一种鞣质类化合物及其提取方法和应用
技术领域
本发明属于化合物提取领域，具体涉及一种鞣质类化合物及其提取方法和应用。
背景技术
红树林是分布在热带、亚热带地区海岸潮间带的木本植物群落，以常绿乔木和灌木为主，是陆地向海洋过度的特殊生态系统。我国红树林资源丰富，主要分布在福建、广西、广东、海南和台湾等省区沿海一带。中国目前存在真红树植物12科15属28种(含变种)，半红树11科13属14种，其中具有药用价值的有23种，作为民间药用的红树植物主要有13种，包括正红树Rhizophora apiculata、红海榄Rhizophora stylosa、木榄Bruguiera gymnorhiza、海莲Bruguiera sexangula、秋茄Kandelia candel、角果木Ceriops tagal、海漆Excoecaria agallocha、老鼠簕Acanthus ilicifolius、小花老鼠簕Acanthusebracteatus、银叶树Heritiera littoralis、海芒果Cerbera manghas、黄槿Hibiscustiliaceus和海桑Sonneratia caseolaris。由于红树林位于陆地与海洋的交界区，处于周期性受到海水浸淹的潮间带环境，使红树植物形成了独特的结构和功能适应性，如支柱根、呼吸根、胎萌和泌盐机理等。与陆生植物相比，红树植物的次生代谢产物具有新颖的化学结构，表现出比较独特的生物活性，为海洋植物药物开发提供了丰富的资源。
老鼠簕Acanthus ilicifolius Linn.是一种非胎生红树植物，分类学属于爵床科Acanthaceae老鼠簕属Acanthus，一般生长在热带或亚热带具有高盐碱度的潮间带泥滩、河口高潮线以下的盐渍土壤或淤泥较厚的海湾。在我国福建、广西、广东、海南等热带亚热带沿海地区均有分布。在形态学上，老鼠簕为直立灌木，高达两米，茎粗壮，托叶成刺状，叶片长圆形至长圆状披针形，先端急尖，基部楔形，边缘羽状浅裂，自裂片顶端突出为尖锐硬刺。穗状花序顶生，花冠白色，蒴果椭圆形，有种子四颗，种子扁平，淡黄色。生药学研究发现老鼠簕根的通气细胞发达，叶的中脉有四个维管束特征明显。老鼠簕作为一种重要的药用红树植物有着悠久的民间药用历史，早在1978年的《全国中草药汇编》就有记录其具有止咳平喘、清热解毒、消肿散结的功效，主要以全株或根入药，味淡性寒，主治急慢性肝炎、肝脾肿大、咳嗽、胃痛、哮喘。在我国民间海南地区利用老鼠簕来消肿、解毒、止痛、治淋巴结肿大、急性肝脾疾病和黄疸等。将老鼠簕根捣碎后水煮，同蜂蜜一起口服，可作为治疗乙肝的特效药。广西民间用老鼠簕根治腰肌劳损、神经痛和祛痰等，而福建民间则用来治疗男子不育症。在一些东南亚国家，如印度和泰国，传统医药将老鼠簕枝叶用于治疗神经痛、风湿症、蛇伤和麻痹等。因此，红树植物老鼠簕具有广泛的民间药用基础。
发明内容
本发明旨在提供一种从红树植物老鼠簕中提取的新型鞣质类化合物及其提取方法和应用。
具体地，本发明提供了一种鞣质类化合物，其中，所述鞣质类化合物名称为4-[β-D-(2-丁香酰基)葡萄糖氧基]-3-甲氧基苯甲酸，具有式(1)所示的结构：
所述鞣质类化合物为白色无定型粉末，易溶于甲醇和丙酮，不溶于氯仿。
本发明还提供了所述鞣质类化合物的提取方法，该方法包括以下步骤：
S1、将老鼠簕全株干燥粉末于室温下采用乙醇水溶液浸提，将提取液过滤后浓缩得到浸膏，再将浸膏用甲醇水溶液溶解分散得到浸膏分散液，之后用石油醚对浸膏分散液进行萃取，所得甲醇相抽滤后浓缩，得到甲醇相稠膏；
