一种水蛭药材、饮片及炮制品的体外生物活性测定方法
技术领域
本发明涉及一种水蛭药材、饮片及炮制品的体外生物活性测定方法。属中药领域。
背景技术
水蛭为动物类药材，味咸、苦，性平，归肝经，具有破血逐瘀的功效，临床以口服给药为主，多用于治疗脑血管疾病、冠心病心绞痛、中风偏瘫等，收载于各版的《中国药典》，其药材为水蛭科动物蚂蟥(宽体金线蛭)Whitmania pigra Whitman、水蛭(日本医蛭)Hirudonipponica Whitman或柳叶蚂蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥全体，夏、秋二季捕捉，用沸水烫死，晒干或低温干燥；其饮片为洗净，切段，干燥；其炮制品为烫水蛭，为取净水蛭段，照烫法(《中国药典》通则0213)用滑石粉烫至微鼓起。
动物药具有成分复杂、药效物质基础不明确，质控指标与药效关联性不强等特点。目前，大多数动物类中药还是主要依靠性状鉴定、显微鉴定及理化鉴定方法，含量测定项也大多以直接测定蛋白质含量进行质量控制，质控方法缺乏全面性、针对性和专属性，这也是构建和完善动物药材质量评价体系的难点和重点之一。生物活性测定法主要针对的是临床或药理药效作用明确但组分较多且药效物质基础不明确的药材而发展起来的一种质量控制方法。因此，生物活性测定法非常契合动物类中药的特点，可作为质量评控发展的共识性方向。
水蛭是《中国药典》唯一采用生物活性测定方法的动物类中药材，其药材标准采用凝血酶滴定法测定抗凝血酶活性(水蛭饮片和炮制品未进行生物活性测定)，具体为以0.9％氯化钠溶液作为提取溶剂、以凝血酶滴定至产生凝固、以消耗的凝血酶的量来计算抗凝血酶活性，并规定了药材的效价限值：宽体金线蛭的抗凝血酶活性不得低于4.0U/g，日本医蛭的抗凝血酶活性不得低于16.0U/g。此检验方法存在一定的局限性：一是其只能对原药材进行控制，对饮片及炮制品无法进行测定，水蛭饮片和炮制品均需经加热处理，处理后蛋白质已经变性(水蛭素类成分也是蛋白质的一种)，生理盐水无法溶解提取出来，检测不出抗凝血酶活性；二是此生物活性测定法表征的抗凝活性与在体药效作用相关性不强，药典水蛭药材项下凝血酶滴定法体外测定蚂蟥(宽体金线蛭)和水蛭(日本医蛭)的抗凝活性相差4倍多，而大量的动物体内药效学实验结果表明宽体金线蛭和日本医蛭的体内药效活性基本相当、没有像药材生物活性测定结果那样出现效果相差四倍的情况，而且二者在临床口服制剂的疗效也基本相当，分析原因，水蛭药材项下的抗凝血酶活性测定是检测生理盐水提取的大分子水蛭素类物质的作用，但水蛭素主要存在于日本医蛭等吸血水蛭的唾液腺中，非吸血水蛭如宽体金线蛭中尚未发现水蛭素，因此导致体外活性检测二者相差较大，而通过口服后，日本医蛭中的水蛭素等大分子蛋白类物质在胃肠道内被降解为小分子肽才能吸收入血，日本医蛭的水蛭素结构被破坏、抗凝活性减弱，而宽体金线蛭则受影响较小，导致二者在体内抗凝血酶活性基本相当，水蛭的体外生物活性测定方法与体内药效作用相关性不强。
大分子蛋白在胃肠道内降解为小分子肽类物质，才能经肠道跨膜吸收入血发挥其药效作用，因此以大分子蛋白的抗凝血酶活性来界定水蛭药材的优劣不够科学，应该以其体内代谢产物——小分子肽类作为质控指标，才能真正评价水蛭药材的品质优劣。
本发明专利的水蛭体外生物活性测定方法，待测供试品溶液是在体外将水蛭大分子蛋白以蛋白酶酶解为小分子肽类成分，再测定小分子肽类溶液的体外生物活性，这与在体药效活性之间关联性极强，可作为评价水蛭药材、饮片、炮制品的指标。
发明内容
本发明的目的在于提供一种更有效的、临床相关性强的水蛭药材、饮片及炮制品的体外生物活性测定方法。
本发明目的目的是这样实现的：
发明人提供一种水蛭药材、饮片及炮制品的体外生物活性测定方法：
(1)供试品溶液的制备：取水蛭，粉碎过三号筛，称取2.5g，精密称定，加入水20ml，称定重量，85℃加热15分钟，冷却至40℃，用稀盐酸调节pH为2.0，加入酶底比1％的胃蛋白酶，40℃酶解1小时，用20％氢氧化钠溶液调节pH为8.0，加入酶底比1％的胰蛋白酶，40℃酶解3小时，加稀盐酸调节pH至近中性，85℃加热15分钟，待冷至室温，高速离心，上清液置25ml量瓶中，沉淀再加水5ml洗涤，高速离心，上清液并入量瓶中，加水至刻度，混匀，滤过，即得；
