一种将l-色氨酸转化为色胺和d-色氨酸的方法
技术领域
本发明涉及生物工程
技术领域
，具体涉及一种将L-色氨酸转化为色胺和D-色氨酸的方法。背景技术
色氨酸(tryptophan，TRP)是一种必需氨基酸，人体不能自身合成，只能从饮食中摄取，其主要功能是参与蛋白质合成，同时也是多种生物活性化合物的前体。色氨酸有L-色氨酸和D-色氨酸两种对映体。由于只有L-氨基酸才能组成蛋白质，D-氨基酸不能合成蛋白质，以至于长期研究倾向于L-氨基酸。近年来，随着科学研究的深入和各种新药的开发，人们对D-氨基酸的重要性有了深入的认识。D-色氨酸具有特殊的生理学性质，在医药、食品、饲料工业以及农业中均有应用，可作为非营养性甜味剂、饲料添加剂、植物生长剂等，特别是在医药工业中，D-色氨酸是抗癌剂和免疫抑制剂的重要合成前体。与L-色氨酸相比，D-色氨酸的研究相对较少，还未实现规模化生产，主要依赖于进口，因此，D-色氨酸的价格比较昂贵。
色胺(Tryptamine)是一种单胺生物碱，可能作为神经调节剂和神经递质发挥作用。它是hTAAR1的激动剂，还是非选择性的serotonin receptor激动剂和羟色胺-去甲肾上腺素-多巴胺释放剂(SNDRA)，其结构式如下：
目前我国的色胺类产品还是主要依赖于进口(陈宁等，2017)，其价格相当昂贵。
因此，将市场价值较低的L-色氨酸转化为高价值的D-色氨酸和色胺将具有广阔的市场应用前景。
从L-色氨酸制备D-色氨酸，目前的制备工艺大多是先合成DL-色氨酸，然后通过不同的拆分方法制得D-色氨酸。但普遍存在工艺繁杂、所使用的原料成本高、不易获得等问题。
从L-色氨酸制备色胺，目前主要是利用色氨酸脱羧酶，色氨酸脱羧酶(Tryptophandecarboxylase，TDC)是一种5'-磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate，PLP)依赖型的脱羧酶，可以催化色氨酸脱羧后产生色胺(王鹏等，2014；López-Meyer et al.,1997)。但由于不同来源的色氨酸脱羧酶的催化活性不同，而且，现有通过原核表达系统生产的色氨酸脱羧酶还需要柱层析纯化的过程，难以实现规模化生产色氨酸脱羧酶。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种将L-色氨酸转化为色胺和D-色氨酸的方法。采用本发的方法可以将低价值的L-色氨酸在同一反应体系中转化为高价值的色胺和D-色氨酸；L-色氨酸的转化效率高，转化得到的色胺和D-色氨酸的纯度高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种将L-色氨酸转化为色胺和D-色氨酸的方法，包括以下步骤：
(1)将L-色氨酸加入到氢氧化钠溶液中，搅拌溶解后加入水杨醛，90～95℃水浴下进行消旋反应，消旋至溶液的旋光度为+1°～+1.5°，停止反应，冷却至室温，调节pH至6.0±0.5，获得含有D-色氨酸和L-色氨酸的母液；
(2)向母液中投入色氨酸脱羧酶和辅酶PLP，在40-50℃、pH6.0±0.5的条件下特异性催化L-色氨酸转化成色胺，获得含有D-色氨酸和色胺的反应液；
(3)调节反应液的pH值至12.0，使反应液中的色胺析出形成沉淀，分离得到色胺；
(4)将分离出色胺后的反应液的pH调至4.5-5，使D-色氨酸析出，分离得到D-色氨酸。
优选的，步骤(1)中，所述氢氧化钠溶液的浓度为1-3mol/L。
优选的，步骤(1)中，L-色氨酸、氢氧化钠溶液、水杨醛加入量的比为(95-105)g：(500-520)ml：(5-6)ml。
优选的，步骤(2)中，色氨酸脱羧酶的投入量为母液重量的2-4％；辅酶PLP的投入量为母液重量的0.02-0.04％。
优选的，步骤(2)中，所述色氨酸脱羧酶由如下方法制备而成：
1)将SEQ ID NO.1所示的编码水稻色氨酸脱羧酶的基因TDC连入质粒pEGX-4t-J，获得重组表达载体；再将获得的重组表达载体导入大肠杆菌，获得重组菌；
