发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测阿特拉津的非固定型核酸适配体光电传感器。本发明利用石墨烯与适配体之间的π-π堆叠作用制备APT-GN复合物作为识别元件，同时利用Ag-S键自组装作用对Ag NPs/BiOBr/ITO电极表面进行巯基功能化，得到作为传感电极的MCT/Ag NPs/BiOBr/ITO电极，进而得到基于石墨烯-硫醇信号调控的非固定型核酸适配体光电传感器。本发明采用非固定型传感策略，毋须将识别元件固定在电极上，即可在均相溶液中实现对ATZ的高效分析检测，避免了适配体在电极上的直接修饰过程，有效提升了传感器的稳定性和灵敏度，检测限低至1.2pM。此外，采用核酸适配体作为识别元件，大大提高了传感器的选择性，该方法操作简单，快速高效，可用于痕量污染物的检测分析。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种用于检测阿特拉津的非固定型核酸适配体光电传感器的制备方法，该方法包括APT-GN复合物的制备及MCT/Ag NPs/BiOBr/ITO电极的制备；

所述的APT-GN复合物的制备方法为：将石墨烯分散液与阿特拉津核酸适配体混合，经超声、分离后，得到APT-GN复合物；

所述的MCT/Ag NPs/BiOBr/ITO电极的制备方法包括以下步骤：

1)将BiOBr分散液滴涂在预处理后的ITO电极表面，干燥后得到BiOBr/ITO电极；

2)在BiOBr/ITO电极表面沉积Ag NPs，得到Ag NPs/BiOBr/ITO电极；

3)将Ag NPs/BiOBr/ITO电极置于MCT溶液中浸泡，得到MCT/Ag NPs/BiOBr/ITO电极；

所述的MCT为正辛硫醇。

进一步地，所述的石墨烯分散液的制备过程为：将石墨烯超声分散在水中，配制成浓度为0.10-0.20mg/mL的分散液，即为所述的石墨烯分散液；混合过程为：将1OD的阿特拉津核酸适配体于5000-10000r/min下离心2-3min，之后加入石墨烯分散液，使阿特拉津核酸适配体的浓度为8-12μmol/L。

进一步地，超声过程为：在冰浴中超声2-3h；分离过程为：在2000-4000r/min下离心3-5min，之后弃去下层大块石墨烯。

进一步地，步骤1)中，所述的BiOBr分散液的制备过程为：将Bi(NO₃)₃的乙二醇溶液加入至KBr的乙二醇溶液中，先搅拌30-40min，再超声10-15min，之后在175-185℃下反应5-7h，经分离(先离心，再用水和乙醇分别清洗2-3次，之后放在55-65℃烘箱中干燥6-8h)后得到BiOBr，并将BiOBr配制成30-40mg/mL的分散液，即为所述的BiOBr分散液。采用水热法制备BiOBr。

进一步地，步骤1)中，所述的ITO电极的预处理过程为：将ITO电极依次置于NaOH溶液、丙酮、乙醇及去离子水中，分别超声清洗10-15min，之后在空气气氛下晾干。

优选地，所述的ITO电极为1.0×5.0cm的氧化铟锡透明导电玻璃。

进一步地，步骤2)中，所述的Ag NPs的沉积过程为：将BiOBr/ITO电极浸入至1-3mmol/L的AgNO₃溶液中，然后用250-350W的Xe灯照射1-1.5h。采用光还原法沉积Ag NPs。

进一步地，步骤3)中，所述的MCT溶液为MCT的乙醇溶液，浓度为30-50mmol/L；浸泡时间为20-25h。

一种用于检测阿特拉津的非固定型核酸适配体光电传感器，该传感器采用所述的方法制备而成，所述的传感器包括APT-GN复合物及MCT/Ag NPs/BiOBr/ITO电极。

一种用于检测阿特拉津的非固定型核酸适配体光电传感器的应用，所述的传感器用于对水环境中的阿特拉津进行检测。通过适配体识别过程中被游离的石墨烯对电极产生的信号增敏效应实现对阿特拉津的分析检测。

