Wee1蛋白降解剂
技术领域
本发明属于化学领域。具体涉及一种WEE1蛋白降解剂。
背景技术
肿瘤细胞失控性增生是恶性肿瘤基本的生物学特征，涉及细胞周期调控机制及DNA损伤修复的细胞传导通路改变，相关研究指出，细胞周期调节蛋白与肿瘤发生密切相关。WEE1蛋白是一种细胞周期调节蛋白，作为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的重要成员之一，WEE1蛋白通过调控CDK1的磷酸化状态，影响其与CyclinB的结合阻滞G2期过渡到M期，进而确保DNA复制精准性和染色质完整性。因此，WEE1蛋白是参与细胞周期G2/M检查点和DNA损伤修复过程的关键蛋白激酶。另一方面，在正常细胞周期进程中，p53蛋白也可通过调控G1/S期和DNA损伤检查，监控基因组的完整性，但多数肿瘤细胞中p53基因缺失，导致其细胞周期G1/S检查点缺陷。因此，这些p53缺失的肿瘤细胞在DNA复制及损伤修复过程中更加依赖于G2/M检查点，使得WEE1蛋白激酶高表达。理论上，通过抑制WEE1蛋白激酶活性，这些p53缺失肿瘤细胞的DNA损伤不能及时修复便进入M期，造成基因组不稳定性和染色体缺失，引发有丝分裂灾难，导致肿瘤细胞凋亡。尽管AZD1775作为WEE1蛋白靶点抑制剂已经取得了一定的临床研究进展，但仍然存在一些应用限制包括明显的临床毒副作用，如恶心，乏力，血小板减少，以及靶向性不足等，如已被证明AZD1775具PLK1/WEE1双靶点抑制作用。
综上所述，本领域迫切需要开发一种高选择性的靶向WEE1蛋白的新药物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高选择性具有优异的抗肿瘤增殖活性的WEE1蛋白降解剂。
在本发明的第一方面，提供了一种如式V所示的化合物，或其药学上可接受的盐，或其立体异构体；
Y-L-MWEE1 (V)
其中，
MWEE1为能够与WEE1蛋白激酶结合的WEE1结合部分；
Y为E3泛素连接酶配体部分；以及
L为连接基团。
在另一优选例中，所述E3泛素连接酶配体部分能够与CRBN或CRL4CRBN结合。
在另一优选例中，所述E3泛素连接酶配体为CRBN配体或CRL4CRBNE3泛素连接酶配体。
在另一优选例中，Y为如式A所示的基团；
其中，
Z选自下组：C(＝O)、C(Ra)2、N(Rb)；
V1、V2、V3和V4之一为C，其余的各自独立地选自下组：C(Ra)和N；
R3选自下组：H、卤素、羟基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基；
Ra各自独立地选自下组：H、卤素、羟基、氰基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基；
Rb各自独立地选自下组：H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基；
Rd各自独立地选自下组：H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基；和
下标p1为0、1、2或3。
在另一优选例中，Ra为H。
在另一优选例中，R3为H。
在另一优选例中，Z为C(＝O)或C(Ra)2；较佳地，Z为C(＝O)或CH2。
在另一优选例中，V1、V2、V3和V4之一为C，其余均为CH。
在另一优选例中，V1为C且V2、V3和V4均为CH；或者，V2为C且V1、V3和V4均为CH；或者，V3为C且V1、V2和V4均为CH；或者，V4为C且V1、V2、和V3均为CH。
在另一优选例中，下标p1＝0。
在另一优选例中，Z、V1、V2、V3、V4、R3、Rd和p1各自独立地为表1中具体化合物中所对应的基团。
在另一优选例中，Y为如式A1、A2、A3或A4所示的基团；
各式中，Z、R3的定义如前所述。
在另一优选例中，Y为如式A1所示的基团。
在另一优选例中，Y为如式A1所示的基团，且其中，R3为H和/或Z为C(＝O)。。
在另一优选例中，Y为如式B所示的基团；
其中，
V1、V2、V3和V4之一为C，其余的各自独立地选自下组：C(Ra)和N；
V5和V7各自独立地选自下组：C(Ra)和N；
V6选自下组：C(R6)和N；
R6选自下组：H、氰基、C1-C6烷基(较佳地，C1-C4烷基)、C1-C6卤代烷基；
Ra各自独立地选自下组：H、卤素、羟基、氰基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基；
Rd各自独立地选自下组：H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基；和
下标p1＝0、1、2或3。
在另一优选例中，V1、V2、V3和V4之一为C，其余均为CH。
在另一优选例中，V1为C且V2、V3和V4均为CH；或者，V2为C且V1、V3和V4均为CH；或者，V3为C且V1、V2和V4均为CH；或者，V4为C且V1、V2、和V3均为CH。
在另一优选例中，V5和V7均为N。
在另一优选例中，V6为C(R6)且R6为C1-C6烷基(较佳地，C1-C4烷基)；较佳地，V6为C(CH3)。
在另一优选例中，下标p1＝0。
在另一优选例中，V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、Rd和下标p1各自独立地为表1中具体化合物中所对应的基团。
在另一优选例中，Y为如式B1所示的基团；
在另一优选例中，Y为如式C所示的基团；
其中，
R4选自下组：H、卤素、羟基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基；和
R5选自下组：H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基。
在另一优选例中，R4选自下组：羟基、C1-C6烷氧基。
在另一优选例中，R5选自下组：H、C1-C6烷基(较佳地，C1-C4烷基；更佳地，甲基)。
在另一优选例中，R4和R5各自独立地为表1中具体化合物中所对应的基团。
在另一优选例中，Y为如式C1或C2所示的基团；
各式中，R4的定义如前所述。
在另一优选例中，Y为如式C1所示的基团。
在另一优选例中，Y为如式C1所示的基团且R4为羟基。
在另一优选例中，L为如式D所示的连接基团
-(ML)s- (D)；
其中，
ML为各自独立地选自下组的结构单元：-C(Rc)2-、-C(Rc)2-C(Rc)2-O-、-C(Rc)2-C(Rc)2-S-、-O-、-S-、-N(Rn)-、-C(＝O)-、-N(Rn)C(＝O)-、-C(＝O)N(Rn)-、-N(Rn)C(＝O)N(Rn)-、-SO-、-SO2-、-CH＝CH-、-C≡C-、-C3-C8环烷基-、-4至7元杂环基-、-C6-C10芳基-、-5或6元杂芳基-；其中，所述环烷基、杂环基、芳基和杂芳基是未取代的或者任选地被一个或多个(较佳地，1、2、或3个)选自下组的取代基所取代的：卤素、CN、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基；
下标s为1～30的整数；较佳地，下标s为3～25的整数；更佳地，下标s为3～20的整数；
Rc各自独立地选自下组：H、羟基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C3-C5环烷基；和
Rn各自独立地选自下组：H、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C3-C5环烷基。
在另一优选例中，下标s＝3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14或15。
在另一优选例中，Rc为H。
在另一优选例中，Rn为H。
在另一优选例中，L为如式D1所示的连接基团：
-Q1-(C(Rc)2)n-W-(C(Rc)2)n-W-(C(Rc)2)m- (D1)
其中，
Q1选自下组：无(不存在)、-O-、-S-、-CH＝CH-、-C≡C-、-N(Rn)-、-N(Rn)C(＝O)-、-C(＝O)N(Rn)-和-N(Rn)C(＝O)N(Rn)-；
W各自独立地选自下组：无(不存在)、-N(Rn)C(＝O)-、-C(＝O)N(Rn)-；
下标n各自独立地为0、1、2、3、4、5、6、7或8；
下标m为0、1、2、3、4、5或6；
Rc和Rn如式D中定义。
在另一优选例中，下标m和各个n不同时为0。
在另一优选例中，Q1与Y连接。
在另一优选例中，Q1选自下组：无(不存在)、-O-、-CH＝CH-、-C≡C-、-NH-、-NHC(＝O)-和-NHC(＝O)NH-。
在另一优选例中，W各自独立地选自下组：无、-NHC(＝O)-、-C(＝O)NH-。
在另一优选例中，L为如式D1a所示的连接基团：
-Q1-(CH2)n-W-(CH2)n-W-(CH2)m- (D1a)
其中，Q1、下标m、W和下标n如式D1中定义。
在另一优选例中，Q1、Rn、Rc、W、下标m和下标n各自独立地为表1中具体化合物中所对应的基团。
在另一优选例中，L为如式D2所示的连接基团：
-Q2-[C(Rc)2-C(Rc)2-O]v-(C(Rc)2)o-W-(C(Rc)2)m- (D2)
其中，
Q2选自下组：-N(Rn)-、-N(Rn)C(＝O)-、-C(＝O)N(Rn)-和-N(Rn)C(＝O)N(Rn)-；
W选自下组：无(不存在)、-N(Rn)C(＝O)-、-C(＝O)N(Rn)-；
下标v为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
下标m为0、1、2、3、4、5或6；
下标o为1、2或3；
Rc和Rn如式D中定义。
在另一优选例中，下标v为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在另一优选例中，Q2与Y连接。
在另一优选例中，Q2选自下组：-NH-、-NHC(＝O)-和-NHC(＝O)NH-。
在另一优选例中，W选自下组：无、-NHC(＝O)-、-C(＝O)NH-。
在另一优选例中，L为如式D2a所示的连接基团：
-Q2-[CH2-CH2-O]v-(CH2)2-W-(CH2)m- (D2a)
其中，Q2、下标v、W和下标m如式D2中定义。
在另一优选例中，Q2、Rn、Rc、W、下标v、下标o和下标m各自独立地为表1中具体化合物中所对应的基团。
在另一优选例中，L为如式D3所示的连接基团：
-Q3-(C(Rc)2)r1-Ar1-(C(Rc)2)r2-U-(C(Rc)2)n-W-(C(Rc)2)m- (D3)
其中，
Q3选自下组：-N(Rn)-、-O-和-S-；
Ar1选自下组：-C3-C8环烷基-、4至7元杂环基-、-C6-C10芳基-、-5或6元杂芳基-；
W选自下组：无(不存在)、-N(Rn)C(＝O)-、-C(＝O)N(Rn)-；
U选自下组：-N(Rn)C(＝O)-、-C(＝O)N(Rn)-；
下标n为0、1、2、3、4、5、6、7或8；
下标m为0、1、2、3、4、5或6；
下标r1和下标r2各自独立地为0、1或2；
Rc和Rn如式D中定义。
在另一优选例中，-(C(Rc)2)r2-U-为-C(＝O)N(Rn)-或-(C(Rc)2)-N(Rn)C(＝O)-。
在另一优选例中，-(C(Rc)2)r2-U-为-C(＝O)NH或-(C(Rc)2)-NHC(＝O)-。
在另一优选例中，Q3与Y连接。
在另一优选例中，Q3选自下组：-NH-和-O-。
在另一优选例中，Ar1选自下组：-C6-C10芳基-、-5或6元杂芳基-。
在另一优选例中，L为如式D3a所示的连接基团：
-Q3-(CH2)-Ph-(CH2)r2-U-(CH2)n-W-(CH2)m- (D3a)
其中，Ph为苯基，r2为0或1；且Q3、U、下标m、W和下标n如式D3中定义。
在另一优选例中，Q3、W、U、Ar1、Rn、Rc、下标r1、下标r2、下标m和下标n各自独立地为表1中具体化合物中所对应的基团。
在另一优选例中，L为如式D1所示的连接基团。
在另一优选例中，L为如式D1a所示的连接基团。
在另一优选例中，L为如式D1或D1a所示的连接基团，且Q1为NH。
在另一优选例中，L为如式D1或D1a所示的连接基团，且W均为无。
在另一优选例中，L为如式D1或D1a所示的连接基团，且W均为无、下标m为0，下标n之一为0，另一个下标n为1、2、3、4、5、6、7或8。在另一优选例中，L为-NH-(CH2)n-。
在另一优选例中，MWEE1为衍生自WEE1激酶抑制剂的WEE1结合部分。
在另一优选例中，MWEE1为衍生自选自下组化合物的WEE1结合部分：AZD1775。
在另一优选例中，MWEE1如式E所示：
其中，
Cy1选自下组：取代或未取代的C6-C10环烷基、取代或未取代的5至10元杂环烷基(较佳地，5或6元杂环烷基)；
Cy2选自下组：取代或未取代的C6-C10芳基、取代或未取代的5至10元杂芳基(较佳地，5或6元杂芳基)；
Rb各自独立地选自下组：H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基；
Rd各自独立地选自下组：H、卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基；和
下标p2为0、1、2或3；
R1选自下组：取代或未取代的C1-C6烷基(较佳地，C1-C4烷基)、取代或未取代的C1-C6烯基(较佳地，C1-C4烯基)、取代或未取代的C1-C6炔基(较佳地，C1-C4炔基)、取代或未取代的苄基；
R2选自下组：H、卤素、取代或未取代的C1-C6烷基(较佳地，C1-C4烷基)、取代或未取代的C1-C6烷氧基(较佳地，C1-C4烷氧基)、取代或未取代的C6-C10芳基；
X选自下组：C(Ra)和N；
Ra选自下组：H、卤素、羟基、氰基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基；
除非特别说明，所述的取代是指基团上一个或多个(较佳地，1、2、3、4或5个)氢被选自下组的取代基所取代：羟基、卤素(较佳地，F、Cl、Br)、CN、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基。
在另一优选例中，X为N。
在另一优选例中，下标p2为0。
在另一优选例中，Cy2为C6-C10芳基；较佳地，为苯基。
