一种生物酶催化的乙酰基羟脯氨酸的合成方法
技术领域
本发明属于生物有机合成、医药、化妆品等领域，具体涉及一种生物酶催化的乙酰基羟脯氨酸的合成方法。
背景技术
乙酰基羟脯氨酸，化学名为N-乙酰-L-4-羟基脯氨酸，分子式:C7H11NO4，CAS登录号33996-33-7，其结构式如下：
胶原蛋白中含有约10％的羟基脯氨酸，乙酰羟基脯氨酸是乙酰化修饰过的氨基酸衍生物，是一种具有屏障保护作用的化妆品/准药品原料。乙酰羟基脯氨酸具有长效保湿、促进神经酰胺合成、缓解特应性皮炎患者瘙痒、修复皮肤细纹、促进胶原蛋白合成、增强皮肤渗透性等功效。在化妆品行业，主要用于抗衰老、抗皱、保湿。
对于乙酰基羟脯氨酸的合成，目前公开的文献基本采用化学合成的方法，本发明提供一种生物酶催化的乙酰基羟脯氨酸的合成方法。该方法的特点在于使用酰基转移酶催化羟基脯氨酸发生酯交换反应，从而合成N-乙酰-L-4-羟基脯氨酸。该方法操作简便，试剂廉价易得，具有良好的工业应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供，以羟基脯氨酸和乙酸酯为原料，酰基转移酶作为生物酶催化剂，一步反应合成N-乙酰-L-4-羟基脯氨酸的方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种生物酶催化的乙酰基羟脯氨酸的合成方法，其以羟基脯氨酸和乙酸酯为原料，在含有酰基转移酶的pH为7.0～10.0的水相缓冲溶液中反应，从而制备乙酰基羟脯氨酸。
优选地，所述酰基转移酶选自文献(Adv.Synth.Catal.Volume 360,Issue 24，December 21,2018，Pages 4814-4819)报导的MsAcT，其制备方法参照该文献实验部分MsAcT的克隆、过表达及纯化。
优选地，所述乙酸酯选自乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯等。
优选地，在起始反应体系中，所述酰基转移酶：羟基脯氨酸：乙酸酯的投料质量比为0.02-0.1:1:1-2。
优选地，所述的缓冲溶液为磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
优选地，具体实施过程如下：在反应容器中依次加入所述的缓冲溶液、羟基脯氨酸、乙酸酯和酰基转移酶，搅拌均匀，在25-45℃和氮气吹扫的条件下，HPLC检测反应进程，当转化率达90-99％时，调节反应体系pH至3-5，硅藻土过滤，并在滤液中加入二氯甲烷进行多次萃取，旋转蒸发脱去溶剂后得到乙酰基羟脯氨酸产品。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明采用了酰基转移酶催化羟基脯氨酸与乙酸酯发生酯交换反应来合成乙酰基羟脯氨酸，整个制备过程中，底物稳定性好，酶转化率高，操作简单方便，后续产物无蛋白残留，且产物的纯度高。
具体实施方式
本发明的反应式如下：
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为常规实验中的条件。
实施例1
于500mL三口烧瓶中，依次加入0.1M pH 8.0PBS缓冲溶液200mL，酰基转移酶MsAcT0.5克，羟基脯氨酸10克，乙酸乙酯11克，于25℃，200rpm搅拌桨搅拌，0.01MPa氮气吹扫的条件下，反应24h，HPLC检测转化率95％。加入盐酸调节pH至3-5，硅藻土过滤，加入等体积二氯甲烷萃取两次，旋转蒸发得到产物12克，纯度98％。
实施例2