S2、将甲醇相稠膏采用大孔树脂层析柱并以30±5％的乙醇水溶液作为洗脱剂进行分离提纯，减压浓缩，得到组分A；
S3、将组分A采用RP-18反相柱并以15±5％的丙酮水溶液作为洗脱剂进行分离提纯，减压浓缩，得到组分A3；
S4、将组分A3采用凝胶柱并以甲醇作为洗脱剂进行分离提纯，减压浓缩，得到组分A3.1；
S5、将组分A3.1采用RP-18反相柱并以35±5％的甲醇水溶液作为洗脱剂进行分离提纯，减压浓缩，得到组分A3.1.2；
S6、将组分A3.1.2采用凝胶柱并以丙酮和甲醇按照体积比(2～4):1组成的醇酮混合溶液作为洗脱剂进行分离提纯，减压浓缩，之后采用正相硅胶柱并以三氯甲烷和甲醇按照体积比(20～25):1组成的醇烃混合溶液作为洗脱剂进行分离提纯，减压浓缩，得到鞣质类化合物。
在一种优选方式中，步骤S1中，所述老鼠簕全株干燥粉末与乙醇水溶液的用量比为1g:(4～8)mL。
在一种优选方式中，步骤S1中，所述乙醇水溶液的浓度为95±2％。
在一种优选方式中，步骤S1中，所述浸提的时间为20～30h(单次)，浸提的次数为1～3次。当采用多次浸提时，将多次浸提所得提取液合并后再过滤浓缩得到浸膏。
在一种优选方式中，步骤S1中，所述甲醇水溶液的浓度为80±5％。
在一种优选方式中，步骤S1中，所述浸膏与甲醇水溶液的用量比为(300～400)g:1L。
在一种优选方式中，步骤S1中，所述萃取的次数为2～4次，每次萃取所用石油醚的用量与分散所用甲醇水溶液的用量之比为(600～800)mL:1L。当采用多次萃取时，将多次萃取所得甲醇相合并后再浓缩得到甲醇相稠膏。
在一种优选方式中，步骤S2中，所述大孔树脂层析柱为HP-20大孔树脂层析柱。
在一种优选方式中，步骤S2中，所述甲醇相稠膏采用纯水超声溶解分散后上样，上样流速为2～6BV/h。
在一种优选方式中，步骤S2中，采用乙醇水溶液洗脱之前先采用水洗脱除杂。
在一种优选方式中，步骤S3中，所述RP-18反相柱的内径为30～40mm，长度为200～250mm。
在一种优选方式中，步骤S4中，所述凝胶柱为Sephadex LH-20凝胶柱。
在一种优选方式中，步骤S5中，所述RP-18反相柱的内径为20～30mm，长度为200～250mm。
在一种优选方式中，步骤S6中，所述凝胶柱为Sephadex LH-20凝胶柱。
在本发明中，步骤S2，所述组分A为从大孔树脂层析柱中洗脱出的富含第一种活性组分(最先流出的组分)的物质。步骤S3中，所述组分A3为从RP-18反相柱中洗脱出的富含第三种活性组分(第三流出的组分)的物质。步骤S4中，所述组分A3.1为从Sephadex LH-20凝胶柱中洗脱出的富含第一种活性组分(最先流出的组分)的物质。步骤S5中，所述组分A3.1.2为从RP-18反相柱中洗脱出的富含第二种活性组分(第二流出的组分)的物质。
此外，本发明还提供了鞣质类化合物在抗炎、止血、止泻、抗菌、抗病毒、抗脂质过氧化、清除自由基、抗突变或抗肿瘤中的应用。
本发明以红树植物老鼠簕作为原料，采用大孔树脂、RP-18反相柱、Sephedex LH-20凝胶柱、正相硅胶柱这几种色谱分离技术相配合的方式进行分离提纯，利用核磁、质谱等现代波谱技术验证了所得化合物为一种新型的鞣质类化合物。