在另一优选例中，Cy1为含至少一个N杂原子的5至10元杂环烷基。
在另一优选例中，Cy1为其中，*与Cy2连接。
在另一优选例中，R1为取代或未取代的C1-C6烯基；较佳地，为取代或未取代的C1-C4烯基；更佳地，R1选自：-CH2CH＝CH2、-CH2CH2CH＝CH2、-CH(CH3)CH＝CH2、-CH2CH＝CH(CH3)、-CH2CH＝C(CH3)2。
在另一优选例中，R2选自下组：H、卤素、C1-C4烷基(较佳地，甲基)、C1-C4烷氧基(较佳地，甲氧基)、C1-C4卤代烷基(较佳地，三氟甲基)、羟基取代的C1-C4烷基(较佳地，-C(CH3)2OH)，取代或未取代的苯基。
在另一优选例中，Cy1、Cy2、R1、R2、Rb、Rd、X、和下标p2各自独立地为表1中具体化合物中所对应的基团。
在另一优选例中，MWEE1为E1所示基团；
在本发明的第二方面，提供了一种如式I所示的化合物；
其中，R1、R2、Y和L如式V中定义。
在另一优选例中，Y为如式A所示的基团；较佳地，Y为如式A1所示的基团。
在另一优选例中，Y为如式A1所示的基团，且其中，R3为H和/或Z为C(＝O)。
在另一优选例中，Y为如式A或式A1所示的基团时，L为如式D1所示的连接基团；较佳地，为如式D1a所示的连接基团。
在另一优选例中，Y为如式A或式A1所示的基团时，L为如式D1a所示的连接基团，且式D1a中Q1为-NH-，进一步地式D1a中W均为无，更进一步地，式D1a中，下标m为0，下标n之一为0，另一个下标n为1、2、3、4、5、6、7或8。
在另一优选例中，Y为如式A或式A1所示的基团时，L为-NH-(CH2)n-。
在另一优选例中，所述的化合物如式III所示；
其中，n为1、2、3、4、5、6、7或8。
在另一优选例中，Y为如式C所示的基团；较佳地，Y为如式C1所示的基团。
在另一优选例中，Y为如式C1所示的基团，且其中，R4为羟基。
在另一优选例中，Y为如式C或式C1所示的基团时，L为如式D1所示的连接基团；较佳地，为如式D1a所示的连接基团。
在另一优选例中，Y为如式C或式C1所示的基团时，L为如式D1a所示的连接基团，且式D1a中Q1为-NHC(＝O)-，进一步地式D1a中W均为无，更进一步地式D1a中m均为0。
在另一优选例中，Y为如式C或式C1所示的基团时，L为-NHC(＝O)-(CH2)n-。
在另一优选例中，所述的化合物如式IV所示；
其中，n为1、2、3、4、5、6、7或8。
在另一优选例中，Y为如式A所示的基团(较佳地，如式A1所示的基团)，并且L为如式D1所示的连接基团(较佳地，为如式D1a所示的连接基团)。
在另一优选例中，所述的化合物选自表1中的化合物。
在另一优选例中，所述的化合物选自表1中化合物1-22和化合物25-48；较佳地，选自表1中化合物1-18和化合物25-28；更佳地，选自表1中化合物1-3。
在另一优选例中，所述的化合物为表1中的化合物2；
在本发明的第三方面，提供了一种组合物，所述组合物包括(i)如第一方面或第二方面所述的化合物，或其药学上可接受的盐，或其立体异构体；和(ii)药学上接受的载体。
在本发明的第四方面，提供了如第一方面或第二方面所述的化合物，或其药学上可接受的盐，或其立体异构体，或如第三方面所述的组合物，在制备用于治疗和/或预防由WEE1蛋白介导的疾病或病症的药物中的用途。
在另一优选例中，所述WEE1蛋白介导的疾病或病症为癌症。
在另一优选例中，所述WEE1蛋白介导的疾病或病症选自下组：淋巴瘤、骨肉瘤、神经母细胞瘤、恶性胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌、头颈癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、皮肤癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、白血病。
在本发明的第五方面，提供了一种治疗或预防由WEE1蛋白介导的疾病或病症的方法，包括步骤：向需要的对象施用安全有效量的如第一方面或第二方面所述的化合物，或如第三方面所述的组合物。
在另一优选例中，所述的对象为哺乳动物，较佳地，为人。
在本发明的第六方面，一种降解WEE1蛋白的方法，包括步骤：使对象与如第一方面或第二方面所述的化合物接触，从而使WEE1蛋白降解。
在另一优选例中，所述的方法是体外非治疗性的。
在另一优选例中，所述的对象为细胞系。
在另一优选例中，所述的对象为MV-4-11细胞系。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是化合物1-24在IC50浓度作用于MV-4-11肿瘤细胞系，诱导WEE1蛋白降解的免疫印迹实验图示。
图2是化合物2在不同浓度梯度作用于MV-4-11肿瘤细胞系，诱导WEE1蛋白降解的免疫印迹实验图示。
图3是化合物2在不同时间梯度作用于MV-4-11肿瘤细胞系，诱导WEE1蛋白降解的免疫印迹实验图示。
图4是通过蛋白竞争结合，验证化合物2依赖于“WEE1蛋白-化合物2-CRBN蛋白”三元复合物形成诱导WEE1蛋白降解的免疫印迹实验图示。
图5是化合物2诱导WEE1蛋白降解而非诱导WEE1表达mRNA降解的条形图。
图6是化合物2诱导MV-4-11肿瘤细胞系周期阻滞的条形图。
图7是化合物2诱导MV-4-11肿瘤细胞系凋亡的条形图。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入地研究。意外地发现将WEE1靶点药物通过连接基团(L)与E3连接酶配体(尤其是与如式A所示的E3连接酶配体部分)所形成的新颖化合物，意外地克服了现有WEE1靶点药物(如WEE1蛋白激酶抑制剂)靶向选择性性不足的缺陷。此外，本发明的化合物还能够高效地降解WEE1蛋白并具有优异的抗肿瘤增殖活性。基于此，发明人完成了本发明。
术语
除非另有表述，术语“卤代”或“卤素”本身或作为另一取代基的一部分是指氟、氯、溴、或碘原子。此外，诸如“卤代烷基”等术语表示包括单卤代烷基或多卤代烷基。例如，术语“C1-C6卤代烷基”或“C1-C4卤代烷基”包括例如三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
如本文所用，“C1-C6烷基”是指包括1-6个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、或类似基团。类似地，C1-C4烷基是指包括1-4个碳原子的直链或支链的烷基。
如本文所用，“C1-C6烷氧基”包括1-6个碳原子的直链或支链的烷氧基。例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、或类似基团。
如本文所用，“环烷基”是指包含指定碳原子数的饱和环烃基(包括单环、双环，如并环等)，例如“C3-C6环烷基”是指含3-6个碳原子的环烷基，“C6-C10环烷基”包括，环烷基的例子包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、或类似基团。类似地，如本文所用，术语“杂环烷基”是指环烷基中环上的一个或多个(如1、2、3或4个)碳原子被杂原子(如O、S或N)所替换所形成的基团。
术语“烯基”指具有一个或多个双键的不饱和烷基。类似地，术语“炔基”指具有一个或多个三键的不饱和烷基。不饱和烷基的例子包括：乙烯基、2-丙烯基、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和更高级的同系物和异构体。
术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指衍生自烷烃的二价基团，例如-CH2CH2CH2CH2-。除非另有定义，烷基(或亚烷基)通常具有1-24个碳原子，其中本发明优选具有10个或更少碳原子的那些基团。
除非另有定义，术语“芳基”表示多不饱和的(通常芳香性)的烃基，其可以是单环或稠合在一起或共价连接的多环(最多三环，较佳地双环或单环)。术语"杂芳基"是指含有1至5个杂原子(例如选自N、O、和S)的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选被氧化，氮原子任选被季铵化。杂芳基可通过杂原子连接于分子的其余部分。芳基的非限制性例子包括苯基、萘基和联苯基，而杂芳基的非限制性例子包括吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、嘧啶基、三嗪基、喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、酞嗪基、苯并三嗪基(benzotriazinyl)、嘌呤基、苯并咪唑基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、异苯并呋喃基(isobenzofuryl)、异吲哚基、中氮茚基、苯并三嗪基、噻吩并吡啶基、噻吩并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、咪唑并吡啶、苯并噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、异噻唑基、吡唑基、吲唑基、蝶啶基、咪唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、吡咯基、噻唑基、呋喃基、噻吩基等等。在本文中除非另有限定，“芳基”或“杂芳基”还能任选地被选自下组的取代基所取代：卤素、氰基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C6环烷基。
如本文所用，术语“杂原子”意在包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)；较佳地，包括O、N和S。
对于本文提供的化合物，从取代基(通常为R基团)到芳香环(例如苯，吡啶等)或环烷基等的中心的键将被理解为是指在芳香环或烷基环的任何可用顶点提供连接的键。
靶向蛋白降解嵌合体技术(PROTACs)
靶向蛋白降解嵌合体技术(PROTACs)通过泛素化-蛋白酶体途径靶向诱导蛋白降解，开创了一种新的治疗方式，近年来已经成为新药研发的热门领域。PROTACs分子是由Linker将目标蛋白配体与E3泛素连接酶配体连接起来形成的双功能小分子，其可以同时结合目标蛋白和E3泛素连接酶，使得目标蛋白与E3泛素连接酶靠近而被泛素化标记，进而被细胞内的蛋白酶体识别并降解。
WEE1蛋白激酶降解剂
现有WEE1靶点的治疗药物都是小分子激酶抑制剂，其通过占据WEE1蛋白(或称为WEE1蛋白激酶)的活性位点来抑制WEE1蛋白功能达到治疗疾病的目的，不同于此，本发明提供的式I化合物是一类WEE1蛋白降解剂，基于泛素化-蛋白酶体途径的降解作用机制，发展了一种新的治疗模式用于WEE1靶点疾病。而且本发明的式I化合物不仅具有优异的WEE1蛋白的降解能力，而且还能够选择性地选择性降解WEE1蛋白，并且不降解其他蛋白例如PLK蛋白，克服了现有WEE1蛋白激酶抑制剂靶向性不足的应用限制，如WEE1蛋白激酶抑制剂AZD1775对PLK蛋白作用引起的临床毒副作用。
典型地，本发明提供了一类WEE1蛋白降解剂，如式V所示
Y-L-MWEE1 (V)
其中，MWEE1、Y和L如第一方面中定义。
在一个具体实施方案中，本发明提供了一类WEE1蛋白降解剂，如式I所示：
或其药学上可接受的盐或立体异构体，
其中，
R1选自：取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C1-C4烯基、取代或未取代的C2-C4炔基、取代或未取代的苄基；
R2选自：氢、卤素(F、Cl、Br、I)、C1-C4烷基(如甲基)、C1-C4烷氧基(如甲氧基)、C1-C4卤代烷基(如三氟甲基)、羟基取代的C1-C4烷基(如叔丁醇(-C(CH3)2OH))，取代或未取代的苯基；
Y选自：
其中，Z选自：-CH2-和-C(＝O)-；R3选自：氢、卤素、甲基和羟基；R4选自：氢、卤素、甲基和羟基；
L为选自下组的连接基团；
-Q1-(CH2)n-W-(CH2)n-W-(CH2)m-；
-Q2-[CH2-CH2-O]v-(CH2)2-W-(CH2)m-；
-Q3-(CH2)-Ph-(CH2)r2-U-(CH2)n-W-(CH2)m-；
其中，
Q1选自：-O-、C2烯基(-CH＝CH-)、C2炔基(-C≡C-)、-NH-、-NHC(＝O)-和-NHC(＝O)-NH-，或者Q1不存在；
Q2选自：-O-、-NH-、-NHC(＝O)-和-NHC(＝O)NH-；
Q3选自：-O-和-NH-；
W(各自独立地)选自：-NHC(＝O)-和-C(＝O)NH-，或者W不存在；
U选自：-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-；且r2为0或1；n是0、1、2、3、4、5、6、7或8；m是0、1、2、3、4、5或6；v是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一个具体实施方案中，所述化合物如式II所示：
在一个具体实施方案中，Y为
优选地，R3是氢。优选地，Z是-C(＝O)-。
优选地，L是-Q1-(CH2)n-W-(CH2)n-W-(CH2)m-。优选地，Q1是-NH-。优选地，W不存在。优选地，n之一为0和m是0。
优选地，所述化合物如式III所示：
优选地，式III化合物具有如下结构式：
在另一个具体实施方案中，Y是
优选地，R4是羟基。
优选地，L是-Q1-(CH2)n-W-(CH2)n-W-(CH2)m-。优选地，Q1是-NH-C(＝O)-。优选地，W不存在。优选地，n之一为0和m是0。
优选地，所述的化合物具有式IV：
优选地，式IV化合物具有如下结构式：
在另一个具体实施方案中，本发明的化合物实例包括，但不限于表1所列化合物的任意一种或多种：
表1
活性成分
如本文所用，术语“本发明的化合物”或“本发明的降解剂”或“WEE1蛋白降解剂”可以互换使用，是指如式I所示的化合物(或降解剂)。该术语还包括式I化合物的各种晶型形式、药学上可接受的盐或水合物或溶剂合物。