2)将重组菌接种至培养基中进行发酵培养，发酵培养至发酵培养液稀释100倍后的OD600值为0.18-0.20，获得发酵培养液；向发酵培养液中加入诱导剂进行诱导培养，获得诱导培养物；对诱导培养物进行高压均质处理，分离上清液，即制备得到色氨酸脱羧酶。
更优选的，步骤1)中，所述质粒pEGX-4t-J是由如下方法构建而成：
以pEGX-4T-1为出发质粒，利用pflmⅠ和btgⅠ分别将质粒pEGX-4T-1的第3250和4869位点进行酶切，双酶切之后再连入长度为100bp的人造链；所述质粒pEGX-4t-J的长度为3449bp，仅在第3249位点处存在SpeⅠ酶切位点，仅在第3349位点处存在Bsc91Ⅰ酶切位点。
更优选的，步骤2)中，所述培养基的组成为：甘油12g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，KH2PO4 2g/L，K2HPO4 15g/L，(NH4)2SO4 1.5g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.015g/L，ZnCl20.06g/L。
更优选的，步骤2)中，发酵培养的条件为：pH控制在7.0，罐压0.05MPa，温度33℃，通风比1：1。
更优选的，步骤2)中，诱导培养的条件为：加入诱导剂IPTG，使IPTG的终浓度100mg/L，诱导温度22℃，诱导培养时间2-6h。
更优选的，步骤2)中，高压均质处理的条件为：均质压力15,000PSI，均质流量400L/Hr，控制温度为30℃。
采用上述方法制备的色氨酸脱羧酶，其主要存在于分离的上清液中；上清液中色氨酸脱羧酶的含量为0.02μmol/L；通过液相测定色胺生成量计算酶活为1.10-1.45U。
优选的，步骤(2)中，特异性催化L-色氨酸转化成色胺的反应时间一般控制在6-10h；工业化生产中一般是通过监测反应体系中L-色氨酸的含量来进行控制，当反应体系中的L-色氨酸含量降至0.1％时，再继续反应1h后即可结束反应。
优选的，步骤(3)中，对分离得到的色胺还包括纯化的步骤，具体为：色胺经活性炭脱色后加盐酸重溶，生成色胺盐暂存，过滤后加氢氧化钠调pH至12，色胺重新析出，用蒸馏水洗3次，干燥。
优选的，步骤(4)中，对分离得到的D-色氨酸还包括纯化的步骤，具体为：将D-色氨酸溶解后过陶瓷膜，重结晶。
本发明的有益效果：
(1)本发明首次实现了在同一反应体系中将L-色氨酸转化为D-色氨酸和色胺，L-色氨酸的转化率高，转化得到的D-色氨酸和色胺的纯度高。
(2)本发明首先对L-色氨酸进行消旋处理，获得含有D-色氨酸和L-色氨酸的母液，并通过控制消旋后的溶液的旋光度来控制母液中D-色氨酸/L-色氨酸的比例；然后再投入色氨酸脱羧酶特异性催化L-色氨酸转化为色胺；当消旋至溶液的旋光度为+1°～+1.5°时，后续色氨酸脱羧酶催化转化L-色氨酸的效率最高，能显著提高L-色氨酸的加酶转化率。
(3)本发明催化L-色氨酸所使用的色氨酸脱羧酶是采用优化后的原核表达体系经工业化生产得到，色氨酸脱羧酶的生产成本低、酶活力高。
附图说明
图1：本发明的表达载体pGEX-4t-J的结构示意图。
图2：本发明构建的色氨酸脱羧酶基因原核表达载体的结构示意图。
图3：优化前的密码子相对适应度图。
图4：优化后的密码子相对适应度图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
术语：
室温：本发明中的“室温”是指温度为20℃-30℃。
正如背景技术部分所介绍的，L-色氨酸市场价值低，D-色氨酸和色胺的市场价值高，将低价值的L-色氨酸转化成高价值的D-色氨酸和色胺将具有广阔的市场应用前景。
从L-色氨酸制备D-色氨酸，现有技术中主要是先将L-色氨酸进行消旋处理，获得DL-色氨酸，然后再进行拆分，拆分方法主要有酶法拆分、化学拆分和膜拆分等。但上述拆分方法普遍存在工艺繁杂、所使用的原料成本高、不易获得、L-色氨酸转化率低等问题。
