤除活性炭，得到脱色液。
(4)将所述脱色液置于膜分离系统中，采用超滤膜对脱色液进行提纯，传质推动力为水压压差(15kg)。超滤过程中，脱色液在压力推动下流经膜表面，水及氨基葡萄糖硫酸盐分子透过超滤膜成为滤液，而大分子杂质被超滤膜截留。
(5)将步骤(4)得到的滤液在65℃下浓缩至原体积的50％，即得浓缩液，然后在浓缩液中加入其质量的0.1％的氯化钠。最后将所述浓缩液置于冻干机中迅速冷冻至零下10℃形成固体，然后抽真空至0.2mbra，使固体中的水分升华，完成后将固体研磨成微粉，即得精制的氨基葡萄糖复合盐粉末。
实施例2
一种精制微生物发酵法制备的氨基葡萄糖复合盐的工艺，包括如下步骤：
(1)将所述混合发酵菌剂接种在种子培养基中活化培养，完成后将混合发酵菌剂按照13％的接种量接种至所述发酵培养基中进行发酵培养，完成后得到含有氨基葡萄糖的发酵液。
(2)对所述发酵液进行离心去除菌体等固体物，收集上清液，其中：盐酸溶液加入量为水解液体积的30％，然后在80℃的加热条件下对水解液水解5小时，水解结束后加入碳酸钠中和掉多余的盐酸，然后过滤分离出含有氨基葡萄糖硫酸盐的水解液，备用。
(3)按照活性炭与水解液的质量体积比为0.7g：10ml的比例，在步骤(2)得到的水解液中加入活性炭，然后在40℃下脱色20分钟，完成后滤除活性炭，得到脱色液。
(4)将所述脱色液置于膜分离系统中，采用超滤膜对脱色液进行提纯，传质推动力为水压压差(15kg)。超滤过程中，脱色液在压力推动下流经膜表面，水及氨基葡萄糖硫酸盐分子透过超滤膜成为滤液，而大分子杂质被超滤膜截留。
(5)将步骤(4)得到的滤液在65℃下浓缩至原体积的50％，即得浓缩液，然后在浓缩液中加入其质量的0.15％的氯化钠，以提高产品的稳定性。最后将所述浓缩液置于冻干机中迅速冷冻至零下8℃形成固体，然后抽真空至0.2mbra，使固体中的水分升华，完成后将固体研磨成微粉，即得精制的氨基葡萄糖复合盐粉末。
实施例3
一种精制微生物发酵法制备的氨基葡萄糖复合盐的工艺，包括如下步骤：
(1)将所述混合发酵菌剂接种在种子培养基中活化培养，完成后将混合发酵菌剂按照13％的接种量接种至所述发酵培养基中进行发酵培养，完成后得到含有氨基葡萄糖的发酵液。
(2)对所述发酵液进行离心去除菌体等固体物，收集上清液，其中：盐酸溶液加入量为水解液体积的25％，然后在60℃的加热条件下对水解液水解3小时，水解结束后加入碳酸氢钠中和掉多余的盐酸，然后过滤分离出含有氨基葡萄糖硫酸盐的水解液，备用。
(3)按照活性炭与水解液的质量体积比为0.8g：10ml的比例，在步骤(2)得到的水解液中加入活性炭，然后在40℃下脱色20分钟，完成后滤除活性炭，得到脱色液。
(4)将所述脱色液置于膜分离系统中，采用超滤膜对脱色液进行提纯，传质推动力为水压压差(15kg)。超滤过程中，脱色液在压力推动下流经膜表面，水及氨基葡萄糖硫酸盐分子透过超滤膜成为滤液，而大分子杂质被超滤膜截留。
(5)将步骤(4)得到的滤液在65℃下浓缩至原体积的50％，即得浓缩液，然后在浓缩液中加入其质量的0.15％的氯化钠，以提高产品的稳定性。最后将所述浓缩液置于冻干机中迅速冷冻至零下12℃形成固体，然后抽真空至0.25mbra，使固体中的水分升华，完成后将固体研磨成微粉，即得精制的氨基葡萄糖复合盐粉末。
实施例4
一种精制微生物发酵法制备的氨基葡萄糖复合盐的工艺，包括如下步骤：
(1)将所述混合发酵菌剂接种在种子培养基中活化培养，完成后将混合发酵菌剂按照13％的接种量接种至所述发酵培养基中进行发酵培养，完成后得到含有氨基葡萄糖的发酵液。
(2)对所述发酵液进行离心去除菌体等固体物，收集上清液，其中：盐酸溶液加入量为水解液体积的25％，然后在70℃的加热条件下对水解液水解4小时，水解结束后加入氢氧化钠中和掉多余的盐酸，然后过滤分离出含有氨基葡萄糖硫酸盐的水解液，备用。
(3)按照活性炭与水解液的质量体积比为0.3g：10ml的比例，在步骤(2)得到的水解液中加入活性炭，然后在40℃下脱色20分钟，完成后滤除活性炭，得到脱色液。