其中，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸；甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸等有机酸；以及脯氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸。另一类优选的盐是本发明化合物与碱形成的盐，例如碱金属盐(例如钠盐或钾盐)、碱土金属盐(例如镁盐或钙盐)、铵盐(如低级的烷醇铵盐以及其它药学上可接受的胺盐)，例如甲胺盐、乙胺盐、丙胺盐、二甲基胺盐、三甲基胺盐、二乙基胺盐、三乙基胺盐、叔丁基胺盐、乙二胺盐、羟乙胺盐、二羟乙胺盐、三羟乙胺盐，以及分别由吗啉、哌嗪、赖氨酸形成的胺盐。
术语“溶剂合物”指本发明化合物与溶剂分子配位形成特定比例的配合物。“水合物”是指本发明化合物与水进行配位形成的配合物。
此外，本发明化合物还包括式I所示的化合物的前药。术语“前药”包括其本身可以是具有生物学活性的或非活性的，当用适当的方法服用后，其在人体内进行代谢或化学反应而转变成式I的一类化合物，或式I的一个化合物所组成的盐或溶液。所述的前药包括(但不局限于)所述化合物的羧酸酯、碳酸酯、磷酸酯、硝酸酯、硫酸酯、砜酯、亚砜酯、氨基化合物、氨基甲酸盐、偶氮化合物、磷酰胺、葡萄糖苷、醚、乙缩醛等形式。
制备方法
下面更具体地描述本发明式I或式V化合物的制备方法，但这些具体方法不对本发明构成任何限制。本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便地制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易地进行。通常，在制备流程中，各反应通常在惰性溶剂中，在室温至回流温度(如0℃～200℃，优选0℃～120℃)下进行。反应时间通常为0.1小时-60小时，较佳地为0.5-48小时。一般地，用于合成本发明第一或第二方面表示的化合物的方法包括2个主要步骤，即：步骤(i)Y片段和L片段的连接以得到Y-L片段，或L片段和Mwee1片段的连接以得到L-Mwee片段，或Y片段和L1片段以及L2片段和Mwee1片段的连接以分别得到Y-L1片段和L2-Mwee1片段，以及步骤(ii)Y-L片段和Mwee1片段的连接，或Y片段和L-Mwee1片段的连接，或Y-L1片段和L2-Mwee1片段的连接；其中，Y片段是指与L片段或L-Mwee1片段反应后能够形成如第一方面所述E3泛素连接酶配体部分(Y-)的化合物；L是指与Y片段和Mwee1片段反应后形成如第一方面所述的连接基团(-L-)的化合物，L1片段和L2片段是指分别与Y片段和Mwee1片段反应后，并互相偶联后能共同形成如第一方面所述的连接基团(-L-)的化合物，Mwee1片段是指与L片段或Y-L片段反应后能够形成如第一方面所述WEE1结合部分(-MWEE1)的化合物。各片段可以是已修饰的或未修饰的，可以是被保护基团保护的(如Boc)或未保护的。例如，
Y片段可为Mwee1片段可为L、L1和L2片段可各自独立地为BocNH-(CH2)2-(OCH2CH2)v-NH2、BocNH-(CH2)n-COOH、Br-(CH2)n-COOH；其中，n和v如上定义。
这些片段在脱去保护基(例如通过常规方法或说明书中记载的方法脱保护)和/或进行修饰或替换活性基团后，可根据说明书中记载的方法或其他常规方法与其余片段偶联从而得到第一方面或第二方面所述的化合物。
药物组合物和施用方法
由于本发明化合物具有优异的选择性WEE1蛋白的降解活性，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解由与WEE1蛋白介导的疾病。根据现有技术，本发明化合物可用于治疗以下疾病：癌症等，尤其是例如：淋巴瘤、骨肉瘤、神经母细胞瘤、恶性胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌、头颈癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、皮肤癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、白血病。
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有10-500mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
如本文所用，术语“药学上可接受的”成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。
“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括
(a)选择性好，本发明的化合物对PLK蛋白无降解作用。
(b)具有优异的抗肿瘤增殖效果。本发明的优选化合物甚至具有优于阳性对照双靶点抑制AZD1775的抗肿瘤增殖能力。
(c)本发明的化合物具有WEE1蛋白的优异的降解能力。
(d)本发明的化合物能够有效诱导肿瘤细胞凋亡。
总的来说，本发明申请提供的WEE1蛋白降解剂(式I化合物)，可选择性降解WEE1蛋白而不降解例如PLK蛋白，相比于现有的WEE1激酶抑制剂，如AZD1775(PLK1/WEE1双靶点抑制作用)，具有更好的靶点选择性，避免了脱靶效应所引起的临床毒副作用。另一方面，基于PROTAC技术的WEE1蛋白降解剂具有催化效应，使得其在临床治疗上具备低剂量给药，药效作用长的潜在优势。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非特别说明，实施例中所用的原料或试剂均可通过市售获得。
实施例1：中间体S15的合成路线
步骤1：化合物S3的合成
化合物S1(10.0g,67.5mmol)和化合物S2(9.40g,70.9mmol)加入到110mL的甲苯溶液中，反应体系升温至回流，反应18小时。检测反应完成后，冷却至室温，过滤，正己烷洗涤，收集白色固体产物，旋干得到化合物S3(16.1g,91％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.87(s,1H),7.95(d,J＝3.2Hz,4H),1.45(s,9H)。
步骤2：化合物S5的合成
化合物S3(16.1g,61.2mmol)，碳酸钾(16.1g,116mmol)和苄基三乙基氯化铵(1.39g,6.12mmol)加入到110mL的乙腈溶剂中搅拌5分钟，然后化合物S4(8mL,91.8mmol)加入反应体系中，室温反应18小时。检测反应完成后，向体系中加入100mL的水,乙酸乙酯萃取三次，合并有机相并用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并旋干得黄色油状粗品。粗品加入到正己烷溶液中，冷却至5℃，析出固体。过滤，正己烷洗涤，收集白色固体产物，旋干得到化合物S5(15.7g,85％收率)。
步骤3：化合物S6的合成
冰浴下，甲基肼(3.40mL,64.3mmol)加入到溶有化合物S5(15.6g,51.5mmol)的100mL的四氢呋喃溶液中，加毕，撤去冰浴，室温下反应18小时。过滤，收集滤液并旋干得油状粗产品。粗产品加入到正己烷，白色固体析出，过滤收集滤液并旋干，重复相同的操作三次至无固体析出，旋干得到黄色油状液体产物S6(8.47g,96％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ5.90-5.66(m,1H),5.16-
4.99(m,2H),4.46(s,2H),3.99-3.76(m,2H),1.40(s,9H)。
步骤4：化合物S8的合成
DIPEA(20.8mL，120mmol)和化合物S6(8.23g,47.8mmol)加入到溶有化合物S7(11.1g,47.8mmol)的100mL四氢呋喃溶液中，升温至回流反应72小时。反应完成后，减压旋去四氢呋喃溶剂，向体系中加入50mL的乙醚，有固体析出。过滤收集滤液，旋干，冷却至0℃，加入40mL的TFA，加毕，升至室温反应1小时，然后升至70℃反应1小时。经减压旋去反应体系的溶剂，加入50mL的乙醇,冷却至0℃并在此温度下加入75mL的6M氢氧化钠溶液，加毕，升至室温反应15分钟。反应完成后，向体系中加入40mL的浓盐酸，有黄色固体析出。减压旋去体系中的溶剂，加入100mL的氯仿和100mL的水溶液，萃取收集有机相并用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤收集滤液，真空浓缩得到油状粗产品，粗品加入到正己烷中，有黄色固体析出。过滤，分别用乙醇和乙醚洗涤，收集黄色固体产物，旋干得到化合物S8(5.44g,51％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.75(s,1H),8.68(s,1H),5.87(ddd,J＝15.6,10.1,5.0Hz,1H),5.29-4.91(m,2H),4.38(d,J＝4.3Hz,2H),2.53(s,3H)。
步骤5：化合物S10的合成
化合物S8(900mg,4.05mmol)、化合物S9(1.14g,5.27mmol)和二甲基乙二胺(1mL)依次加入到10mL的1，4-二氧六环溶液中，待体系充分溶解后，向反应体系中加入碳酸钾(1.12g,8.1mmol)和碘化亚铜(770mg,4.05mmol)，升温至90℃，反应18小时。反应完成后，冷却至室温，加入20mL的氨水溶液，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到固体化合物S10(1.04g,72％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.96(s,1H),7.93(t,J＝7.9Hz,1H),7.78(dd,J＝8.1,0.7Hz,1H),7.42(dd,J＝7.7,0.8Hz,1H),5.71(ddt,J＝16.4,10.2,6.2Hz,1H),5.07(dd,J＝10.2,1.1Hz,1H),4.95(dq,J＝17.0,1.3Hz,1H),4.82(dt,J＝6.2,1.2Hz,2H),3.82(s,1H),2.60(s,3H),1.60(s,6H)。
步骤6：化合物S12的合成
化合物S10(2.23g,6.24mmol)加入到60mL的甲苯溶液中，然后加入m-CPBA(1.18g,6.86mmol)，室温搅拌1小时，溶液呈黄绿色。DIPEA(5mL)和化合物S11(1.9g,6.86mmol)加入到反应体系中，室温反应18小时。反应完成，加入乙酸乙酯萃取，收集有机相，饱和碳酸氢钠和饱和食盐水依次洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S12(1.98g,54％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.84(s,1H),8.10-7.99(m,1H),7.76(d,J＝7.9Hz,1H),7.65-7.56(m,3H),6.96(d,J＝8.8Hz,2H),5.67(dq,J＝10.6,5.9Hz,1H),5.35(s,1H),5.00(d,J＝10.2Hz,1H),4.83(d,J＝17.2Hz,1H),4.69(d,J＝4.9Hz,2H),3.47(s,4H),3.06(s,4H),2.88(s,1H),1.47(s,6H),1.43(s,9H)。
步骤7：化合物S13的合成
化合物S12(1g,1.70mmol)加入到2mL TFA与4mL二氯甲烷的混合溶剂中，室温反应两小时。反应完成，减压旋去溶剂得到化合物S13，无需进一步纯化，直接投下一步。
步骤8：化合物S14的合成
化合物S13(820mg,1.69mmol)和溴乙酸叔丁酯(300uL)加入到5mL的DMF溶液中，待体系全溶后，加入碳酸钾(466mg,3.88mmol)，升温至60℃反应6小时。反应完成后，加入10mL的水，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S14(648mg,64％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.83(s,1H),8.06(t,J＝7.3Hz,1H),7.76(d,J＝7.8Hz,1H),7.67-7.50(m,3H),6.93(d,J＝8.9Hz,2H),5.67(ddt,J＝16.3,10.3,6.0Hz,1H),5.34(s,1H),5.00(dd,J＝10.2,0.8Hz,1H),4.83(dd,J＝17.1,1.0Hz,1H),4.69(d,J＝5.3Hz,2H),3.17(s,2H),3.11(s,4H),2.66(s,4H),1.47(s,6H),1.43(s,9H)。
步骤9：化合物S15的合成
化合物S14(600mg,1mmol)加入到1mL TFA与2mL二氯甲烷的混合溶剂中，室温反应两小时。反应完成，减压旋去溶剂得到化合物S15，无需进一步纯化，直接投下一步。
实施例2：化合物1-3的通用合成路线
化合物1的合成路线：
步骤1：化合物S18的合成
化合物S13(250mg,0.51mmol)和S17(148mg,0.62mmol)加入到10mL的DMF溶液中，待体系全溶后，加入碳酸钾(141mg,1.02mmol)，升温至60℃反应6小时。反应完成后，加入100mL的水，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S18(220mg,67％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.17(s,1H),8.83(d,J＝1.0Hz,1H),8.05(s,1H),7.75(d,J＝7.3Hz,1H),7.65-7.46(m,3H),6.92(d,J＝7.6Hz,2H),6.83(s,1H),5.66(dd,J＝14.5,8.9Hz,1H),5.33(s,1H),4.99(d,J＝10.2Hz,1H),4.82(d,J＝17.1Hz,1H),4.72-4.63(m,2H),3.16-3.02(m,4H),2.94(t,J＝12.5Hz,2H),2.50(s,4H),2.37-2.23(m,2H),1.59(t,J＝12.0Hz,2H),1.46(s,6H),1.38(s,9H)。