鞣质又名丹宁或单宁，是存在于植物中的一类结构相对复杂的天然多元酚类化合物，广泛分布于自然界中，约70％以上的中药里含有鞣质类化合物，具有很好的生物以及药理活性。据历史记载，五千年以前就有了人类对鞣质类化合物的应用：久病、年老、元气不固而引起的泻痢不止、自汗盗汗，用来固涩收敛滑脱或遏制气血津液的散失，此种治疗的方法称为固涩法。现代研究发现，固涩类药物中的鞣质成分都较丰富。近年来人们对植物中鞣质成分的研究取得很大突破，发现其不仅有抗炎、止血、抗菌等药理活性，还具有抗脂质过氧化、清除自由基、抗突变和抗肿瘤等多种药理活性[1-3]，在临床上主要用于止泻、止血、抗病毒及抗菌[4]。
附图说明
图1为本发明提供的鞣质类化合物的质谱图(MS)；
图2为本发明提供的鞣质类化合物的异核单量子相关谱图(HSQC)；
图3为本发明提供的鞣质类化合物的1H-NMR图；
图4为本发明提供的鞣质类化合物的13C-NMR图；
图5为本发明提供的鞣质类化合物的HMBC图；
图6为本发明提供的鞣质类化合物的1H-1H COSY图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例
S1、将20kg老鼠簕全株晒干后粉碎，用6倍体积(质量体积比)的95％乙醇水溶液室温浸提三次，每次24h，并不时振摇。提取液经布氏漏斗抽滤合并，之后45℃减压浓缩得到浸膏360g。浸膏用1L 80％的甲醇水溶液充分溶解分散，之后先后用800mL、600mL、600mL石油醚萃取三次，合并石油醚液45℃减压浓缩干，得到石油醚相14.3g。甲醇液抽滤后滤液45℃减压浓缩至甲醇全部馏出，得到甲醇相稠膏。
S2、甲醇相稠膏加纯水超声溶解分散至约2L，缓缓倒入装有HP-20大孔树脂1L的层析柱，4BV/h流速自然流下，流出液重复上柱两次。先用超纯水2L洗脱除杂，然后依次用30％、50％、70％、95％乙醇水溶液4L洗脱，每瓶1L分瓶收集。四个浓度梯度各收集4瓶。水相弃用，其他组分45℃减压浓缩干，适量甲醇溶解转移至250mL浓缩瓶，调整体积基本一致后进行薄层色谱TLC检测，根据检测结果合并为组分A(14.3g，收集瓶1-3)、组分B(6.4g，收集瓶4-6)、组分C(1.9g，收集瓶7-10)、组分D(0.7g，收集瓶11-13)和组分E(0.7g，收集瓶14-16)六种组分。其中，合并的依据是薄层色谱TLC检测结果接近，下同。
S3、将组分A(14.3g)用少量甲醇溶解后上RP-18反相柱(内径36mm，长度230mm)，分别用15％和30％的丙酮水溶液2L进行洗脱，每瓶200mL分瓶收集。逐瓶减压浓缩至干后，用甲醇溶解转移至小试管中进行薄层色谱TLC检测，根据检测结果合并得到组分A1(收集瓶1)、组分A2(收集瓶2)、组分A3(收集瓶3-4)、组分A4(收集瓶5-7)、组分A5(收集瓶8-13)和组分A6(收集瓶14-19)六个组分。
S4、将组分A3(1.7g)用少量甲醇溶解后上Sephadex LH-20凝胶柱，之后用甲醇洗脱，调节洗脱流速为5-6滴/min，根据TLC检测结果合并得到组分A3.1(1.173g)和A3.2(534mg)两种组分。
S5、将A3.1用少量甲醇溶解后上RP-18反相柱(内径26mm，长度230mm)，用20％、35％甲醇各1.5L洗脱，每瓶100mL分瓶收集，逐瓶减压浓缩至干后，用甲醇溶解转移至小试管中进行薄层色谱TLC检测，根据检测结果合并得到两种组分A3.1.1(收集瓶1-5)和A3.1.2(353mg，收集瓶6-26)。
S6、将A3.1.2用甲醇溶解后上Sephadex LH-20凝胶柱层析，以丙酮和甲醇按照体积比3:1组成的醇酮混合溶液进行洗脱，洗脱液减压浓缩后上正相硅胶柱层析，用三氯甲烷和甲醇按照体积比为22:1组成的醇烃混合溶液洗脱后减压浓缩，得到鞣质类化合物(36mg)。