从L-色氨酸制备色胺，主要利用的是色氨酸脱羧酶进行催化。但其主要存在两方面的问题：一是现有色氨酸脱羧酶的生产成本高、酶活也有待进一步提高；二是若完全以L-色氨酸作为底物，即使色氨酸脱羧酶的投入量再多、反应时间再长，L-色氨酸的转化率仍偏低。试验表明：完全以L-色氨酸作为底物，在足量色氨酸脱羧酶的催化下，反应17个小时，L-色氨酸转化率最高只有65％左右。
而且，现有技术中从L-色氨酸制备D-色氨酸与从L-色氨酸制备色胺通常是两条平行的路线，二者之间并无交集。目前也未见有在同一反应体系中将L-色氨酸转化成D-色氨酸和色胺的报道。
基于此，本发明提出了一种将L-色氨酸转化为色胺和D-色氨酸的方法。本发明首先对溶解后的L-色氨酸进行消旋处理，获得含有D-色氨酸和L-色氨酸的母液；然后再直接向母液中加入色氨酸脱羧酶和辅酶PLP，本发明意外的发现，在D-色氨酸存在的情况下，L-色氨酸经酶催化转化为色胺的转化率明显提高。本发明进一步对母液中D-色氨酸与L-色氨酸的比例对L-色氨酸转化率的影响进行了考察，结果发现，消旋至溶液的旋光度为+1°～+1.5°，此时L-色氨酸的转化率最优。
经消旋和色氨酸脱羧酶催化处理后，能够将L-色氨酸大部分转化成D-色氨酸和色胺，本发明通过采用调节pH的方式将生成的色胺和D-色氨酸分别分离出来。经计算，采用本发明的方法，酶催化反应6-10h，L-色氨酸的转化率能到93.9-98.9％，与现有技术相比，L-色氨酸的转化率有了显著的提高。
L-色氨酸的转化率(％)＝(M1－M2)/M1×100％；
式中，M1为L-色氨酸的投入量；M2为反应后剩余L-色氨酸的量；M1与M2的重量单位一致。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。其中：
本发明中所使用的色氨酸脱羧酶可以通过市售途径购买得到；也可以自行制备得到。
本发明中所使用的L-色氨酸为白色至微黄色结晶或结晶性粉末，旋光度-29.4°～-32.8°，含量98.5％～101.5％，pH＝5.5～7.0。
实施例1：水稻色氨酸脱羧酶的制备：
(1)以质粒pGEX-4T-1为出发质粒，先采用pflmⅠ在3250位点处进行单酶切，3’末端再切2个，5’末端切6个，3’末端加A，5’末端加CTAGT；再保护；再用btgⅠ在4869位点处进行单酶切，5’末端切4个再加AAGA，去掉所有的保护；再加上5’-CTAGT……G-3’的全长100bp的人造链，人造链中间省略的序列，其只要不包含SpeⅠ和Bsc91Ⅰ两个酶切位点，中间省略的序列可任意选择。
用SpeⅠ和Bsc91Ⅰ对质粒pGEX-4t-J进行双酶切并鉴定，双酶切后pEGX-4t-J出现3349和100两条，则证明表达载体pGEX-4t-J构建成功(图1)。
(2)使用SpeⅠ和Bsc91Ⅰ对质粒pGEX-4t-J进行双酶切，再通过DNA连接酶将优化后的SEQ ID NO.1所示的TDC基因整合到双酶切后的表达载体pGEX-4t-J上，得到重组表达载体pEGX-TDC(图2)；再将获得的重组表达载体导入大肠杆菌B21(DE3)，获得重组菌。
(3)将重组菌接种至培养基中进行发酵培养，发酵培养的条件为：pH控制在7.0，罐压0.05MPa，温度33℃，通风比1：1，发酵培养至发酵培养液稀释100倍后的OD600值为0.18-0.20，获得发酵培养液；(通风比：一分钟内通过单位体积培养液的无菌空气体积；例如，装有18m3培养液的发酵罐，若每分钟通入无菌空气18L，则称通风比为1:1。)
将发酵培养液降温至22℃，向发酵培养液中加入诱导剂IPTG，使IPTG的终浓度100mg/L，进行诱导培养2h，获得诱导培养物；将诱导培养物进行高压均质处理，分离取上清液，即制备得到水稻色氨酸脱羧酶(水稻色氨酸脱羧酶为水溶性的，其主要存在于上清液中)；
所述培养基的组成为：甘油12g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，KH2PO4 2g/L，K2HPO415g/L，(NH4)2SO4 1.5g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.015g/L，ZnCl2 0.06g/L。
高压均质处理的条件如下：