步骤2：化合物S19的合成
化合物S18(150mg,0.23mmol)加入到1mL TFA与2mL二氯甲烷的混合溶剂中，室温反应两小时。反应完成，减压旋去溶剂得到化合物S19，无需进一步纯化，直接投下一步。
步骤3：化合物1的合成
化合物S16(56mg,0.20mmol)和S19(100mg,0.18mmol)加入到3mL的DMF溶液中，氮气保护下加入DIPEA(70uL)，反应体系升温至90℃，反应12小时。反应完成后，向体系中加入30mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物1(98mg,68％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.09(s,1H),10.17(s,1H),8.83(s,1H),8.10-8.00(m,1H),7.75(d,J＝7.6Hz,1H),7.70-7.47(m,4H),7.16(d,J＝8.4Hz,1H),7.11-6.86(m,3H),6.79(t,J＝5.4Hz,1H),5.67(ddd,J＝17.1,10.8,5.9Hz,1H),5.34(s,1H),5.09-4.95(m,2H),4.82(d,J＝16.9Hz,1H),4.74-4.59(m,2H),3.53-3.34(m,4H),3.28-3.03(m,4H),2.94-2.79(m,1H),2.49-2.31(m,3H),2.01-1.94(m,1H),1.89-1.67(m,2H),1.46(s,6H)。HRMS(ESI)m/z计算值C42H45N11O6[M+H]+：800.3633，实测值：800.3650。
化合物2的合成：具体步骤如化合物1合成实施例。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.10(s,1H),10.15(s,1H),8.83(s,1H),8.05(s,1H),7.76(d,J＝7.3Hz,1H),7.70-7.49(m,4H),7.14(d,J＝8.3Hz,1H),7.03(d,J＝6.7Hz,1H),6.92(d,J＝8.0Hz,2H),6.59(s,1H),5.67(dd,J＝16.5,9.7Hz,1H),5.32(s,1H),5.06(dd,J＝12.6,2.9Hz,1H),5.00(d,J＝10.1Hz,1H),4.83(d,J＝17.0Hz,1H),4.69(d,J＝1.3Hz,2H),3.41-3.33(m,4H),3.20-3.00(m,4H),2.89(t,J＝14.6Hz,1H),2.65-2.52(m,3H),2.43-2.30(m,2H),2.08-1.99(m,1H),1.70-1.51(m,4H),1.47(s,6H)。HRMS(ESI)m/z计算值C43H47N11O6[M+H]+：814.3789，实测值：814.3760。
化合物3的合成：具体步骤如化合物1合成实施例。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.10(s,1H),10.16(s,1H),8.83(s,1H),8.09-7.98(m,1H),7.76(d,J＝6.1Hz,1H),7.69-7.47(m,4H),7.11(d,J＝8.3Hz,1H),7.03(d,J＝6.6Hz,1H),6.91(d,J＝7.6Hz,2H),6.55(s,1H),5.67(dd,J＝14.7,7.9Hz,1H),5.33(s,1H),5.02(dd,J＝22.6,9.4Hz,2H),4.83(d,J＝17.0Hz,1H),4.69(s,2H),3.34-3.24(m,4H),3.18-3.00(m,4H),2.88(t,J＝14.0Hz,1H),2.62-2.52(m,2H),2.37-2.25(m,2H),2.05-1.98(m,1H),1.67-1.55(m,2H),1.55-1.43(m,8H),1.40-1.32(m,2H)。HRMS(ESI)m/z计算值C44H49N11O6[M+H]+：828.3946，实测值：828.3923。
实施例3：化合物4-7的通用合成路线
化合物4的合成路线：
步骤1：化合物S21的合成
化合物S16(1g,3.62mmol)和S20(630mg,3.62mmol)加入到10mL的DMF溶液中，氮气保护下加入DIPEA(1.5mL)，反应体系升温至90℃，反应12小时。反应完成后，向体系中加入100mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S21(1.17g,75％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.09(s,1H),7.57(t,J＝7.3Hz,1H),7.08(d,J＝8.4Hz,1H),7.02(d,J＝6.6Hz,1H),6.91(s,1H),6.66(s,1H),5.05(d,J＝9.1Hz,1H),3.29(t,J＝12.3Hz,2H),3.00(d,J＝4.4Hz,2H),2.89(t,J＝15.1Hz,1H),2.64-2.53(m,2H),2.09-1.96(m,1H),1.72-1.59(m,2H),1.38(s,9H)。
步骤2：化合物S22的合成
化合物S21(200mg,0.47mmol)加入到2mL TFA与4mL二氯甲烷的混合溶剂中，室温反应两小时。反应完成，减压旋去溶剂得到化合物S22，无需进一步纯化，直接投下一步。
步骤3：化合物4的合成
化合物S15(163mg,0.30mmol)和化合物S22(100mg,0.30mmol)加入到5mL的DMF中，搅拌溶解后加入HATU(230mg,0.60mmol)和DIPEA(200uL)，室温反应两小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物4(156mg,61％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.11(s,1H),10.18(s,1H),8.84(s,1H),8.18-7.99(m,2H),7.76(d,J＝7.4Hz,1H),7.67-7.48(m,4H),7.10(d,J＝8.6Hz,1H),7.03(d,J＝6.8Hz,1H),6.94(d,J＝8.0Hz,2H),6.75(s,1H),5.67(dd,J＝16.4,10.0Hz,1H),5.34(s,1H),5.07(d,J＝10.9Hz,1H),5.00(d,J＝10.0Hz,1H),4.83(d,J＝17.0Hz,1H),4.69(d,J＝1.2Hz,2H),3.49-3.27(m,6H),2.89(t,J＝14.8Hz,1H),2.85-2.65(m,4H),2.65-2.53(m,2H),2.09-1.97(m,1H),1.73(s,2H),1.47(s,6H),1.31-1.18(m,2H)。HRMS(ESI)m/z计算值C44H48N12O7[M+H]+：857.3847，实测值：857.3856。
化合物5的合成：具体步骤如化合物4合成实施例。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.10(s,1H),10.17(s,1H),8.84(s,1H),8.05(s,1H),7.90(s,1H),7.76(d,J＝7.0Hz,1H),7.68-7.52(m,4H),7.12(d,J＝8.4Hz,1H),7.02(d,J＝6.7Hz,1H),6.92(d,J＝8.0Hz,2H),6.58(s,1H),5.67(dd,J＝15.9,9.5Hz,1H),5.34(s,1H),5.03(dd,J＝21.8,10.1Hz,2H),4.83(d,J＝17.0Hz,1H),4.76-4.61(m,2H),3.43-3.34(m,2H),3.24-3.06(m,8H),2.88(t,J＝13.2Hz,1H),2.70-2.55(m,5H),2.07-1.95(m,1H),1.67-1.44(m,10H)。HRMS(ESI)m/z计算值C45H50N12O7[M+Na]+：893.3823，实测值：893.3845。
化合物6的合成：具体步骤如化合物4合成实施例。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.10(s,1H),10.15(s,1H),8.83(s,1H),8.05(t,J＝6.8Hz,1H),7.85-7.72(m,2H),7.67-7.51(m,4H),7.10(d,J＝8.4Hz,1H),7.02(d,J＝6.8Hz,1H),6.92(d,J＝8.1Hz,2H),6.60-6.48(m,1H),5.67(ddt,J＝16.0,10.7,5.2Hz,1H),5.33(s,1H),5.11-4.93(m,2H),4.84(d,J＝17.2Hz,1H),4.75-4.61(m,2H),3.35-3.27(m,4H),3.22-3.09(m,6H),3.01-2.79(m,3H),2.67-2.55(m,5H),2.07-1.97(m,1H),1.65-1.55(m,2H),1.47(s,6H),1.40-1.28(m,2H)。HRMS(ESI)m/z计算值C46H52N12O7[M+Na]+：907.3980，实测值：907.3984。
化合物7的合成：具体步骤如化合物4合成实施例。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.10(s,1H),10.16(s,1H),8.84(s,1H),8.05(s,1H),7.86-7.70(m,2H),7.67-7.52(m,4H),7.09(d,J＝8.5Hz,1H),7.02(d,J＝6.9Hz,1H),6.93(d,J＝8.0Hz,2H),6.54(s,1H),5.67(td,J＝15.8,5.8Hz,1H),5.33(s,1H),5.10-4.96(m,2H),4.83(d,J＝17.1Hz,1H),4.74-4.61(m,2H),3.29(d,J＝5.6Hz,2H),3.22-3.09(m,6H),3.04(d,J＝14.8Hz,2H),2.93-2.84(m,1H),2.71-2.60(m,4H),2.55(d,J＝9.5Hz,1H),2.08-1.97(m,1H),1.67-1.52(m,2H),1.48-1.24(m,12H)。HRMS(ESI)m/z计算值C47H54N12O7[M+H]+：899.4317，实测值：899.4307。
实施例4：化合物8的合成路线
步骤1：化合物S24的合成
化合物S16(1g,3.62mmol)和S23(700mg,4.34mmol)加入到10mL的DMF溶液中，氮气保护下加入DIPEA(1.9mL)，反应体系升温至90℃，反应12小时。反应完成后，向体系中加入100mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S24(950mg,63％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.09(s,1H),7.58(t,J＝7.8Hz,1H),7.14(d,J＝8.6Hz,1H),7.03(d,J＝7.1Hz,2H),6.71(s,1H),5.05(dd,J＝12.9,5.2Hz,1H),3.40-3.34(m,2H),3.12(dd,J＝11.4,5.8Hz,2H),2.96-2.83(m,1H),2.59(d,J＝17.4Hz,1H),2.52-2.49(m,1H),2.07-1.96(m,1H),1.36(s,9H)。
步骤2：化合物S25的合成
化合物S24(190mg,0.46mmol)加入到2mL TFA与4mL二氯甲烷的混合溶剂中，室温反应两小时。反应完成，减压旋去溶剂得到化合物S25，无需进一步纯化，直接投下一步。
步骤3：化合物S27的合成
化合物S25(150mg,0.48mmol)和化合物S26(114mg,0.52mmol)加入到5mL的DMF中，搅拌溶解后加入HATU(360mg,0.95mmol)和DIPEA(340uL)，室温反应两小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S27(139mg,57％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.11(s,1H),8.03(s,1H),7.59(t,J＝7.7Hz,1H),7.18(d,J＝8.5Hz,1H),7.03(d,J＝6.9Hz,1H),6.84-6.69(m,2H),5.06(dd,J＝12.6,4.8Hz,1H),3.37(d,J＝6.0Hz,2H),3.23(d,J＝5.3Hz,2H),2.97-2.79(m,3H),2.65-2.52(m,2H),2.04(t,J＝6.8Hz,3H),1.51-1.42(m,2H),1.36(s,11H)。
步骤4：化合物S28的合成
化合物S27(140mg,0.27mmol)加入到2mL TFA与4mL二氯甲烷的混合溶剂中，室温反应两小时。反应完成，减压旋去溶剂得到化合物S28，无需进一步纯化，直接投下一步。
步骤5：化合物8的合成
化合物S15(50mg,0.09mmol)和化合物S28(42mg,0.10mmol)加入到5mL的DMF中，搅拌溶解后加入HATU(70mg,0.18mmol)和DIPEA(200uL)，室温反应两小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物8(61mg,71％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.10(s,1H),10.17(s,1H),8.83(s,1H),8.04(t,J＝5.1Hz,2H),7.75(d,J＝7.8Hz,2H),7.66-7.52(m,4H),7.17(d,J＝8.6Hz,1H),7.02(d,J＝7.0Hz,1H),6.93(d,J＝8.6Hz,2H),6.74(t,J＝6.0Hz,1H),5.73-5.61(m,1H),5.33(s,1H),5.06(dd,J＝12.9,5.3Hz,1H),5.00(d,J＝10.2Hz,1H),4.83(d,J＝17.1Hz,1H),4.69(d,J＝4.9Hz,2H),3.44-3.35(m,2H),3.24(dd,J＝11.5,5.7Hz,2H),3.20-3.02(m,6H),2.93-2.84(m,1H),2.77-2.52(m,5H),2.14-1.96(m,3H),1.56-1.43(m,8H),1.43-1.35(m,2H)。HRMS(ESI)m/z计算值C48H55N13O8[M+H]+：942.4375，实测值：942.4369。