进一步地，检测过程为：在MCT/Ag NPs/BiOBr/ITO电极表面滴加孵育体系，并孵育1-2h，经清洗、晾干后(浸入高纯水中轻轻蘸洗，放在空气气氛下晾干)以孵育后的MCT/AgNPs/BiOBr/ITO电极为工作电极，铂片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，PBS缓冲液(0.1mol/L)为支持电解液，建立三电极体系，在可见光下测定光电流密度的增量，根据光电流密度的增量与阿特拉津浓度的对应关系，得到水环境中的阿特拉津浓度；所述的孵育体系包括Tris-HCl缓冲液(10-20μL)、APT-GN复合物(5-10μL)、待检测水溶液(3-6μL)及DNaseI酶溶液(2-4μL)。可先将孵育体系中的待检测水溶液换成不同浓度的阿特拉津溶液进行孵育，在PBS缓冲溶液中测定不同浓度阿特拉津孵育下的I-t曲线，根据游离出来的石墨烯在电极上组装所引起的光电流密度增量与阿特拉津浓度的对数关系绘制工作曲线；在对待检测水溶液进行检测时，利用工作曲线和光电流密度的增量得到阿特拉津的浓度。

该传感器可进行选择性测定：在孵育体系中同时加入不同的干扰物质，用I-t曲线测定光电流变化，计算与不含干扰物质条件下的光电流的相对比率，考察传感器的选择性。

具体而言，对该非固定型核酸适配体光电传感器进行选择性测定的方法为：将100倍浓度的含其他干扰物质的溶液加入到孵育体系当中，采用上述同样方法、在相同条件下进行I-t曲线，研究光电流密度增量的变化情况，考察传感器的选择性能。所述的干扰物质为草甘膦、杀虫单、氧乐果、啶虫脒、敌百虫或四螨嗪。

非固定型传感过程中无需将识别元件固定到电极表面，即识别元件对目标物的捕获和结合过程在均相溶液中进行，通过该过程中产生的光电化学信号的变化实现对目标物的定量检测。与传统的固定型传感方法相比，由于其极大地避免了复杂繁琐的固定化过程，操作简单方便，也可实现电极的重复利用，大大提高了传感检测的稳定性，也降低了检测成本。此外，溶液中存在的适配体识别元件可以充分地识别阿特拉津并与之结合，提高了检测的灵敏度，可以检测到pM浓度下的信号变化。

光电化学(PEC)分析方法结合了光催化和电化学催化两者的优势，与单一的技术相比具有更高的催化活性和检测灵敏度。在光电化学过程中，光电材料的激发和电流信号的检出两种能量形式分开进行，极大地降低了背景信号，可获得超高的灵敏度和稳定性。本发明以BiOBr/Ag NPs作为光电基底材料，其本身较窄的带隙使其具备良好的可见光吸收性能，具有表面等离子体效应的Ag NPs的沉积也进一步促进了复合材料对光的吸收和对载流子的传输性能，同时也为硫醇的组装提供了大量的负载位点。因此，本发明采用光电化学手段为痕量目标物的检测提供了良好的技术基础，对于实现阿特拉津的高效检测具有重要的意义。

核酸适配体(aptamer)又称“人工抗体”，是一类通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)在体外筛选得到的单链DNA或RNA片段，能与相应靶标专一而紧密地结合，从而实现对目标分子的特异性检测。将适配体作为识别单元，具有尺寸小、亲和性好、易于人工合成和修饰、稳定性强、用于检测小分子时检测限低等优点。因此，本发明将核酸适配体作为识别元件，构筑用于检测阿特拉津的非固定型核酸适配体光电传感器，以获得良好的选择性。

石墨烯(Graphene)是由单层碳原子通过sp²杂化方式紧密堆积而成的二维结构零带隙材料，它具有较大的比表面积，优异的导电性和光吸收性能，较高的化学稳定性和机械稳定性，较快的电荷迁移速率，良好的生物相容性等优势。特别是石墨烯本身独特的二维平面共轭结构和表面强烈的疏水作用，能与DNA等生物分子产生π-π相互作用，从而实现稳定的结合与负载，同时也有效保护DNA不被剪切酶裂解，这不仅为构筑适配体传感平台提供了优良的载体，同时也极大地促进了电荷传输速率，为实现传感体系的高灵敏度检测提供了重要基础。