(1)均质压力：压力15,000PSI；
(2)均质流量：400L/Hr；
(3)卫生级别：接触物料部件的材质都是经FDA&GMP认可的316L和17-4PH不锈钢、碳化钨、超高分子聚乙烯和PEEK等，支持CIP；
(4)温度控制：30℃；
(5)液压式动力传输；
(6)进料方式：系统直接连接管路。
水稻色氨酸脱羧酶是以高压均质处理后分离取的上清液为应用形式，利用植物色氨酸脱羧酶(TDC)检测试剂盒(购自于上海臻科生物科技有限公司)测定上清液中水稻色氨酸脱羧酶的含量为0.02μmol/L；通过液相测定色胺生成量计算酶活为1.10-1.45U。
采用本发明上述方法制备色氨酸脱羧酶具有如下优势：
(1)本发明从营养匮乏的水稻叶片中克隆得到色氨酸脱羧酶的编码基因。为了使编码基因能够更适用于原核表达系统，本发明对原编码基因(SEQ ID NO.2所示)进行了密码子优化，优化后的色氨酸脱羧酶编码基因如SEQ ID NO.1所示；优化后的色氨酸脱羧酶编码基因的密码子相对适应度显著提高(参见图3和图4)；采用优化后色氨酸脱羧酶编码基因进行原核表达，目的蛋白色氨酸脱羧酶的表达量显著提高。
(2)本发明以pGEX-4T-1为出发质粒，pGEX-4T-1为诱导型质粒，需要加入诱导物诱导后才能表达目的基因，因此可以控制目的基因的表达时间。本发明进一步对pGEX-4T-1进行了改造，将质粒pEGX-4T-1双酶切之后又连接一段100bp的碱基，这样改造处理的好处是减小质粒大小，原质粒4969bp，经过改造后只有3449bp。而且在3249和3349分别有SpeⅠ和Bsc91Ⅰ两个酶切位点，方便目的基因的插入。
(3)现有色氨酸脱羧酶的发酵生产中普遍采用的是LB培养基，本发明还对发酵培养基的组成进行了优化，本发明优化后的培养基更适宜于重组菌的生长繁殖，采用本发明的培养基进行发酵培养，可有效提高色氨酸脱羧酶的表达量。
(4)现有技术中通过原核表达的色氨酸脱羧酶，一般还需要采用柱层析进行纯化，其纯化过程复杂，难以实现工业化生产。而本发明将诱导培养物进行高压均质处理之后分离取上清，上清液即可作为色氨酸脱羧酶直接进行使用，无需柱层析纯化的过程。
实施例2：将L-色氨酸转化为色胺和D-色氨酸的方法
(1)将L-色氨酸加入到2mol/L氢氧化钠溶液中，搅拌溶解后加入水杨醛，L-色氨酸、氢氧化钠溶液、水杨醛加入量的比为100g：510ml：5.5ml；90～95℃水浴下进行消旋反应，消旋至溶液的旋光度为+1°～+1.5°，停止反应，冷却至室温，调节pH至6.0±0.5，获得含有D-色氨酸和L-色氨酸的母液；
(2)向母液中投入色氨酸脱羧酶和辅酶PLP，色氨酸脱羧酶的投入量为母液重量的3％，色氨酸脱羧酶以实施例1中分离得到的上清液的形式加入；辅酶PLP的投入量为母液重量的0.03％；在45℃、pH6.0±0.5的条件下特异性催化L-色氨酸转化成色胺，反应时间为8h，获得含有D-色氨酸和色胺的反应液；
(3)调节反应液的pH值至12.0，使反应液中的色胺析出形成沉淀，分离得到色胺；色胺经活性炭脱色后加盐酸重溶，生成色胺盐暂存，过滤后加氢氧化钠调pH至12，色胺重新析出，用蒸馏水洗3次，烘干后即为色胺产品。
(4)向分离出色胺后的反应液中加盐酸，调节pH值至4.5-5.0，使D-色氨酸析出，分离得到D-色氨酸，D-色氨酸析出，溶解后过陶瓷膜，重结晶，即为D-色氨酸产品。
实施例3：将L-色氨酸转化为色胺和D-色氨酸的方法
(1)将L-色氨酸加入到1mol/L氢氧化钠溶液中，搅拌溶解后加入水杨醛，L-色氨酸、氢氧化钠溶液、水杨醛加入量的比为95g：520ml：5ml；90～95℃水浴下进行消旋反应，消旋至溶液的旋光度为+1°～+1.5°，停止反应，冷却至室温，调节pH至6.0±0.5，获得含有D-色氨酸和L-色氨酸的母液；
(2)向母液中投入色氨酸脱羧酶和辅酶PLP，色氨酸脱羧酶的投入量为母液重量的4％；辅酶PLP的投入量为母液重量的0.04％；在50℃、pH6.0±0.5的条件下特异性催化L-色氨酸转化成色胺，反应时间为10h，获得含有D-色氨酸和色胺的反应液；
