具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步说明，合成过程中的化学反应式如下：

R¹为具有不同种类和位置取代基的苯基优选为吸电子基团(卤素原子、硝基、氰基)对位取代的苯基；R²为具有不同种类和位置取代基的苄基、亚甲基萘基及C_1-6烷基、C_3-6环烷基和C_4-7亚甲基环烷基优选为吸电子基团(卤素原子、硝基、氰基)对位取代的苄基、亚甲基萘基及C_1-3烷基、C₃环烷基和C₄亚甲基环烷基。

反应条件：不同取代的3-氰基-1,4-二氢吡啶类化合物，有机溶剂为甲醇：四氢呋喃＝1：1(v/v)；500W高压汞灯，波长为365nm；室温；反应时间为2～5天。

实例中包括R¹为卤素原子对位取代的苯基及R²为卤素或烷基取代的苄基、亚甲基萘基、C_1-3烷基，R¹为其它不同种类和位置取代的苯基及R²为其它不同种类和位置取代的苄基、C_4-6烷基、C_3-6环烷基和 C_4-7亚甲基环烷基化合物可以相同的反应条件进行制备，并不限于以下实例。

实施例1

以R¹为对位氯原子取代的苯基，R²为无取代苄基的3-氰基-1,4- 二氢吡啶为原料进行制备。

将N-苄基-3-氰基-4-(4-氯苯基)-1,4-二氢吡啶(0.5g，1.63mmol) 溶解于30mL有机溶剂甲醇：四氢呋喃＝1：1(v/v)中，室温下置于石英光反应器中，选取波长为365nm的高压汞灯进行照射3天，反应完全。减压蒸馏，除去溶剂。用硅胶柱层析法对产物进行分离提纯，得到白色固体产物1,5,6-三苄基-4,8a-双(4-氯苯基)-3,8-二氰基 -1,4,4a,4b,5,6,8a,8b-八氢环丁烷[1,2-b:3,4-c']联吡啶0.56g，收率49.1％。

¹H NMR(CDCl₃,400MHz,δppm)7.28-7.44(m,23H),7.02(s,2H), 5.28(s,4H),4.26(d,J＝8.3Hz,1H),3.90(d,J＝8.3Hz,1H),3.26(m,1H), 3.14(d,J＝6.7Hz,2H),2.84(m,1H),2.73(m,1H).MS(ESI)m/z:704.24 [M+H]⁺.

实施例2

以R¹为对位氟原子取代的苯基，R²为无取代苄基的3-氰基-1,4- 二氢吡啶为原料进行制备。

将N-苄基-3-氰基-4-(4-氟苯基)-1,4-二氢吡啶(0.5g，1.72mmol) 溶解于30mL有机溶剂甲醇：四氢呋喃＝1：1(v/v)中，室温下置于石英光反应器中，选取波长为365nm的高压汞灯进行照射2天，反应完全。减压蒸馏，除去溶剂。用硅胶柱层析法对产物进行分离提纯，得到白色固体产物1,5,6-三苄基-4,8a-双(4-氟苯基)-3,8-二氰基 -1,4,4a,4b,5,6,8a,8b-八氢环丁烷[1,2-b:3,4-c']联吡啶0.58g，收率50.3％。

¹H NMR(CDCl₃,400MHz,δppm)7.26-7.43(m,23H),7.03(s,2H), 5.26(s,4H),4.24(d,J＝8.1Hz,1H),3.92(d,J＝8.1Hz,1H),3.24(m,1H), 3.12(d,J＝6.5Hz,2H),2.85(m,1H),2.70(m,1H).MS(ESI)m/z:671.29 [M+H]⁺.

实施例3

以R¹为对位氯原子取代的苯基，R²为对位氟原子取代苄基的3- 氰基-1,4-二氢吡啶为原料进行制备。

将N-(4-氟苄基)-3-氰基-4-(4-氯苯基)-1,4-二氢吡啶(0.5g，1.54 mmol)溶解于30mL有机溶剂甲醇：四氢呋喃＝1：1(v/v)中，室温下置于石英光反应器中，选取波长为365nm的高压汞灯进行照射 2天，反应完全。减压蒸馏，除去溶剂。用硅胶柱层析法对产物进行分离提纯，得到白色固体产物5-苄基-4,8a-双(4-氯苯基)-1,6-双(4-氟苄基)-3,8-二氰基-1,4,4a,4b,5,6,8a,8b-八氢环丁烷[1,2-b:3,4-c']联吡啶0.60 g，收率52.7％。

¹H NMR(CDCl₃,400MHz,δppm)7.35-7.44(m,17H),7.13(m,4H), 7.02(s,2H),5.27(s,4H),4.23(d,J＝8.2Hz,1H),3.92(d,J＝8.2Hz,1H), 3.24(m,1H),3.13(d,J＝6.6Hz,2H),2.85(m,1H),2.72(m,1H).MS(ESI) m/z:740.22[M+H]⁺.