实施例5：化合物9的合成路线
步骤1：化合物S31的合成
化合物S29(100mg,0.37mmol)和S30(68mg,0.31mmol)加入到3mL的DMF溶液中，待体系全溶后，加入碳酸钾(84mg,0.61mmol)，升温至60℃反应6小时。反应完成后，加入30mL的水，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S31(92mg,72％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.11(s,1H),7.81(t,J＝7.5Hz,1H),7.54(d,J＝8.3Hz,1H),7.46(d,J＝6.9Hz,1H),6.98(s,1H),5.09(dd,J＝12.0,4.4Hz,1H),4.23(s,2H),3.34(s,2H),2.89(t,J＝13.3Hz,1H),2.68-2.53(m,2H),2.13-1.95(m,1H),1.37(s,9H)。
步骤2：化合物S32的合成
化合物S31(224mg,0.54mmol)加入到2mL TFA与4mL二氯甲烷的混合溶剂中，室温反应两小时。反应完成，减压旋去溶剂得到化合物S32，无需进一步纯化，直接投下一步。
步骤3：化合物S33的合成
化合物S32(150mg,0.47mmol)和化合物S26(114mg,0.52mmol)加入到5mL的DMF中，搅拌溶解后加入HATU(360mg,0.95mmol)和DIPEA(340uL)，室温反应两小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S33(132mg,55％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.06(s,1H),7.71(t,J＝7.8Hz,1H),7.52(d,J＝7.3Hz,1H),7.27(s,2H),6.76(s,1H),4.98(d,J＝5.9Hz,1H),4.39-4.13(m,2H),3.81-3.63(m,2H),3.23-3.03(m,3H),2.93-2.80(m,2H),2.24(t,J＝7.6Hz,2H),2.19-2.11(m,1H),1.70-1.56(m,2H),1.43(s,11H)。
步骤4：化合物S34的合成
化合物S33(85mg,0.16mmol)加入到2mL TFA与4mL二氯甲烷的混合溶剂中，室温反应两小时。反应完成，减压旋去溶剂得到化合物S34，无需进一步纯化，直接投下一步。
步骤5：化合物9的合成
化合物S15(50mg,0.09mmol)和化合物S34(42mg,0.10mmol)加入到5mL的DMF中，搅拌溶解后加入HATU(70mg,0.18mmol)和DIPEA(200uL)，室温反应两小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物9(45mg,53％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.11(s,1H),10.16(s,1H),8.83(s,1H),8.05(t,J＝5.2Hz,2H),7.90-7.70(m,3H),7.68-7.51(m,4H),7.46(d,J＝7.2Hz,1H),6.93(d,J＝8.7Hz,2H),5.67(dq,J＝10.4,6.0Hz,1H),5.33(s,1H),5.09(dd,J＝12.8,5.3Hz,1H),5.00(d,J＝10.1Hz,1H),4.83(d,J＝17.1Hz,1H),4.69(d,J＝5.1Hz,2H),4.24(t,J＝5.8Hz,2H),3.45(dd,J＝11.2,5.6Hz,2H),3.25-3.06(m,6H),3.04-2.80(m,3H),2.74-2.52(m,5H),2.11(t,J＝7.1Hz,2H),2.06-1.97(m,1H),1.57-1.34(m,10H)。HRMS(ESI)m/z计算值C48H54N12O9[M+Na]+：965.4034，实测值：965.4001。
实施例6：化合物10的合成路线
步骤1：化合物S36的合成
化合物S16(200mg,0.73mmol)和S35(180mg,0.76mmol)加入到5mL的DMF溶液中，氮气保护下加入DIPEA(390uL)，反应体系升温至90℃，反应12小时。反应完成后，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S36(235mg,66％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.11(s,1H),7.50(t,J＝6.9Hz,1H),7.40-7.27(m,3H),7.20(s,3H),7.01(d,J＝6.6Hz,1H),6.94(d,J＝8.2Hz,1H),5.07(dd,J＝11.5,3.6Hz,1H),4.53(d,J＝3.4Hz,2H),4.08(s,2H),2.89(t,J＝13.4Hz,1H),2.66-2.54(m,2H),2.11-1.98(m,1H),1.38(s,9H)。
步骤2：化合物S37的合成
化合物S36(160mg,0.33mmol)加入到2mL TFA与4mL二氯甲烷的混合溶剂中，室温反应两小时。反应完成，减压旋去溶剂得到化合物S37，无需进一步纯化，直接投下一步。
步骤3：化合物S38的合成
化合物S37(250mg,0.64mmol)和化合物S26(153mg,0.70mmol)加入到5mL的DMF中，搅拌溶解后加入HATU(485mg,1.28mmol)和DIPEA(500uL)，室温反应两小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S38(207mg,54％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.12(s,1H),8.25(s,1H),7.50(t,J＝7.6Hz,1H),7.31(d,J＝7.6Hz,2H),7.19(d,J＝7.7Hz,3H),7.01(d,J＝7.0Hz,1H),6.93(d,J＝8.4Hz,1H),6.79(s,1H),5.07(dd,J＝12.8,4.9Hz,1H),4.53(d,J＝5.3Hz,2H),4.22(d,J＝5.1Hz,2H),2.89(d,J＝4.9Hz,3H),2.67-2.53(m,2H),2.10(t,J＝7.1Hz,2H),2.06-1.97(m,1H),1.47(d,J＝6.9Hz,2H),1.36(s,11H)。
步骤4：化合物S39的合成
化合物S38(100mg,0.17mmol)加入到2mL TFA与4mL二氯甲烷的混合溶剂中，室温反应两小时。反应完成，减压旋去溶剂得到化合物S39，无需进一步纯化，直接投下一步。
步骤5：化合物10的合成
化合物S15(50mg,0.09mmol)和化合物S39(50mg,0.10mmol)加入到5mL的DMF中，搅拌溶解后加入HATU(70mg,0.18mmol)和DIPEA(200uL)，室温反应两小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物10(49mg,54％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.12(s,1H),10.18(s,1H),8.83(s,1H),8.28(t,J＝5.8Hz,1H),8.05(t,J＝7.4Hz,1H),7.77(t,J＝12.3Hz,2H),7.59(t,J＝14.1Hz,3H),7.50-7.45(m,1H),7.30(d,J＝8.1Hz,2H),7.23-7.18(m,3H),7.01(t,J＝5.3Hz,1H),6.92(t,J＝9.3Hz,3H),5.67(dq,J＝11.1,5.9Hz,1H),5.34(s,1H),5.07(dd,J＝12.9,5.3Hz,1H),4.99(d,J＝10.2Hz,1H),4.83(d,J＝17.1Hz,1H),4.69(d,J＝4.9Hz,2H),4.50(d,J＝5.9Hz,2H),4.23(d,J＝5.6Hz,2H),3.24-3.06(m,6H),2.95-2.83(m,3H),2.70-2.53(m,5H),2.14(t,J＝7.2Hz,2H),2.07-2.01(m,1H),1.56-1.38(m,10H)。HRMS(ESI)m/z计算值C54H59N13O8[M+H]+：1018.2663，实测值：1018.2642。
实施例7：化合物11的合成路线
步骤1：化合物S41的合成
化合物S29(100mg,0.37mmol)和S40(82mg,0.37mmol)加入到3mL的DMF溶液中，待体系全溶后，加入碳酸钾(100mg,0.74mmol)，升温至60℃反应6小时。反应完成后，加入30mL的水，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S41(65mg,43％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.12(s,1H),7.83(t,J＝7.7Hz,1H),7.59(d,J＝8.5Hz,1H),7.55(d,J＝7.5Hz,2H),7.48(d,J＝7.1Hz,1H),7.43(d,J＝7.5Hz,2H),5.39(s,2H),5.11(dd,J＝12.6,4.8Hz,1H),4.47(s,2H),2.97-2.81(m,1H),2.66-2.53(m,2H),2.11-1.97(m,1H)。
步骤2：化合物S42的合成
化合物S41(60mg,0.14mmol)加入到1M HCl(2mL)和乙醚(2mL)的混合溶液中，冰浴下，加入三苯基膦(38mg 0.14mmol)，加毕，升至室温反应12小时。反应完成，加入4M碳酸钠溶液调PH＝10，加入5mL水，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S42(34mg,61％收率)。
步骤3：化合物S43的合成
化合物S42(350mg,0.92mmol)和化合物S26(200mg,0.92mmol)加入到5mL的DMF中，搅拌溶解后加入HATU(700mg,1.85mmol)和DIPEA(500uL)，室温反应两小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S43(377mg,69％收率)。
步骤4：化合物S44的合成
化合物S43(350mg,0.59mmol)加入到2mL TFA与4mL二氯甲烷的混合溶剂中，室温反应两小时。反应完成，减压旋去溶剂得到化合物S44，无需进一步纯化，直接投下一步。
步骤5：化合物11的合成
化合物S15(50mg,0.09mmol)和化合物S44(50mg,0.10mmol)加入到5mL的DMF中，搅拌溶解后加入HATU(70mg,0.18mmol)和DIPEA(200uL)，室温反应两小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物11(62mg,68％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.08(s,1H),10.17(s,1H),8.83(s,1H),8.33(s,1H),8.05(s,1H),7.84-7.72(m,3H),7.69-7.52(m,4H),7.44(d,J＝7.2Hz,3H),7.28(d,J＝7.3Hz,2H),6.92(d,J＝7.5Hz,2H),5.66(dt,J＝15.9,8.0Hz,1H),5.42-5.23(m,3H),5.09(dd,J＝12.3,4.6Hz,1H),5.00(d,J＝10.0Hz,1H),4.83(d,J＝17.2Hz,1H),4.74-4.63(m,2H),4.27(d,J＝4.7Hz,2H),3.25-3.07(m,6H),2.99-2.82(m,3H),2.69-2.55(m,5H),2.16(t,J＝6.0Hz,2H),2.07-1.99(m,1H),1.57-1.39(m,10H)。HRMS(ESI)m/z计算值C54H58N12O9[M+H]+：1019.4528，实测值：1019.4504。
实施例8：化合物12的合成路线
步骤1：化合物S46的合成
化合物S16(500mg,1.81mmol)和S45(450mg,1.81mmol)加入到10mL的DMF溶液中，氮气保护下加入DIPEA(900uL)，反应体系升温至90℃，反应12小时。反应完成后，向体系中加入150mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S46(572mg,63％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.09(s,1H),7.59(t,J＝7.8Hz,1H),7.15(d,J＝8.6Hz,1H),7.04(d,J＝7.0Hz,1H),6.72(s,1H),6.61(t,J＝5.5Hz,1H),5.06(dd,J＝12.9,5.3Hz,1H),3.62(t,J＝5.3Hz,2H),3.58-3.54(m,2H),3.53-3.50(m,2H),3.47(d,J＝5.4Hz,2H),3.38(t,J＝6.0Hz,2H),3.06(dd,J＝11.5,5.6Hz,2H),2.94-2.81(m,1H),2.66-2.53(m,2H),2.08-1.97(m,1H),1.36(s,9H)。
步骤2：化合物S47的合成