(3)调节反应液的pH值至12.0，使反应液中的色胺析出形成沉淀，分离得到色胺；色胺经活性炭脱色后加盐酸重溶，生成色胺盐暂存，过滤后加氢氧化钠调pH至12，色胺重新析出，用蒸馏水洗3次，烘干后即为色胺产品。
(4)向分离出色胺后的反应液中加盐酸，调节pH值至4.5-5.0，使D-色氨酸析出，分离得到D-色氨酸，D-色氨酸析出，溶解后过陶瓷膜，重结晶，即为D-色氨酸产品。
实施例4：将L-色氨酸转化为色胺和D-色氨酸的方法
(1)将L-色氨酸加入到3mol/L氢氧化钠溶液中，搅拌溶解后加入水杨醛，L-色氨酸、氢氧化钠溶液、水杨醛加入量的比为105g：500ml：6ml；90～95℃水浴下进行消旋反应，消旋至溶液的旋光度为+1°～+1.5°，停止反应，冷却至室温，调节pH至6.0±0.5，获得含有D-色氨酸和L-色氨酸的母液；
(2)向母液中投入色氨酸脱羧酶和辅酶PLP，色氨酸脱羧酶的投入量为母液重量的2％；辅酶PLP的投入量为母液重量的0.02％；在40℃、pH6.0±0.5的条件下特异性催化L-色氨酸转化成色胺，反应时间为6h，获得含有D-色氨酸和色胺的反应液；
(3)调节反应液的pH值至12.0，使反应液中的色胺析出形成沉淀，分离得到色胺；色胺经活性炭脱色后加盐酸重溶，生成色胺盐暂存，过滤后加氢氧化钠调pH至12，色胺重新析出，用蒸馏水洗3次，烘干后即为色胺产品。
(4)向分离出色胺后的反应液中加盐酸，调节pH值至4.5-5.0，使D-色氨酸析出，分离得到D-色氨酸，D-色氨酸析出，溶解后过陶瓷膜，重结晶，即为D-色氨酸产品。
对实施例2-实施例4制备的色胺产品和D-色氨酸产品进行质量检测，其中，色胺的质量标准如表1所示，D-色氨酸的质量标准如表2所示。
表1：色胺质量标准
检测项目
标准
性状
淡黄色或类白色结晶性粉末
含量
≥98.0％
干燥失重
≤0.50％
灰分
≤0.50％
重金属
≤20ppm
砷
≤1.5ppm(外检)
表2：D-色氨酸质量标准
项目
指标
含量
98.5％～101.5％
比旋度
+30.0°～+33.0°
pH
5.0～7.0
透光率
内控
干燥失重
≤0.3％
炽灼残渣
≤0.1％
氯化物
≤0.02％
硫酸盐
≤0.02％
铁盐
≤20ppm
重金属
≤10ppm
色胺产品的检验方法如下：
1.感官
取适量样品，置于白纸上，用玻璃棒摊平，目测、鼻嗅。
2.含量：≥98.0％
2.1仪器
2.1.1高效液相色谱仪Waters e-2695
2.1.2紫外检测器UV2489
2.1.3超声清洗机
2.1.4抽滤装置：1L
2.2试剂
2.2.1流动相A：准确称取4.1g磷酸二氢钾溶于500mL左右纯水中，加2.8mL三乙胺，用纯水定容至1L，混匀，用0.22um滤膜过滤，放入超声机内超声脱气30min，备用。
2.2.2流动相B：色谱纯甲醇。
2.2.3样品溶液：精密称取样品0.01g(精确至0.0002g)至100mL容量瓶内，加流动相(A:B＝60:40)溶解并稀释至刻度，摇匀。
2.3色谱条件
色谱柱：YMC-Triart C18
流动相：A:B＝60:40
流速：1.0mL/min
柱温：室温或30℃
检测波长：225nm
结果计算：外标法
3.干燥失重：≤0.5％
3.1仪器
3.1.1分析天平：感量0.1mg
3.1.2恒温干燥箱：温度精确到±0.1℃
3.1.3称量瓶：70×35mm
3.2操作
将扁形称量瓶在105℃烘箱中干燥至恒重，取出移入干燥器中冷却至室温，精密称重m1。在此称量瓶中加入样品约1g，精密称重m2，然后置于105℃烘箱中干燥3小时，取出移入干燥器中冷却至室温，精密称重m3。
3.3结果计算
式中：
X——样品的干燥失重，﹪
m1——称量瓶的质量，g
m2——称量瓶和样品的质量，g
m3——称量瓶和样品干燥后的质量，g。
3.4精密度
同一样品测试结果，相对平均偏差不得超过0.3％。
4灰分：≤0.5％
4.1试剂：硫酸
4.2操作
将坩埚于600℃±50℃温度下恒重，取出置于干燥器中冷却并准确称重m1。