(4)将所述脱色液置于膜分离系统中，采用超滤膜对脱色液进行提纯，传质推动力为水压压差(15kg)。超滤过程中，脱色液在压力推动下流经膜表面，水及氨基葡萄糖硫酸盐分子透过超滤膜成为滤液，而大分子杂质被超滤膜截留。
(5)将步骤(4)得到的滤液在65℃下浓缩至原体积的50％，即得浓缩液，然后在浓缩液中加入其质量的0.12％的氯化钠，以提高产品的稳定性。最后将所述浓缩液置于冻干机中迅速冷冻至零下15℃形成固体，然后抽真空至0.1mbra，使固体中的水分升华，完成后将固体研磨成微粉，即得精制的氨基葡萄糖复合盐粉末。
实施例5
一种精制微生物发酵法制备的氨基葡萄糖复合盐的工艺，包括如下步骤：
(1)将所述混合发酵菌剂接种在种子培养基中活化培养，完成后将混合发酵菌剂按照13％的接种量接种至所述发酵培养基中进行发酵培养，完成后得到含有氨基葡萄糖的发酵液。
(2)对所述发酵液进行离心去除菌体等固体物，收集上清液，其中：盐酸溶液加入量为水解液体积的25％，然后在65℃的加热条件下对水解液水解4小时，水解结束后加入氢氧化钠中和掉多余的盐酸，然后过滤分离出含有氨基葡萄糖硫酸盐的水解液，备用。
(3)按照活性炭与水解液的质量体积比为0.35g：10ml的比例，在步骤(2)得到的水解液中加入活性炭，然后在40℃下脱色25分钟，完成后滤除活性炭，得到脱色液。
(4)将所述脱色液置于膜分离系统中，采用超滤膜对脱色液进行提纯，传质推动力为水压压差(15kg)。超滤过程中，脱色液在压力推动下流经膜表面，水及氨基葡萄糖硫酸盐分子透过超滤膜成为滤液，而大分子杂质被超滤膜截留。
(5)将步骤(4)得到的滤液在65℃下浓缩至原体积的50％，即得浓缩液，将所述浓缩液降温至5℃进行结晶，待晶体析出完成后过滤分离出晶体，将晶体干燥，即得氨基葡萄糖复合盐产品。
实施例6
一种精制微生物发酵法制备的氨基葡萄糖复合盐的工艺，包括如下步骤：
(1)将所述混合发酵菌剂接种在种子培养基中活化培养，完成后将混合发酵菌剂按照13％的接种量接种至所述发酵培养基中进行发酵培养，完成后得到含有氨基葡萄糖的发酵液。
(2)对所述发酵液进行离心去除菌体等固体物，收集上清液，其中：盐酸溶液加入量为水解液体积的25％，然后在65℃的加热条件下对水解液水解4小时，水解结束后加入碳酸钠中和掉多余的盐酸，然后过滤分离出含有氨基葡萄糖硫酸盐的水解液，备用。
(3)按照活性炭与水解液的质量体积比为0.7g：10ml的比例，在步骤(2)得到的水解液中加入活性炭，然后在40℃下脱色20分钟，完成后滤除活性炭，得到脱色液。
(4)将所述脱色液置于膜分离系统中，采用超滤膜对脱色液进行提纯，传质推动力为水压压差(15kg)。超滤过程中，脱色液在压力推动下流经膜表面，水及氨基葡萄糖硫酸盐分子透过超滤膜成为滤液，而大分子杂质被超滤膜截留。
(5)将步骤(4)得到的滤液在65℃下浓缩至原体积的50％，即得浓缩液，将所述浓缩液中加入其体积20％的无水乙醇，并降温至5℃进行结晶，待晶体析出完成后过滤分离出晶体，将晶体干燥，即得氨基葡萄糖复合盐产品。
计算实施例1～6制备的氨基葡萄糖复合盐的纯度和收率，结果如表1所示。
表1
实施例1
实施例2
实施例3
实施例4
实施例5
实施例6
纯度/％
99.89
99.95
99.92
99.96
99.88
99.95
收率/％
95.8
94.6
96.4
95.5
79.7
86.2
从表1的检测结果可以得出，实施例1～4的收率明显高于实施例5和实施例6，这是因为通过将纯化后的浓缩液制成冻干粉，避免了传统的工艺会产生母液的问题，也避免了因母液携带部分无法被回收的产品而导致产品收率较低的问题。同时，由于冻干粉的制作过程中也不需采用化学试剂，也就避免了传统工艺中用乙醇作为沉淀剂而带来的对乙醇需要进行回收利用的问题及其导致的工艺复杂化、成本提高的问题。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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