该鞣质类化合物是白色无定型粉末，易溶于甲醇和丙酮，不溶于氯仿。该鞣质类化合物的MS结果如图1所示，HSQC、1H-NMR、13C-NMR、HMBC、1H-1H COSY结果分别如图2-图6以及表1所示。
图3中，1H-NMR结果显示低场区存在δ12.81(brs)和δ9.32(brs)两个活泼氢和五个芳香质子，其中δ7.51(dd峰,J＝1.8/8.4)、δ7.38(d峰,J＝1.8)和δ7.28(d峰,J＝8.4)三个芳香质子构成一个苯环的ABX取代(不对称三取代)系统；包含两个质子的单峰δ7.22显示有完全对称的苯环取代。高场区两个甲基单峰可判断存在三个甲氧基，其中δ3.78为完全对称的两个，δ3.52为一个。
图2和图4中，13C-NMR和HSQC结果显示有23个碳原子，其中3个甲氧基，1个氧取代次甲基，10个次甲基(5个芳环和5个糖次甲基)，9个季碳(全部为芳环或酰基季碳)，显示存在一个葡萄糖基存在。
图5中，根据H-2’(δ7.38)、H-5’(δ7.28)、H-6’(δ7.51)和H-3’a甲氧基(δ3.52)的HMBC远程相关可推断出一个3’甲氧基-4’氧取代的苯甲酸结构；根据H-2”(6”)(δ7.22)、H-3”a(5”a)甲氧基(δ3.78)和OH-4”(δ9.32)的HMBC远程相关可确定一个3”a,5”a-二甲氧基取代的没食子酰基结构。图6中，根据葡萄糖H-1(δ5.35,d峰,J＝8.0)、H-2(δ5.05)的远程相关可确定葡萄糖1位通过糖苷键与苯甲酸4’位连接，苷键为β构型，葡萄糖2位通过酯键与3”a,5”a-二甲氧基没食子酰基连接，从而确定该鞣质类化合物为4-(4,5-二羟基-3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酰氧基)-6-(羟甲基)-四氢-2H-吡喃-2-酰氧基)-3-甲氧基苯甲酸，其具有式(2)所示的结构。如图1所示，经质谱分析检测，分子式C23H26O13与分子量完全吻合。经文献检索该鞣质类化合物为新化合物。
表1 鞣质类化合物的NMR数据(ppm)
参考文献：
[1]Al-Harbi R,Shaaban M,Al-Wegaisi R,et al.Antimicrobial activity andmolecular docking of tannins from Pimenta dioica[J].Letters in Drug Designand Discovery,2018,15(5):508-515.
[2]Shin Y,Shon M,Kim G,et al.Antioxidant and anti-adipogenicactivities of persimmon tannins[J].Food Science and Biotechnology,2014,23(5):1689-1694.
[3]Nudda A,Battacone G,Boe R,et al.Effect of chestnut tannins onrumen activity of dairy sheep grazing on pasture[J].Journal of Dairy Science,2010,93:131.
[4]栗世婷，张晓霞，吴蓉瑛.鞣质药理活性的研究新进展[J].疾病监测与控制,2010,4(7):395-397.
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