称取样品1g-2g至恒重的坩埚中，精密称重m2，加入1mL硫酸润湿样品，在尽可能低的温度下加热直到样品完全烧焦。冷却，再加入1mL硫酸润湿残留物，慢慢加热直至白烟不再冒出。然后于600℃±50℃温度下直至完全焚烧残渣(1～2h)。取出，于干燥器中冷却并精确称重m3，计算残渣占样品的百分比。
除非另有规定，如果残渣的含量超过了规定的限值，则重复加硫酸润湿，加热，于600℃±50℃温度下灼烧30分钟，直到两个连续样品残渣的剩余重量不超过0.5mg，或直到残渣百分比符合规定的限值。
4.3结果计算
式中：
m1——坩埚的质量，g
m2——坩埚和样品的质量，g
m3——坩埚和残渣的质量，g。
4.4注意事项
坩埚炽灼至恒重，系指在600℃±50℃炽灼后，放冷精密称定重量，先后两次重量差异在0.3mg以下。
恒重时，每只干燥器放置坩埚最好不超过4只，称量顺序每次应一致，置干燥器中冷却时间也应一致，自干燥器内取出后，应迅速精密称定，前后两次重量差异在0.3mg以下，方可视为恒重。
检查用硫酸应注意其纯度，必要时可做空白试验。
5重金属：≤20ppm
5.1试剂
5.1.1硝酸铅贮备液：将159.8mg的硝酸铅溶解于已加入1mL硝酸的水中，然后用水稀释至1000mL。
标准铅溶液：当天使用，吸取硝酸铅贮备液10mL，加水定容至100mL。每毫升标准铅溶液含有相当于10μg的铅。
醋酸盐缓冲液(pH3.5)：准确称取25.0g醋酸铵，溶解于25mL水中，加入38.0mL6mol/L盐酸溶液。如有必要，可用6mol/L氨水或6mol/L的盐酸将醋酸盐溶液的pH值调至3.5，用水稀释至100毫升，混合。
硫代乙酰胺试液：取硫代乙酰胺溶液(4g硫代乙酰胺溶于100mL水中)0.2mL与甘油碱溶液(向200g甘油中加水至总重为235g，加入140mL的1mol/L的氢氧化钠和50mL水)1mL混合，并将此溶液于沸水浴中20s，立即使用。
5.2操作
样品管：称取1.0g样品溶于25mL水中，使用pH计或小范围pH指示剂纸作为外部指示剂，用1mol/L醋酸或6mol/L氨水将溶液pH值调节至3.0-4.0之间，用水稀释至40mL，混合。
标准管：吸取标准铅溶液2mL于50mL比色管中，使用pH计或小范围pH指示剂纸作为外部指示剂，用1mol/L醋酸或6mol/L氨水将溶液pH值调节至3.0-4.0之间，用水稀释至40mL，混合。
监测管：称取1.0g样品溶于25mL水中，加入标准铅溶液2mL。使用pH计或小范围pH指示剂纸作为外部指示剂，用1mol/L醋酸或6mol/L氨水将溶液pH值调节至3.0-4.0之间，用水稀释至40mL，混合。
向上述三管中分别加入pH3.5的醋酸盐缓冲液2mL，硫代乙酰胺溶液1.2mL，加水定容至50mL，混匀，静置2分钟。以白色为底，从上往下看溶液颜色，样品管不得比标准管样色深。监测管样色应等于或比标准管的颜色要深，否则应采用USP方法2。
6砷：≤1.5ppm
委外检测。
D-色氨酸产品的检验方法如下：
1感官
取适量样品，置于白纸上，用玻璃棒摊平，目测、鼻嗅。
2含量：98.5％～101.5％
2.1试剂配制：
2.1.1 0.1mol/L高氯酸标准溶液配制：量取8.5mL高氯酸，在搅拌下注入500mL冰乙酸中，加入24mL乙酸酐，混匀用冰醋酸定容1000mL。
2.1.2标定：准确称取干燥至恒重的邻苯二甲酸氢钾160mg(称准0.0002g)置于三角瓶中，加冰醋酸20mL溶解后加甲基紫指示剂1滴，用配制好的高氯酸溶液滴定至蓝色为终点，标定二次取平均值。
C1＝m3/0.2042*V2
式中：
C1——标定的HClO4浓度，mol/L
m3——邻苯二甲酸氢钾之质量，g
V2——高氯酸标准溶液之用量，mL
0.2042——KHC8H4O4的毫摩尔质量
2.1.3 0.5％α—萘酚苯甲醇指示剂：称取0.5gα—萘酚苯甲醇，用冰醋酸溶解定容至100mL。
2.1.4甲基紫指示剂：称取0.5g甲基紫，用冰醋酸溶解定容至100mL。
2.2操作：
称取干燥至恒重的样品150mg，准确至0.0002g，加3mL甲酸，溶于50mL冰醋酸，加2～3滴α—萘酚苯甲醇指示剂，用0.1mol/L高氯酸标准溶液滴定至显绿色，同时做空白试验。