于500mL三口烧瓶中，依次加入0.1M pH 8.5PBS缓冲溶液200mL，酰基转移酶MsAcT0.5克，羟基脯氨酸10克，乙酸乙烯酯10克，于30℃，200rpm搅拌桨搅拌，0.01MPa氮气吹扫的条件下，反应24h，HPLC检测转化率95％。加入盐酸调节pH至3-5，硅藻土过滤，加入等体积二氯甲烷萃取两次，旋转蒸发得到产物11克，纯度98％。
实施例3
于500mL三口烧瓶中，依次加入0.1M pH 9PBS缓冲溶液200mL，酰基转移酶MsAcT0.4克，羟基脯氨酸10克，乙酸丙酯12克，于30℃，200rpm搅拌桨搅拌，0.01MPa氮气吹扫的条件下，反应24h，HPLC检测转化率95％。加入盐酸调节pH至3-5，硅藻土过滤，加入等体积二氯甲烷萃取两次，旋转蒸发得到产物10克，纯度98％。
实施例4
于500mL三口烧瓶中，依次加入0.1M pH 9PBS缓冲溶液200mL，酰基转移酶MsAcT0.4克，羟基脯氨酸10克，乙酸丁酯13克，于30℃，200rpm搅拌桨搅拌，0.01MPa氮气吹扫的条件下，反应24h，HPLC检测转化率95％。加入盐酸调节pH至3-5，硅藻土过滤，加入等体积二氯甲烷萃取两次，旋转蒸发得到产物9克，纯度98％。
实施例5
于500mL三口烧瓶中，依次加入0.1M pH 8.0PBS缓冲溶液200mL，酰基转移酶MsAcT0.5克，羟基脯氨酸10克，乙酸乙酯10克，于30℃，200rpm搅拌桨搅拌，0.01MPa氮气吹扫的条件下，反应24h，HPLC检测转化率95％。加入盐酸调节pH至3-5，硅藻土过滤，加入等体积二氯甲烷萃取两次，旋转蒸发得到产物12克，纯度98％。
实施例6
于500mL三口烧瓶中，依次加入0.1M pH 8.0PBS缓冲溶液200mL，酰基转移酶MsAcT0.4克，羟基脯氨酸10克，乙酸乙酯10克，于25℃，200rpm搅拌桨搅拌，0.01MPa氮气吹扫的条件下，反应24h，HPLC检测转化率95％。加入盐酸调节pH至3-5，硅藻土过滤，加入等体积二氯甲烷萃取两次，旋转蒸发得到产物11克，纯度98％。
实施例7
于500mL三口烧瓶中，依次加入0.1M pH 8.0PBS缓冲溶液200mL，酰基转移酶MsAcT0.4克，羟基脯氨酸10克，乙酸乙酯10克，于30℃，200rpm搅拌桨搅拌，0.01MPa氮气吹扫的条件下，反应22h，HPLC检测转化率95％。加入盐酸调节pH至3-5，硅藻土过滤，加入等体积二氯甲烷萃取两次，旋转蒸发得到产物12克，纯度98％。
实施例8
于500mL三口烧瓶中，依次加入0.1M pH 8.5PBS缓冲溶液200mL，酰基转移酶MsAcT0.4克，羟基脯氨酸10克，乙酸乙酯10克，于30℃，200rpm搅拌桨搅拌，0.01MPa氮气吹扫的条件下，反应16h，HPLC检测转化率95％。加入盐酸调节pH至3-5，硅藻土过滤，加入等体积二氯甲烷萃取两次，旋转蒸发得到产物11克，纯度98％。
实施例9
于500mL三口烧瓶中，依次加入0.1M pH 8.5PBS缓冲溶液200mL，酰基转移酶MsAcT0.4克，羟基脯氨酸10克，乙酸乙酯10克，于30℃，200rpm搅拌桨搅拌，0.01MPa氮气吹扫的条件下，反应13h，HPLC检测转化率95％。加入盐酸调节pH至3-5，硅藻土过滤，加入等体积二氯甲烷萃取两次，旋转蒸发得到产物10克，纯度98％。
实施例10
于500mL三口烧瓶中，依次加入0.1M pH 9PBS缓冲溶液200mL，酰基转移酶MsAcT0.5克，羟基脯氨酸10克，乙酸乙酯10克，于30℃，200rpm搅拌桨搅拌，0.01MPa氮气吹扫的条件下，反应10h，HPLC检测转化率95％。加入盐酸调节pH至3-5，硅藻土过滤，加入等体积二氯甲烷萃取两次，旋转蒸发得到产物9克，纯度98％。