化合物S46(520mg,1.03mmol)加入到2mL TFA与4mL二氯甲烷的混合溶剂中，室温反应两小时。反应完成，减压旋去溶剂得到化合物S47，无需进一步纯化，直接投下一步。
步骤3：化合物12的合成
化合物S15(50mg,0.09mmol)和化合物S47(42mg,0.10mmol)加入到3mL的DMF中，搅拌溶解后加入HATU(70mg,0.18mmol)和DIPEA(200uL)，室温反应两小时。反应完成，向体系中加入30mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物12(44mg,53％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.02(s,1H),10.08(s,1H),8.74(s,1H),7.96(t,J＝7.2Hz,1H),7.75-7.60(m,2H),7.59-7.35(m,4H),6.99(d,J＝8.6Hz,1H),6.92(d,J＝7.0Hz,1H),6.82(d,J＝8.6Hz,2H),6.51(t,J＝5.5Hz,1H),5.64-5.51(m,1H),5.25(s,1H),4.96(dd,J＝13.0,5.4Hz,1H),4.91(d,J＝10.2Hz,1H),4.73(d,J＝17.1Hz,1H),4.60(d,J＝4.8Hz,2H),3.58-3.42(m,6H),3.41-3.30(m,4H),3.18(dd,J＝11.2,5.5Hz,2H),3.11-2.96(m,4H),2.88(s,2H),2.83-2.71(m,1H),2.56-2.44(m,5H),2.00-1.86(m,1H),1.37(s,6H)。HRMS(ESI)m/z计算值C47H54N12O9[M+H]+：931.4215，实测值：931.4231。
实施例9：化合物13的合成路线
步骤1：化合物S49的合成
化合物S16(236mg,0.86mmol)和S48(250mg,0.86mmol)加入到5mL的DMF溶液中，氮气保护下加入DIPEA(600uL)，反应体系升温至90℃，反应12小时。反应完成后，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S49(248mg,46％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.10(s,1H),7.58(t,J＝7.8Hz,1H),7.15(d,J＝8.6Hz,1H),7.04(d,J＝7.0Hz,1H),6.74(s,1H),6.61(t,J＝5.3Hz,1H),5.06(dd,J＝12.8,5.2Hz,1H),3.62(t,J＝5.1Hz,2H),3.59-3.42(m,10H),3.36(d,J＝6.0Hz,2H),3.05(dd,J＝11.3,5.5Hz,2H),2.96-2.80(m,1H),2.65-2.52(m,2H),2.08-1.96(m,1H),1.36(s,9H)。
步骤2：化合物S50的合成
化合物S49(220mg,0.40mmol)加入到2mL TFA与4mL二氯甲烷的混合溶剂中，室温反应两小时。反应完成，减压旋去溶剂得到化合物S50，无需进一步纯化，直接投下一步。
步骤3：化合物13的合成
化合物S15(120mg,0.22mmol)和化合物S50(100mg,0.22mmol)加入到5mL的DMF中，搅拌溶解后加入HATU(170mg,0.45mmol)和DIPEA(100uL)，室温反应两小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物13(115mg,53％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.11(s,1H),10.16(s,1H),8.83(s,1H),8.07(t,J＝16.1Hz,1H),7.75(d,J＝5.4Hz,2H),7.64-7.51(m,4H),7.09(d,J＝8.6Hz,1H),7.02(d,J＝6.9Hz,1H),6.93(d,J＝8.2Hz,2H),6.61-6.51(m,1H),5.67(dq,J＝10.5,5.7Hz,1H),5.34(s,1H),5.10-4.96(m,2H),4.83(d,J＝17.2Hz,1H),4.67(d,J＝23.0Hz,2H),3.58-3.42(m,14H),3.27(d,J＝5.2Hz,2H),3.18-3.08(m,4H),3.03-2.97(m,2H),2.88-2.80(m,1H),2.68-2.53(m,6H),2.07-2.01(m,1H),1.47(s,6H)。HRMS(ESI)m/z计算值C49H58N12O10[M+H]+：975.4477，实测值：975.4524。
实施例10：化合物14的合成路线
步骤1：化合物S52的合成
化合物S16(500mg,1.81mmol)和S51(600mg,1.81mmol)加入到10mL的DMF溶液中，氮气保护下加入DIPEA(600uL)，反应体系升温至90℃，反应12小时。反应完成后，向体系中加入150mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S52(728mg,68％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.10(s,1H),7.58(t,J＝7.6Hz,1H),7.15(d,J＝8.5Hz,1H),7.04(d,J＝6.9Hz,1H),6.74(s,1H),6.61(s,1H),5.06(dd,J＝12.5,4.1Hz,1H),3.71-3.61(m,2H),3.59-3.44(m,14H),3.36(s,2H),3.05(d,J＝5.1Hz,2H),2.89(t,J＝13.4Hz,1H),2.65-2.52(m,2H),2.09-1.94(m,1H),1.37(s,9H)。
步骤2：化合物S53的合成
化合物S52(200mg,0.34mmol)加入到2mL TFA与4mL二氯甲烷的混合溶剂中，室温反应两小时。反应完成，减压旋去溶剂得到化合物S53，无需进一步纯化，直接投下一步。
步骤3：化合物14的合成
化合物S15(55mg,0.10mmol)和化合物S53(50mg,0.10mmol)加入到5mL的DMF中，搅拌溶解后加入HATU(76mg,0.20mmol)和DIPEA(100uL)，室温反应两小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物14(63mg,65％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.10(s,1H),10.18(s,1H),8.83(s,1H),8.09-8.01(m,1H),7.75(d,J＝7.4Hz,1H),7.68-7.51(m,4H),7.12(d,J＝8.4Hz,1H),7.03(d,J＝6.9Hz,1H),6.95(d,J＝8.0Hz,2H),6.59(s,1H),5.67(td,J＝15.7,6.8Hz,1H),5.34(s,1H),5.10-4.95(m,2H),4.83(d,J＝17.1Hz,1H),4.75-4.62(m,2H),3.62-3.42(m,18H),3.33-3.09(m,8H),2.94-2.53(m,6H),2.07-1.98(m,1H),1.46(s,6H)。HRMS(ESI)m/z计算值C51H62N12O11[M+H]+：1019.4739，实测值：1019.4739。
实施例11：化合物15的合成路线
步骤1：化合物S55的合成
化合物S16(240mg,0.86mmol)和S54(350mg,0.86mmol)加入到5mL的DMF溶液中，氮气保护下加入DIPEA(300uL)，反应体系升温至90℃，反应12小时。反应完成后，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S55(428mg,79％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.12(s,1H),7.59(t,J＝7.8Hz,1H),7.15(d,J＝8.6Hz,1H),7.04(d,J＝7.0Hz,1H),6.77(s,1H),6.62(t,J＝5.4Hz,1H),5.06(dd,J＝12.9,5.3Hz,1H),3.62(t,J＝5.1Hz,2H),3.57-3.46(m,18H),3.37(d,J＝6.0Hz,2H),3.05(dd,J＝11.5,5.6Hz,2H),2.95-2.81(m,1H),2.66-2.53(m,2H),2.08-1.97(m,1H),1.37(s,9H)。
步骤2：化合物S56的合成
化合物S55(200mg,0.31mmol)加入到2mL TFA与4mL二氯甲烷的混合溶剂中，室温反应两小时。反应完成，减压旋去溶剂得到化合物S56，无需进一步纯化，直接投下一步。
步骤3：化合物15的合成
化合物S15(50mg,0.09mmol)和化合物S56(54mg,0.10mmol)加入到5mL的DMF中，搅拌溶解后加入HATU(70mg,0.18mmol)和DIPEA(200uL)，室温反应两小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物15(49mg,51％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.12(s,1H),10.18(s,1H),8.84(s,1H),8.06(s,1H),7.77(d,J＝4.8Hz,2H),7.70-7.49(m,4H),7.12(d,J＝8.6Hz,1H),7.04(d,J＝7.0Hz,1H),6.94(d,J＝8.3Hz,2H),6.60(t,J＝5.1Hz,1H),5.67(dq,J＝10.9,5.9Hz,1H),5.35(s,1H),5.06(dd,J＝12.9,5.1Hz,1H),5.00(d,J＝10.1Hz,1H),4.83(d,J＝17.2Hz,1H),4.70(d,J＝3.8Hz,2H),3.59(d,J＝4.9Hz,2H),3.58-3.39(m,20H),3.28(d,J＝5.5Hz,2H),3.22-3.07(m,4H),2.99(s,2H),2.93-2.81(m,1H),2.69-2.55(m,5H),2.09-2.01(m,1H),1.47(s,6H)。HRMS(ESI)m/z计算值C53H66N12O12[M+H]+：1063.5001，实测值：1063.4985。
实施例12：化合物16的合成路线
步骤1：化合物S58的合成
化合物S16(1g,3.62mmol)和S57(1.54g,3.62mmol)加入到10mL的DMF溶液中，氮气保护下加入DIPEA(1.3mL)，反应体系升温至90℃，反应12小时。反应完成后，向体系中加入150mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S58(1.82g,74％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.10(s,1H),7.59(t,J＝7.7Hz,1H),7.15(d,J＝8.5Hz,1H),7.04(d,J＝6.9Hz,1H),6.75(s,1H),6.61(s,1H),5.06(dd,J＝12.5,4.3Hz,1H),3.72-3.62(m,2H),3.58-3.46(m,22H),3.37(s,2H),3.06(d,J＝5.3Hz,2H),2.89(t,J＝13.6Hz,1H),2.66-2.52(m,2H),2.09-1.95(m,1H),1.37(s,9H)。
步骤2：化合物S59的合成
化合物S58(1g,1.47mmol)加入到2mL TFA与4mL二氯甲烷的混合溶剂中，室温反应两小时。反应完成，减压旋去溶剂得到化合物S59，无需进一步纯化，直接投下一步。
步骤3：化合物16的合成
化合物S15(45mg,0.08mmol)和化合物S59(48mg,0.08mmol)加入到5mL的DMF中，搅拌溶解后加入HATU(63mg,0.17mmol)和DIPEA(100uL)，室温反应两小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物16(53mg,58％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.10(s,1H),10.17(s,1H),8.83(s,1H),8.12-8.00(m,1H),7.76(d,J＝5.1Hz,2H),7.63-7.54(m,4H),7.13(d,J＝8.6Hz,1H),7.04(d,J＝6.8Hz,1H),6.93(d,J＝8.0Hz,2H),6.67-6.58(m,1H),5.67(dd,J＝16.0,9.2Hz,1H),5.33(s,1H),5.09-4.97(m,2H),4.83(d,J＝17.0Hz,1H),4.75-4.61(m,2H),3.72-3.60(m,2H),3.54-3.45(m,24H),3.28(d,J＝4.0Hz,2H),3.23-3.11(m,4H),2.92-2.80(m,3H),2.68-2.52(m,6H),2.05-1.99(m,1H),1.47(s,6H)。HRMS(ESI)m/z计算值C55H70N12O13[M+Na]+：1129.5083，实测值：1129.5112。
实施例13：化合物17的合成路线
步骤1：化合物S61的合成
化合物S16(700mg,2.56mmol)和S60(1.2g,2.56mmol)加入到10mL的DMF溶液中，氮气保护下加入DIPEA(800uL)，反应体系升温至90℃，反应12小时。反应完成后，向体系中加入150mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S61(1.44g,78％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.11(s,1H),7.59(t,J＝7.8Hz,1H),7.15(d,J＝8.6Hz,1H),7.04(d,J＝7.0Hz,1H),6.76(t,J＝5.2Hz,1H),6.61(t,J＝5.6Hz,1H),5.06(dd,J＝12.9,5.3Hz,1H),3.62(t,J＝5.2Hz,2H),3.57-3.46(m,26H),3.39-3.35(m,2H),3.05(dd,J＝11.8,5.9Hz,2H),2.95-2.82(m,1H),2.64-2.53(m,2H),2.08-1.97(m,1H),1.37(s,9H)。