2.3计算方法：
式中：
X——含量，％
C——高氯酸标准溶液的浓度，mol/L
——滴定空白消耗高氯酸标准溶液的毫升数，mL
——滴定样品消耗高氯酸标准溶液的毫升数，mL
m——样品重量，g
2.4注意事项：若滴定样品与标定高氯酸时的温度差别超过10℃时，则应重新标定，若未超过10℃，则可按下式将高氯酸液浓度加以校正：
式中：
0.0011——冰醋酸的膨胀系数
C1——标定高氯酸时的浓度
3比旋度：+30.0°～+33.0°
3.1仪器
3.1.1旋光仪：精度0.01°。
3.1.2分析天平：感量0.1mg。
3.1.3容量瓶：50mL
3.1.4称量瓶：70×35mm
3.2试剂
纯水
3.3操作
取样品(105℃干燥3h的干品)，精密称定，加纯水溶解并稀释制成每1mL中约含10mg的溶液(1g→100mL)，使用数字自动旋光仪测定旋光度(先以纯水做空白较正零点)，将2dm旋光管先用供试液冲洗3次，然后缓缓注入供试液(注意管内不应有气泡)，置旋光仪内测定旋光度，取三次旋光度读数的平均值，并测定供试液温度。
3.4结果计算
式中：
α——旋光度读数，右旋为“+”，左旋为“-”；
L——旋光管长度(dm)；
C——供试液浓度(g/100mL溶液)；
Kt——温度系数(-0.090)；
t——测定时溶液温度。
3.5注意事项
3.5.1每次测定前应以溶剂作空白校正，测定后，再校正1次，以确定测定时零点有无变动；如第2次校正时发现零点变动，则应重新测定旋光度。
3.5.2配置溶液及测定时，均应调节温度至20℃±0.5℃(或各品种项下规定的温度)。
3.5.3供试的液体或固体物质的溶液应充分溶解，供试液应澄清。
3.5.4物质的比旋度与测定光源、测定波长、溶剂、浓度和温度等因素有关。因此，表示物质的比旋度时应注明测定条件。
3.5.5样品测定管与空白测定管放在旋光仪内的位置应保持一致。
3.5.6测定管上的玻璃片应保持光亮、清洁，测定管上的橡皮圈发生老化应及时更换。
3.5.7旋光管玻片处不应有气泡，将气泡赶至葫芦管处。
4pH：5.0～7.0
4.1仪器
4.1.1pH计：精确到0.01
4.1.2量筒：50mL，A级
4.2试剂和溶液：纯水
4.3分析步骤
4.3.1试剂配制
邻苯二甲酸氢钾pH4.00、混合磷酸盐pH6.86。
4.3.2pH计校准
把电极插入第一个缓冲液中，按“校准”键，读数稳定后完成第一点校准。电极清洗后，插入第二个缓冲液，并按“校准”键，读数稳定后按“读数”键，完成第二点校准。校准完成即可测样。
4.3.3操作
取样品0.5g，加新沸的冷水50mL溶解，用校准过的pH计测定即可。
5透光率
5.1仪器
5.1.1 752型紫外可见分光光度计
5.1.2容量瓶：50mL
5.2试剂
2mol/L盐酸溶液：量取盐酸180mL，用水稀释至1000mL。
5.3操作
称取样品0.5g，加盐酸溶液20mL溶解，在752型分光光度计上，用1cm比色皿，430nm波长下，以盐酸溶液作参比，记录读数。
6干燥失重：≤0.3％
6.1仪器
6.1.1分析天平：感量0.1mg
6.1.2恒温干燥箱：温度精确到±0.1℃
6.1.3称量瓶：70×35mm
6.2操作
将扁形称量瓶在105℃烘箱中干燥至恒重，取出移入干燥器中冷却至室温，精密称重m1。在此称量瓶中加入样品约1g，精密称重m2，然后置于105℃烘箱中干燥3小时，取出移入干燥器中冷却至室温，精密称重m3。
6.3结果计算
式中：
X——样品的干燥失重，﹪
m1——称量瓶的质量，g
m2——称量瓶和样品的质量，g
m3——称量瓶和样品干燥后的质量，g。
6.4精密度
同一样品测试结果，相对平均偏差不得超过0.3％。
7炽灼残渣：≤0.1％
7.1试剂：硫酸
7.2操作
将坩埚于600℃±50℃温度下恒重，取出置于干燥器中冷却并准确称重m1。
称取样品1g-2g至恒重的坩埚中，精密称重m2，加入1mL硫酸润湿样品，在尽可能低的温度下加热直到样品完全烧焦。冷却，再加入1mL硫酸润湿残留物，慢慢加热直至白烟不再冒出。然后于600℃±50℃温度下直至完全焚烧残渣(1～2h)。取出，于干燥器中冷却并精确称重m3，计算残渣占样品的百分比。