实施例4

以R¹为对位氯原子取代的苯基，R²为甲基的3-氰基-1,4-二氢吡啶为原料进行制备。

将N-甲基-3-氰基-4-(4-氯苯基)-1,4-二氢吡啶(0.5g，2.17mmol) 溶解于30mL有机溶剂甲醇：四氢呋喃＝1：1(v/v)中，室温下置于石英光反应器中，选取波长为365nm的高压汞灯进行照射5天，反应完全。减压蒸馏，除去溶剂。用硅胶柱层析法对产物进行分离提纯，得到白色固体产物5-苄基-4,8a-双(4-氯苯基)-1,6-二甲基-3,8-二氰基 -1,4,4a,4b,5,6,8a,8b-八氢环丁烷[1,2-b:3,4-c']联吡啶0.52g，收率43.6％。

¹H NMR(CDCl₃,400MHz,δppm)7.27-7.45(m,13H),7.04(s,2H), 4.21(d,J＝8.1Hz,1H),3.94(d,J＝8.1Hz,1H),3.43(s,6H),3.24(m,1H), 3.12(d,J＝6.0Hz,2H),2.84(m,1H),2.71(m,1H).MS(ESI)m/z:552.18 [M+H]⁺.

实施例5

以R¹为对位氯原子取代的苯基，R²为乙基的3-氰基-1,4-二氢吡啶为原料进行制备。

将N-乙基-3-氰基-4-(4-氯苯基)-1,4-二氢吡啶(0.5g，2.04mmol) 溶解于30mL有机溶剂甲醇：四氢呋喃＝1：1(v/v)中，室温下置于石英光反应器中，选取波长为365nm的高压汞灯进行照射5天，反应完全。减压蒸馏，除去溶剂。用硅胶柱层析法对产物进行分离提纯，得到白色固体产物5-苄基-4,8a-双(4-氯苯基)-1,6-二乙基-3,8-二氰基 -1,4,4a,4b,5,6,8a,8b-八氢环丁烷[1,2-b:3,4-c']联吡啶0.48g，收率40.5％。

¹H NMR(CDCl₃,400MHz,δppm)7.28-7.43(m,13H),7.02(s,2H), 4.24(d,J＝8.0Hz,1H),4.17(q,J＝7.3Hz,4H),3.93(d,J＝8.0Hz,1H), 3.26(m,1H),3.11(d,J＝6.6Hz,2H),2.85(m,1H),2.73(m,1H),2.43(t, J＝7.3Hz,6H).MS(ESI)m/z:580.21[M+H]⁺.

实施例6

化合物调控的小鼠肝癌TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)体外杀伤活性检测，具体方法如下。

建立H22肝癌荷瘤小鼠模型：复苏冻存的小鼠H22肝癌细胞；置于2mL含10％胎牛血清的RPMI1640完全培养基6孔板中，5％CO₂条件下37℃恒温培养箱中培养，达到对数生长期后进行计数，收集细胞，离心，调整细胞浓度；取0.2mL(约5×10⁶个肝癌细胞)，接种于雄性BALB/C小鼠前肢腋窝皮下，2周后游标卡尺测量成瘤平均直径约1.0cm。

肝癌TIL分离和培养：用颈椎脱臼法处死荷瘤小鼠，取出新鲜肿瘤组织样本，去除周围正常组织和坏死组织，PBS洗涤3次，用 RPMI1640培养液冲洗干净，将肿瘤组织剪碎，置于含有3600U DNA 酶、50U胶原酶和125U透明质酸酶的RPMI1640完全培养液40mL 中，室温下搅拌均匀，4℃过夜。用200目不锈钢滤网过滤，去除未消化的组织块，用Hank氏液洗涤，用淋巴细胞分离液制成2×10⁶/mL 左右的细胞悬液，梯度密度离心，吸取75％与100％分离液面之间富含TIL的白色细胞层，用Hank氏液洗涤，离心，用0.2％台盼兰染色计数活细胞，进行培养扩增。

检测化合物调控小鼠肝癌TIL体外杀伤活性：以TIL作为效应细胞，小鼠H22肝癌细胞为靶细胞。在96孔板中设空白对照孔(含5％胎牛血清的RPMI1640完全培养液200μL)、靶细胞孔(接种80μL 小鼠H22肝癌细胞，密度为2.5×10⁴/mL，效靶比为10：1加入80μL 效应细胞，密度为2.5×10⁵/mL)、实验孔(每孔除靶细胞孔操作，另加入40μL浓度为10mmol/L的不同化合物)，每孔设5个复孔，另设效应细胞对照孔，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养，置于37℃ 5％CO₂恒温培养箱中培养24h，倒置显微镜下观察。每孔加20μLMTT 溶液，继续培养4h，离心，吸去培养液，加入DMSO，以空白对照孔调零，在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔吸光值。

测定结果如下表所示。

表1：对实例中化合物进行编号。

结果显示，分离培养的TIL对小鼠H22肝癌细胞有明显抑制作用，杀伤率为(43.12±3.85)％，化合物1-3加入后，可增强TIL对肝癌细胞的杀伤作用，分别为(51.34±2.37)％、(49.24±3.15)％和 (53.60±2.04)％，与TIL组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，化合物4-5得到的杀伤率与TIL组相似，分别为(42.37±4.83)％和 (43.20±3.76)％，说明化合物1-3可体外调控肝癌浸润T细胞的活性，从而提高对肝癌细胞的杀伤率。

本发明合成的3,8-二氰基环丁烷联吡啶类化合物具有通过调控肝癌浸润T细胞的活性治疗肝癌的作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。