现有阿特拉津传感技术需要将酶、抗体、适配体、分子印迹等化学识别元件固定到电极表面，往往存在着电极的几何面积较小、识别元件负载量有限、极易达到饱和吸附状态、电极难以重复利用、固定过程耗时复杂、成本较高、识别分子的组装不稳定、易脱落等问题。本发明针对上述问题，构筑了非固定型核酸适配体光电传感器，用于实现对阿特拉津的高效分析检测。

具体而言，利用适配体与石墨烯之间的π-π堆叠作用形成适配体-石墨烯复合物(APT-GN)，其中适配体作为识别元件，石墨烯作为信号调控“开关”，同时以巯基功能化的BiOBr/Ag NPs电极作为光电信号阻断的基底电极，通过水热法合成可见光响应良好的BiOBr光电材料，利用光还原过程沉积Ag NPs，不仅显著增强电极的光吸收能力，同时也为硫醇的组装提供大量的负载位点，从而获得信号阻断的巯基功能化BiOBr/Ag NPs电极。当体系中存在ATZ时，由于ATZ与适配体特异性结合成新的复合物，使石墨烯脱离下来并结合到巯基功能化BiOBr/Ag NPs电极表面，打开光电流响应信号。同时体系中加入的DNase I剪切酶也可在特定位点剪切适配体链，释放ATZ，实现目标物的循环回收及信号放大。通过光电流增量与ATZ浓度间的对应关系建立定量分析传感传感平台。该传感体系对ATZ检测的线性范围为5.0pM-10.0nM，检测限低至1.2pM。同时由于适配体的特异性作用，传感体系在100倍浓度干扰物存在下仍表现出优异的选择性，在实际水样分析中也具有良好的应用前景。

与现有技术相比，本发明具有以下特点：

1)本发明中传感器对ATZ的分析检测过程在均相溶液中进行而非传感电极表面。构筑非固定型的均相溶液检测体系有效避免了识别元件在传感电极表面复杂繁琐的固定过程，同时也可使体系中的目标物与适配体之间发生充分的识别与结合作用，避免了因识别元件在电极上的负载量有限，极易达到饱和吸附状态的限制，此外，也有效地防止了持续光照下因电极温度过高而导致的电极表面识别元件变性失活等问题，从而大大提高了对阿特拉津的检测效果。

2)利用可见光吸收性能良好的BiOBr/Ag NPs作为光电基底材料，BiOBr材料因其本身较窄的带隙而具备良好的可见光吸收性能，具有表面等离子体效应的Ag NPs的沉积也进一步促进了复合材料对光的吸收和对载流子的传输性能，同时也为硫醇的组装提供了大量的附着位点，为实现高灵敏度检测提供了基础。

3)本发明利用DNase I核酸内切酶辅助目标物循环回收实现了信号的有效放大，DNase I酶对适配体的消化作用促进更多游离石墨烯的释放，游离石墨烯在巯基化电极表面的组装作为信号开关，有效地打开了被阻断的光生载流子转移通道，实现了光电流响应信号的放大，也极大地提高了对ATZ的检测灵敏度。

4)本发明利用核酸适配体作为识别元件，通过π-π堆叠作用与石墨烯结合，具有步骤简单、易于实现、不需要修饰固定在电极上等优点，在检测过程中能够实现对目标分子ATZ的特异性识别，有效提高了传感器的选择性。

5)本发明中的非固定型适配体传感器，基于非固定型传感分析策略的优势，结合高灵敏的光电化学分析手段，借助核酸适配体的高选择性、高亲和力等特性，进一步利用石墨烯本身的信号增敏效应，实现了对水样中痕量阿特拉津的高灵敏度、高选择性检测，其线性检测范围为5.0pM-10.0nM，检测限低至1.2pM。该方法简便高效、快速灵敏，有望用于环境中的现场监测。