(2)测定法：精密量取供试品溶液100μl，置试管中，加入含有0.5％纤维蛋白原(以固形物计)的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液200μl，摇匀，置37℃水浴中温浸5分钟，滴加每1ml中含10单位的凝血酶溶液(每4分钟滴加1次，每次2μl，边滴加边轻轻摇匀)至凝固，记录消耗凝血酶溶液体积，按下式计算抗凝血酶活力：
U＝C1V1/(C2V2)
式中：U——每1g水蛭含抗凝血酶活性单位，U/g；
C1——凝血酶溶液的浓度，U/ml；
C2——供试品溶液的浓度，g/ml；
V1——消耗凝血酶溶液的体积，μl；
V1——供试品溶液的加入量，μl。
以上工艺中所用的胃蛋白酶酶活力为1:15000，胰蛋白酶酶活力为2500U/mg。
本发明是经过大量的试验所得到的，克服了中国药典项下的只能测定药材生物活性、生物活性与在体相关性不强的缺点。
有益效果
为进一步验证本发明水蛭生物活性测定方法与在体药效的相关性，发明人进行了动物药效学实验：
现代研究表明血液流变学、血液循环及血液理化的改变为血瘀证发生的主要生化基础，血瘀证实验室诊断评价的指标有血液流变学、凝血、血液动力学、血小板聚集等七个方面，其中凝血指标和血液流变学成为血瘀证诊断和活血化瘀类中药研究的主要指标。急性血瘀模型具有与临床相关性较强，成功率较高，应用广泛的特点。因此本发明体内药效学研究采用急性血瘀大鼠模型来研究宽体金线蛭和日本医蛭对凝血系统的影响，通过测定凝血相关指标，真实的反映出宽体金线蛭和日本医蛭在体内活血化瘀的作用，为水蛭体外生物活性测定方法的建立奠定基础。
1.实验仪器
Xi1000型全自动凝血测试仪(北京众驰伟业科技发展有限公司)；N6C型全自动血液流变仪(北京普利生仪器有限公司生产)；AL-204型万分之一电子天平(瑞士MettlerToledo公司)；Centrifuge 5810R型高速冷冻式离心机(德国eppendorf股份有限公司)；FD-1A-50型冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)。
2.实验材料
盐酸肾上腺素(批号：Y03J7C15662，纯度：≥99％)、柠檬酸钠(批号：R23M10P89097，纯度：≥99.5％)均由上海源叶生物科技有限公司提供；水合氯醛(天津市大茂化学试剂厂，批号：20190301，纯度≥99.5％)；凝血酶原时间(PT)测定试剂盒(批号：2019-311402)、活化部分凝血酶原时间(APTT)测定试剂盒(批号：2019-312209)、凝血酶时间(TT)试剂盒(批号：2019-313402)均由北京众驰伟业科技发展有限公司提供；阿司匹林(肠溶包衣片，批号：190411202，规格：25mg/片)、生理盐水(批号：1910242706)均由辰欣药业股份有限公司提供；其余试剂均为分析纯；实验用水为去离子水。
3.实验动物
SPF级SD大鼠54只，雌性，体质量(200±10)g，由山东济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(鲁)20190003。
4.实验方法
4.1水蛭样品的制备
水蛭(日本医蛭)：取日本医蛭鲜品，匀浆，冻干，粉碎，过5号筛，即得。
蚂蟥(宽体金线蛭)：吊干品，取宽体金线蛭药材去除杂质(净制)、切段，粉碎，过5号筛，即得。
烫水蛭(烫宽体金线蛭)：《中国药典》水蛭项下炮制品，将50g滑石粉置于锅内，武火加热至灵活状态时后，加入宽体金线蛭段100g，不断翻动，烫至微鼓起时取出，筛去滑石粉，放凉，粉碎，过5号筛，即得。
制水蛭(制宽体金线蛭)：《山东省中药材炮制规范》水蛭项下炮制品，取宽体金线蛭段100g，用10g黄酒拌匀，闷润至药材透心。先用中火将锅烧热，再将10g麦麸皮均匀的撒入锅内，待冒烟时，倒入酒润水蛭段，拌炒至表面呈黄色，有特殊气味逸出时，迅速取出，筛出焦麦麸，放凉，粉碎，过5号筛，即得。
4.2分组、造模与给药
所有大鼠适应性喂养一周后，将其随机分为15组，分别为空白组，模型组，阿司匹林组(阳性对照)，日本医蛭低、中、高剂量组，宽体金线蛭低、中、高剂量组，烫宽体金线蛭低、中、高剂量组，制宽体金线蛭低、中、高剂量组，每组6只。除空白组大鼠皮下注射等体积生理盐水外，其余组大鼠每天2次皮下注射盐酸肾上腺素0.9mg/kg(溶剂为生理盐水，间隔4h)，在第1次皮下注射2h后，将大鼠置于冰水浴中4min，重复上述操作15d以复制急性血瘀模型。在造模的第8天起，给药各剂量组大鼠每天在第2次注射盐酸肾上腺素1h后分别按0.35、1.4、3.5g/kg(以生药量计，溶剂为生理盐水)灌胃相应水蛭，阿司匹林组大鼠同时间段内按0.2g/kg(溶剂为生理盐水)灌胃阿司匹林，空白组和模型组大鼠同时间段内灌胃相同体积生理盐水，每天1次，连续8天。