步骤2：化合物S62的合成
化合物S61(350mg,0.49mmol)加入到2mL TFA与4mL二氯甲烷的混合溶剂中，室温反应两小时。反应完成，减压旋去溶剂得到化合物S62，无需进一步纯化，直接投下一步。
步骤3：化合物17的合成
化合物S15(87mg,0.16mmol)和化合物S62(100mg,0.16mmol)加入到5mL的DMF中，搅拌溶解后加入HATU(125mg,0.32mmol)和DIPEA(100uL)，室温反应两小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物17(94mg,51％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.10(s,1H),10.18(s,1H),8.84(s,1H),8.30-8.18(m,1H),8.06(t,J＝11.6Hz,1H),7.76(d,J＝7.1Hz,1H),7.68-7.51(m,4H),7.14(d,J＝7.8Hz,1H),7.04(d,J＝6.4Hz,1H),6.95(d,J＝7.5Hz,2H),6.60(s,1H),5.67(dd,J＝16.2,8.7Hz,1H),5.33(s,1H),5.06(d,J＝10.9Hz,1H),5.00(d,J＝10.1Hz,1H),4.83(d,J＝17.1Hz,1H),4.69(d,J＝0.5Hz,2H),3.69-3.40(m,34H),3.32-3.10(m,8H),2.92-2.84(m,1H),2.63-2.54(m,2H),2.05-1.99(m,1H),1.47(s,6H)。HRMS(ESI)m/z计算值C57H74N12O14[M+H]+：1151.5526，实测值：1151.5562。
实施例14：化合物18的合成路线
步骤1：化合物S64的合成
化合物S16(360mg,1.29mmol)和S63(660mg,1.29mmol)加入到5mL的DMF溶液中，氮气保护下加入DIPEA(500uL)，反应体系升温至90℃，反应12小时。反应完成后，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S64(674mg,68％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.09(s,1H),7.59(t,J＝7.6Hz,1H),7.15(d,J＝8.5Hz,1H),7.04(d,J＝6.8Hz,1H),6.73(s,1H),6.61(s,1H),5.06(dd,J＝12.5,3.9Hz,1H),3.67-3.60(m,2H),3.57-3.44(m,30H),3.37(s,2H),3.06(d,J＝5.0Hz,2H),2.89(t,J＝13.4Hz,1H),2.67-2.52(m,2H),2.09-1.96(m,1H),1.37(s,9H)。
步骤2：化合物S65的合成
化合物S64(250mg,0.33mmol)加入到2mL TFA与4mL二氯甲烷的混合溶剂中，室温反应两小时。反应完成，减压旋去溶剂得到化合物S65，无需进一步纯化，直接投下一步。
步骤3：化合物18的合成
化合物S15(80mg,0.15mmol)和化合物S65(98mg,0.15mmol)加入到5mL的DMF中，搅拌溶解后加入HATU(112mg,0.30mmol)和DIPEA(80uL)，室温反应两小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物18(112mg,64％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.10(s,1H),10.16(s,1H),8.83(s,1H),8.07(d,J＝19.8Hz,1H),7.84-7.73(m,2H),7.66-7.53(m,4H),7.14(d,J＝8.5Hz,1H),7.04(d,J＝6.9Hz,1H),6.94(d,J＝8.1Hz,2H),6.68-6.54(m,1H),5.67(ddd,J＝14.3,8.7,4.2Hz,1H),5.33(s,1H),5.11-4.96(m,2H),4.83(d,J＝17.1Hz,1H),4.73-4.63(m,2H),3.69-3.61(m,2H),3.56-3.44(m,32H),3.29(d,J＝4.4Hz,2H),3.24-3.15(m,4H),3.06(d,J＝11.3Hz,2H),2.94-2.85(m,1H),2.72-2.53(m,6H),2.06-1.98(m,1H),1.47(s,6H)。HRMS(ESI)m/z计算值C59H78N12O15[M+H]+：1195.5788，实测值：1195.5774。
实施例15：化合物19的合成路线
步骤1：化合物S68的合成
氮气保护下，化合物S66(166mg,0.45mmol)，化合物S67(38mg,0.45mmol)，PdCl2(PPh3)2(16mg,0.02mmol)，碘化亚铜(4mg,0.02mmol)依次加入到10mL的DME中，搅拌溶解后加入三乙胺(182mg,1.8mmol)，回流反应12小时。反应完成，向体系中加入10mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到白色固体化合物S68(60mg,41％收率)。LC-Mass(ESI)m/z C18H18N2O4[M+H]+：327.24。
步骤2：化合物S69的合成
氮气保护下，化合物S68(50mg,0.15mmol)加入到10mL的二氯甲烷中，冰浴下加入三溴化磷(182mg,1.8mmol)，反应15分钟。反应完成，向体系中加入10mL的水，二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得产品S69，无需纯化，迅速投入下一步。
步骤3：化合物19的合成
氮气保护下，化合物S69(58mg,0.15mmol)和化合物S13(73mg,0.15mmol)加入到5mL的DMF中，室温下加入碳酸钾(62mg,0.45mmol)，升至60摄氏度，反应6小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得白色固体化合物19(62mg,53％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.04(s,1H),10.19(s,1H),8.68–8.05(m,2H),7.74(d,J＝7.3Hz,2H),7.62–7.48(m,2H),7.01(d,J＝7.9Hz,2H),5.75–5.54(m,1H),5.32(s,1H),5.22(d,J＝13.1Hz,1H),5.03(d,J＝11.2Hz,1H),4.81(t,J＝19.5Hz,1H),4.70(s,2H),4.38(dd,J＝57.2,16.8Hz,2H),3.95–3.66(m,6H),3.45–3.34(m,2H),3.18–3.03(m,4H),2.93(d,J＝13.2Hz,1H),2.70(d,J＝32.4Hz,4H),2.61(d,J＝16.2Hz,1H),2.49–2.37(m,1H),2.04(s,1H),1.47(s,6H)。
实施例16：化合物20的合成路线
步骤1：化合物S70的合成
氮气保护下，化合物S68(50mg,0.15mmol)和10％钯碳催化剂(5mg)加入到10mL的甲醇中，置换氢气，反应2小时。反应完成，过滤除去钯碳，收集滤液并浓缩得固体化合物S70(48mg,98％收率)。LC-Mass(ESI)m/z C18H24N2O4[M+H]+：331.46。
步骤2：化合物S71的合成
氮气保护下，化合物S70(50mg,0.15mmol)加入到10mL的二氯甲烷中，冰浴下加入三溴化磷(182mg,1.8mmol)，反应15分钟。反应完成，向体系中加入10mL的水，二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得产品71，无需纯化，迅速投入下一步。
步骤3：化合物20的合成
氮气保护下，化合物S71(58mg,0.15mmol)和化合物S13(73mg,0.15mmol)加入到5mL的DMF中，室温下加入碳酸钾(62mg,0.45mmol)，升至60摄氏度，反应6小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得白色固体化合物20(56mg,47.7％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.05(s,1H),10.18(s,1H),8.68–8.13(m,3H),7.92(d,J＝7.3Hz,1H),7.52–7.36(m,2H),6.95(d,J＝7.2Hz,2H),5.73–5.54(m,1H),5.32(s,1H),5.20(d,J＝12.8Hz,1H),5.02(d,J＝11.2Hz,1H),4.81(d,J＝12.5Hz,1H),4.70(s,2H),4.38(dd,J＝56.8,16.7Hz,2H),3.91–3.60(m,8H),3.51–3.41(m,
4H),3.16–2.99(m,4H),2.92(d,J＝13.4Hz,1H),2.71(d,J＝32.4Hz,4H),2.61(d,J＝16.6Hz,1H),2.48–2.35(m,1H),2.04(s,1H),1.46(s,6H)。
实施例17：化合物21的合成路线
步骤1：化合物S73的合成
氮气保护下，化合物S66(166mg,0.45mmol)，化合物S72(44mg,0.45mmol)，PdCl2(PPh3)2(16mg,0.02mmol)，碘化亚铜(4mg,0.02mmol)依次加入到10mL的DME中，搅拌溶解后加入三乙胺(182mg,1.8mmol)，回流反应12小时。反应完成，向体系中加入10mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到白色固体化合物S73(68mg,45％收率)。LC-Mass(ESI)m/z C18H16N2O5[M+H]+：341.64。
步骤2：化合物21的合成
化合物S73(51mg,0.15mmol)和化合物S13(73mg,0.15mmol)加入到5mL的DMF中，搅拌溶解后加入HATU(112mg,0.30mmol)和DIPEA(80uL)，室温反应两小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物21(82mg,69％收率)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.04(s,1H),10.19(s,1H),8.84(s,1H),8.05(s,1H),7.74(dd,J＝19.8,7.3Hz,2H),7.61(s,3H),7.52(t,J＝7.4Hz,1H),6.95(d,J＝7.9Hz,2H),5.78–5.58(m,1H),5.34(s,1H),5.17(d,J＝12.7Hz,1H),5.00(d,J＝10.0Hz,1H),4.81(t,J＝19.5Hz,1H),4.70(s,2H),4.39(dd,J＝58.5,17.8Hz,2H),3.64(s,4H),3.45–3.31(m,2H),3.18–2.99(m,4H),2.93(t,J＝13.4Hz,1H),2.70(d,J＝36.9Hz,4H),2.60(d,J＝16.6Hz,1H),2.48–2.37(m,1H),2.04(s,1H),1.47(s,6H)。
实施例18：化合物22的合成路线
步骤1：化合物S74的合成
氮气保护下，化合物S73(70mg,0.20mmol)和10％钯碳催化剂(7mg)加入到10mL的甲醇中，置换氢气，反应2小时。反应完成，过滤除去钯碳，收集滤液并浓缩得固体化合物S74(66mg,95％收率)。LC-Mass(ESI)m/z C18H20N2O5[M+H]+：344.93。
步骤2：化合物22的合成
化合物S74(51mg,0.15mmol)和化合物S13(73mg,0.15mmol)加入到5mL的DMF中，搅拌溶解后加入HATU(112mg,0.30mmol)和DIPEA(80uL)，室温反应两小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物22(68mg,57％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.04(s,1H),10.18(s,1H),8.83(s,1H),8.02(s,1H),7.83(d,J＝7.6Hz,2H),7.61(s,3H),7.52(t,J＝7.5Hz,1H),7.01–6.58(m,2H),5.80–5.59(m,1H),5.34(s,1H),5.17(d,J＝12.7Hz,1H),5.00(d,J＝10.0Hz,1H),4.81(t,J＝19.7Hz,1H),4.70(s,2H),4.39(dd,J＝58.5,17.8Hz,2H),3.64(s,4H),3.51–3.41(m,4H),3.18–2.97(m,4H),2.93(t,J＝13.4Hz,1H),2.70(d,J＝36.9Hz,4H),2.61(d,J＝16.8Hz,1H),2.50–2.31(m,3H),2.03(s,1H),1.46(s,6H)。
实施例19：化合物23的合成路线
步骤1：化合物S77的合成
化合物S75(64mg,0.15mmol)和化合物S76(25mg,0.15mmol)加入到5mL的DMF中，搅拌溶解后加入HATU(112mg,0.30mmol)和DIPEA(80uL)，室温反应两小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S77(42mg,49％收率)。LC-Mass(ESI)m/z C26H35BrN4O4S[M+H]+：579.17。
步骤2：化合物23的合成
氮气保护下，化合物S77(87mg,0.15mmol)和化合物S13(73mg,0.15mmol)加入到5mL的DMF中，室温下加入碳酸钾(62mg,0.45mmol)，升至60摄氏度，反应6小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得白色固体化合物23(61mg,42.3％收率)。HRMS(ESI)m/z计算值C52H64N12O6S[M+H]+：985.5191，实测值：985.5174。
实施例20：化合物24的合成路线
步骤1：化合物S79的合成
化合物S75(64mg,0.15mmol)和化合物S78(29mg,0.15mmol)加入到5mL的DMF中，搅拌溶解后加入HATU(112mg,0.30mmol)和DIPEA(80uL)，室温反应两小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离纯化得到黄色固体化合物S79(41mg,47％收率)。LC-Mass(ESI)m/z C28H39BrN4O4S[M+H]+：607.01。
步骤2：化合物24的合成
氮气保护下，化合物S79(91mg,0.15mmol)和化合物S13(73mg,0.15mmol)加入到5mL的DMF中，室温下加入碳酸钾(62mg,0.45mmol)，升至60摄氏度，反应6小时。反应完成，向体系中加入50mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液并浓缩得白色固体化合物24(63mg,41％收率)。HRMS(ESI)m/z计算值C54H68N12O6S[M+H]+：1013.5184，实测值：1013.5160。
测试例1：激酶结合实验。
筛选模型:WEE1激酶蛋白；
筛选方法:Protocol name:WEE1；
仪器:Envision(PerkinElmer，USA)；
材料:WEE1蛋白购自eurofins；Kinase Tracer 178购自Thermo FisherScientific；Anti-GST购自Cisbio公司；
过程:通过添加Eu标记GST抗体、WEE1及Tracer178结合反应1h。Tracer178和抗体与激酶的结合导致高度的FRET，反之使用激酶抑制因子代替示踪剂会造成FRET丢失。
WEE1活性检测采用LanthaScreenTM激酶结合实验。WEE1蛋白分子N端带有的GST标签与Eu标记的抗GST抗体相互作用，而Eu发光基团可以和带有荧光基团的Tracer178特异性结合，当Eu和Trancer178相互靠近，会发生荧光共振能量转移，产生荧光信号。在EnvisinTM上用320nm激光激发，在620nm和665nm发射波长处读取荧光值，读取的荧光值的变化，反映WEE1蛋白与探针结合能力。具体实验步骤及注意事项如下：1将待测化合物按照一定比例稀释，并加入到384孔板中；2将酶缓冲液、抗体和Tracer178分别加入相应的实验孔，同时设定DMSO溶剂对照空，以及AZD1775阳性化合物对照空。反应总体积为10μL，反应体系包含：含有终浓度为2％DMSO溶解的带测定化合物，0.4ng/μL WEE1，1nM Eu-Anti-GST，70nMTracer178，10mM MgCl2,1mM DTT,1×kinase buffer，每个实验孔设置3重复；3室温孵育1h，而后用EnvisinTM检测620nm和665nm的荧光值，并计算665nm/620nm比值；4数据用GraphPad分析，拟合曲线，并计算IC50。
如下表3所示，以WEE1抑制剂AZD1775作为阳性对照，化合物1-24在WEE1蛋白上的IC50值都大于AZD1775(IC50＝17.28±2.58nM)，表明化合物1-24对WEE1蛋白的结合作用弱于阳性对照AZD1775。
表3
测试例2：细胞毒实验。
筛选模型:MV-4-11；SUM149PT；A498；
筛选方法:Protocol name:悬浮细胞(3days)；
仪器:SpectraMAX 340；
材料:96plate(coring)；Cells；Medium；DMSO；MTS；
过程:运用MTS法检测细胞存活率：1.将生长在对数生长期的细胞，吸取培养基，轻轻吹打，计数；2.以相应的细胞密度接种在96孔板中90ul；3.加10ul化合物，每一化合物设浓度梯度，每一浓度设三复孔，每一浓度分别加入到对应孔中；DMSO的终浓度是0.2％；4.5％CO2 37℃培养箱内培养3天，加入20ul的MTS；5.37℃孵育3小时后，使用SpectraMAX340测490nm(L1)光吸收值，参考波长690nm(L2)，将(L1-L2)值对抑制剂不同浓度作图，百分比活性(％)＝化合物OD值-BLANK OD值/DMSO OD值-BLANK OD*100％，用GraphPad,经公式拟合得IC50。
数据处理及结果说明:
初筛选择单浓度条件下，例如20μg/ml，对样品的活性进行测试。对于在一定条件下表现出活性的样品，例如抑制率％Inhibition大于50，测试活性剂量依赖关系，即IC50/EC50值，通过样品活性对样品浓度进行非线性拟和得到，计算所用软件为Graphpad Prism4，拟合所使用的模型为sigmoidal dose-response(varible slope)，对于大多数抑制剂筛选模型，将拟合曲线底部和顶部设定为0和100。一般情况下，每个样品在测试中均设置复孔(n≥2)，在结果中以标准偏差(Standard Deviation,SD)或者标准误差(Standard Error,SE)表示。
如下表4所示，以WEE1抑制剂AZD1775作为阳性对照，化合物1-24作用在三株肿瘤细胞系上，包括：MV-4-11(白血病细胞系)、SUM149PT(乳腺癌细胞系)和A498(肾癌细胞系)。其中，对比于表4中其他化合物包括阳性对照AZD1775，尤其是化合物2均表现出极其优异的体外抗肿瘤增殖活性：MV-4-11(IC50＝46.00±6.87nM)、SUM149PT(IC50＝217.67±38.57nM)和A498(IC50＝163.86±16.20nM)。
表4
测试例3：蛋白质免疫印迹(Western blotting)实验
步骤：1)按实验方案在6孔板中接种细胞，每个孔中接种100万细胞并稳定数小时，而后对每孔细胞进行相应化合物处理；2)化合物处理完成后，离心收集细胞，并用PBS洗涤细胞二次并吸尽PBS；3)变性裂解：每孔加入120μl 1x loading(62.5mM Tris-HCI，pH 6.8，2％SDS，25％甘油，0.01％溴酚蓝，1％DTT)并吹打细胞，尽量避免吹打出气泡，100℃金属水浴锅15min，-20℃保存。4)SDS-PAGE电泳：按照Tricine胶配方配置蛋白电泳胶，加入内外槽电泳缓冲液后每个泳道上样10μl，上样结束后，恒电流电泳，按每块胶20mA；5)蛋白转膜：电泳结束后，利用BioRad湿转电泳仪器系统将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，在恒压100伏特条件下，按照每1KD蛋白1min时常计算转膜时间；6)条带封闭：转膜完成后，将目的条带裁剪下后，置于提前用TBST配制好的5％脱脂牛奶封闭液中室温摇床上封闭1h，磷酸化蛋白使用5％BSA封闭液室温封闭1h；7)一抗孵育：封闭结束后，弃上清封闭液，并用TBST简单冲洗条带，去浮色，用TBST分别按抗体使用说明书稀释需要检测的一抗，4℃孵育过夜；孵育完成后，用每条带5mL TBST的量清洗条带3次，每次5min；8)二抗孵育：抗兔和抗鼠的荧光二抗分别按1：10000稀释，室温孵育1h，孵育完成后，按照每条带5mL TBST在摇床上洗膜3次，每次5min；9)曝光：Odyssey仪器扫膜，检测目的蛋白变化情况。
测试例3.1：本发明化合物诱导MV-4-11细胞系中WEE1降解。
以WEE1抑制剂AZD1775作为阳性对照，将本发明的化合物在细胞毒IC50浓度于MV-4-11细胞系处理6小时，收集细胞裂解物并进行Western blotting印迹分析。如图1所示，与化合物AZD1775相比，本发明化合物1-24作用后的WEE1蛋白水平显著降低，表明WEE1蛋白降解。作为蛋白组对照，PLK1蛋白未降解。
测试例3.2：化合物2在不同浓度诱导MV-4-11细胞系中WEE1降解。
以WEE1抑制剂AZD1775作为阳性对照，化合物2在MV-4-11细胞系处理6小时，浓度范围设置在0.2nM-100nM，收集细胞裂解物并进行Western blotting印迹分析。如图2所示，化合物2在0.39nM浓度作用的WEE1蛋白水平开始降低，在50nM浓度作用的WEE1蛋白水平显著降低。作为蛋白组对照，PLK1蛋白未降解。
测试例3.3：化合物2在不同时间诱导MV-4-11细胞系中WEE1降解。
设置两组，一组为化合物2在50nM浓度作用MV-4-11细胞系，设置0.5小时-6小时共7个梯度，一组为化合物2在3nM浓度作用MV-4-11细胞系，设置1小时-5小时共5个梯度，收集细胞裂解物并进行Western blotting印迹分析。如图3所示，化合物2在50nM浓度作用0.5小时后的WEE1蛋白水平显著降低，在3nM浓度作用1小时后的WEE1蛋白水平显著降低。作为蛋白组对照，PLK1蛋白未降解。
可见本发明的化合物具有优异的选择性降解WEE1蛋白的能力。
测试例3.4：蛋白靶点结合竞争实验
对照组分别对MV-4-11细胞系进行预处理，处理方式为CRBN抑制剂Iberdomide(CC-220)和Lenalidomide(来那度胺)10uM、蛋白酶体抑制剂Crafizomib(PR171)和Bortezomib(PS341)1uM预处理细胞2小时后，加入终浓度50nM的化合物2再处理3h，收取总蛋白样进行Western blotting印迹分析。如图4所示，未作蛋白抑制剂预处理的实验组，化合物2在50nM浓度作用MV-4-11细胞系，诱导WEE1蛋白显著降解，并导致下游磷酸化的PCDC2也相应下调；CRBN抑制剂预处理后，化合物2在50nM浓度作用MV-4-11细胞系，不能诱导WEE1蛋白降解；蛋白酶体抑制剂预处理后，化合物2在50nM浓度作用MV-4-11细胞系，不能诱导WEE1蛋白降解。作为蛋白组对照，PLK1蛋白未降解。蛋白靶点竞争结合实验，验证了化合物2依赖于“WEE1蛋白-化合物2-CRBN蛋白”三元复合物形成，通过CRL4CRBN E3泛素连接酶招募WEE1蛋白，而后通过蛋白酶体降解系统降解WEE1蛋白。
测试例4：化合物2诱导WEE1蛋白降解而非诱导WEE1表达mRNA降解。
如图5所示，化合物2在50nM下，作用1、3和6小时后WEE1表达mRNA转录组水平未出现下调，可见本发明化合物不影响WEE1转录组mRNA水平表达量，结合前面免疫印迹实验中所观察到的WEE1蛋白水平表达量降低结果，可证实：本发明化合物通过降解翻译后蛋白水平下调WEE1蛋白表达量而非mRNA转录组水平。
测试例5：诱导MV-4-11肿瘤细胞系G1周期阻滞。
细胞周期阻滞实验原理及实验方法：PI法是经典的周期检测方法。PI是一种核酸染料，可以与DNA特异性结合。PI染色后，一般G2/M期细胞的荧光强度为G0/G1期细胞的2倍，为正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2倍。通过流式，可以考察不同DNA荧光强度的细胞在整个细胞群体中所占的比例，从而确定不同细胞周期的分布情况。具体实验步骤如下：
1)细胞培养：六孔板种下细胞，每孔1*106个,细胞处于生长对数期,待细胞稳定3-4h,不同化合物处理相应时间后，收细胞检测；2)细胞处理：收集细胞于2ml离心管中，1000rpm离心5min，用1mL预冷PBS重悬洗涤，小心地吸去上清；3)细胞固定：300μL PBS充分重悬，边震荡边加入预冷无水乙醇700μL，至终浓度75％，并轻轻震荡是细胞成单细胞，4度静置固定过夜；4)将过夜固定好的细胞用预冷PBS洗两次，1000rpm 10min离心后加入1mLPBS。移至1.5mL EP管中,轻轻吹起分散细胞，避免细胞成团；5)加入2μL RNA酶(工作浓度20μg/mL)，消化RNA，重悬细胞，37℃水浴消化15min；6)加入PI染料5μL至终浓度10μg/mL，避光4℃染色30min，1h内上流式检测；7)充分混匀细胞，用200目滤网过滤后，便可利用流式细胞仪进行细胞周期；8)数据的收集和分析；用流式细胞仪检测红色荧光。采用FlowJo软件进行细胞DNA含量分析。
结果如图6所示，随着化合物2药物浓度上升，浓度设置为作用12.5nM、25nM、50nM、100nM和200nM共5个梯度，作用MV-4-11肿瘤细胞系24小时，可以看到该细胞系有G1期阻滞。
测试例6：化合物2诱导MV-4-11肿瘤细胞系凋亡。
实验步骤：1)按实验方案在6孔板中接种细胞，每个孔中接种50W细胞并稳定数小时，待细胞恢复正常培养状态后，再对细胞进行不同浓度的化合物处理，48h后收集细胞；2)到达实验终点时，以下所有步骤需轻柔缓慢，避免造成实验假阳性。首先离心收集细胞(1000rpm，5min)，用PBS洗涤细胞二次；3)吸取500μL凋亡检测试剂盒的Binding Buffer轻柔重悬浮细胞样品；4)然后每个样品中加入5μL试剂盒提供的Annexin V-FITC试剂并与细胞轻轻混匀，室温条件下，避光染色15min；5)随后每个样品中再加入5μL试剂盒提供的PI(碘化丙啶)染液并与细胞轻轻混匀，室温条件下，避光染色5min；6)而后，充分混匀细胞，并用200目过滤网过滤细胞，可上机检测，尽量在1h内进行流式细胞仪检测7)流式细胞仪检测(C6流式细胞仪，BD公司)：首先先圈出活细胞群，然后经去粘连后圈出单细胞群，然后每个样品收集30000个细胞，使用FL1通道检测Annexin V-FITC荧光，再通过FL3通道检测PI荧光；8)收集数据后，使用Flowjo10软件进行数据分析和处理。
结果如图7所示，随着化合物2处理浓度上升，浓度设置为作用12.5nM、25nM、50nM、100nM和200nM共5个梯度，作用MV-4-11肿瘤细胞系48小时，可以显著看到细胞凋亡随浓度增长而增加，有接近20％细胞发生凋亡。
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