4.3血样采集
末次给药第二天，所有大鼠禁食不禁水12h，以10％水合氯醛麻醉后，腹主动脉取血，其中部分全血分装于肝素抗凝管中，其余全血加入到含3.2％枸橼酸钠的抗凝管中(血液与抗凝剂体积比9:1)。
4.4凝血系统相关指标的检测
取经3.2％枸橼酸钠抗凝的全血，以3500r/min离心15min，制备PPP。采用全自动血凝仪测定凝血酶原时间(即PT)、活化部分凝血酶原时间(即APTT)、凝血酶时间(即TT)，操作按照仪器和试剂盒的说明进行。
4.5统计学分析
采用SPSS 20.0统计软件对数据进行统计分析，以Mean±SD表示，多组样本间差异用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett-t法。P<0.05表示差异有统计学意义。
5.实验结果
APTT、PT、TT分别反映的是血液凝固的外源性途径、内源性途径和共同途径。宽体金线蛭和日本医蛭对凝血时间的影响结果见下表。
表各组大鼠的凝血指标测定结果(x±s，n＝6，s)
注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01
实验通过注射盐酸肾上腺素致使大鼠体温升高，心率加快来模拟暴怒时机体变化，同时结合冰水浸泡模拟寒邪，二者共同作用于机体，从而引起血瘀证的方法进行造模。此外，本实验利用雌性大鼠易怒、机体变化受温度影响较大的特点，选用雌性大鼠进行造模。阿司匹林为临床广泛使用的治疗心血管疾病的药物，其采用口服的方式进行给药，与水蛭的给药方式相同，更具有可比性，故将其视为阳性药物。
体内药效学结果表明宽体金线蛭和日本医蛭均能显著延长TT，且给药剂量与TT有一定的量效关系(趋势)，宽体金线蛭对于APTT具有一定的延长效果，但并不显著，日本医蛭和阳性药物阿司匹林对APTT的延长作用稍显著，各药物对PT均没有很好的延长效果，表明水蛭对延长TT指标最为敏感，而对于延长APTT和PT的敏感度相对较低。
此外可以看出宽体金线蛭和日本医蛭的体内药效差距较小，这与关世侠、王志斌等的体内药效研究结果相一致。而2020版《中国药典》水蛭药材项下，采用凝血酶滴定法体外检测宽体金线蛭和日本医蛭的抗凝活性，二者相差4倍之多，这表明现版药典水蛭的抗凝活性检测方法与在体药效作用相关性不强。
具体实施方式
下面列举实施例，进一步说明本发明，各实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明：
实施例1
测定不同批次宽体金线蛭饮片的抗凝血酶活性：采集了江苏省如皋市、山东省济宁市、浙江省平湖市3个宽体金线蛭主产地共计15批宽体金线蛭药材，
供试品溶液的制备：取水蛭，粉碎过三号筛，称取2.5g，精密称定，加入水20ml，称定重量，85℃加热15分钟，冷却至40℃，用稀盐酸调节pH为2.0，加入酶底比1％的胃蛋白酶(酶活力为1:15000)，40℃酶解1小时，用20％氢氧化钠溶液调节pH为8.0，加入酶底比1％的胰蛋白酶(酶活力为2500U/mg)，40℃酶解3小时，加稀盐酸调节pH至近中性，85℃加热15分钟，待冷至室温，高速离心，上清液置25ml量瓶中，沉淀再加水5ml洗涤，高速离心，上清液并入量瓶中，加水至刻度，混匀，滤过，即得；
测定法：精密量取供试品溶液100μl，置试管中，加入含有0.5％纤维蛋白原(以固形物计)的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液200μl，摇匀，置37℃水浴中温浸5分钟，滴加每1ml中含10单位的凝血酶溶液(每4分钟滴加1次，每次2μl，边滴加边轻轻摇匀)至凝固，记录消耗凝血酶溶液体积，按下式计算抗凝血酶活力：
U＝C1V1/(C2V2)
式中：U——每1g水蛭含抗凝血酶活性单位，U/g；
C1——凝血酶溶液的浓度，U/ml；
C2——供试品溶液的浓度，g/ml；
V1——消耗凝血酶溶液的体积，μl；
V1——供试品溶液的加入量，μl。
测定结果见下表。
表水蛭体外抗凝血酶活力测定结果表
由上表结果可知，宽体金线蛭体外抗凝血酶活力测定范围为10U～14U，平均值为11.73U；日本医蛭抗凝血酶活性为16U，略高于宽体金线蛭，与在体药效结论基本相当。
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