除非另有规定，如果残渣的含量超过了规定的限值，则重复加硫酸润湿，加热，于600℃±50℃温度下灼烧30分钟，直到两个连续样品残渣的剩余重量不超过0.5mg，或直到残渣百分比符合规定的限值。
7.3结果计算
式中：
m1——坩埚的质量，g
m2——坩埚和样品的质量，g
m3——坩埚和残渣的质量，g。
7.4注意事项
坩埚炽灼至恒重，系指在600℃±50℃炽灼后，放冷精密称定重量，先后两次重量差异在0.3mg以下。
恒重时，每只干燥器放置坩埚最好不超过4只，称量顺序每次应一致，置干燥器中冷却时间也应一致，自干燥器内取出后，应迅速精密称定，前后两次重量差异在0.3mg以下，方可视为恒重。
检查用硫酸应注意其纯度，必要时可做空白试验。
8氯化物：≤0.02％
8.1试剂
8.1.1稀硝酸：量取105mL硝酸，用水稀释至1000mL。
8.1.2 0.1mol/L硝酸银：17.5g硝酸银，加水溶解并稀释至1000mL。
8.1.3 0.02mol/L盐酸溶液，需标定。
8.2操作
取样品1.78g，置50mL纳氏比色管中，加水溶解使成25mL(如有必要用硝酸中和溶液)，再加稀硝酸10mL，加水使成约40mL，摇匀，此为样品管；
精密吸取0.02mol/L盐酸溶液0.5mL，置另一纳氏比色管中，加稀硝酸10mL，加水使成约40mL，摇匀，此为标准管；
分别向样品管和标准管中加入0.1mol/L硝酸银1.0mL，加水使成50mL，摇匀，在暗处放置5分钟，至黑色背景上，从上向下垂直观察，样品管所显浊度与标准管比较，不得更浓。
8.3注意事项
温度过低影响浊度产生，最好在30℃～40℃。光线直射，会引起氯化银分解，故需暗处放置。
9硫酸盐：≤0.02％
9.1试剂
9.1.1 0.01mol/L硫酸溶液，需标定。
9.1.2 3mol/L盐酸溶液：量取盐酸270mL，用水稀释至1000mL。
9.1.3 12﹪氯化钡：准确称取120g氯化钡溶于水中，加水定容至1000mL。
9.2操作
取样品0.48g置50mL纳氏比色管中，加水溶解使成40mL，加盐酸溶液2mL，摇匀，此为样品管；
精密吸取0.01mol/L硫酸溶液0.1mL，置另一个50mL纳氏比色管中，加水溶解使成40mL，加盐酸溶液2mL，摇匀，此为标准管；
分别向样品管和标准管中加12﹪氯化钡5mL，加水使成50mL，摇匀，放置10分钟，置黑色背景下，从上向下垂直观察，样品管浊度与标准管比较，不得更浓。
9.3注意事项
12﹪氯化钡溶液应临用前配置，加入氯化钡后，应立即充分摇匀，以防局部过浓而影响产生浑浊的浓度。
温度过低影响浑浊产生，最好在25℃～35℃。
10铁盐：≤20ppm
10.1试剂
10.1.1标准铁贮备液：准确称取硫酸铁铵863.4mg[FeNH4(SO4)2·12H2O]，溶解于少量水中，加2N(1mol/L)的硫酸溶液10mL，加水定容至100mL。
10.1.2标准铁溶液：吸取贮备液10mL至1000mL容量瓶中，加入2N(1mol/L)的硫酸溶液10mL，加水定容至1000mL混匀备用。(此标准铁溶液中每mL含10μg铁)
10.1.3稀盐酸：取盐酸234mL，加水稀释至1000mL。
10.1.4 30﹪硫氰酸铵溶液：取硫氰酸铵30g，加水溶解定容至100mL。
10.1.5过硫酸铵
10.2操作
取样品1.0g，炽灼灰化后，残渣加盐酸2mL，置水浴上蒸干，再加稀盐酸4mL，微热溶解后，加水30mL，转移至50mL纳氏比色管中，此为样品管；
精密吸取标准铁溶液2.0mL置50mL纳氏比色管中，加稀盐酸4mL，加水使成35mL，此为标准管；
分别向两管中加入过硫酸铵0.05g，30﹪硫氰酸铵溶液3mL，再加水适量稀释成50mL，摇匀，置白色背景自上向下垂直观察，样品管的颜色与标准管比较，不得更深。
10.3注意事项
光线和温度均影响硫氰酸铁的稳定性，故需立即比色。
11重金属：≤10ppm
11.1试剂
11.1.1硝酸铅贮备液：将159.8mg的硝酸铅溶解于已加入1mL硝酸的水中，然后用水稀释至1000mL。
11.1.2标准铅溶液：当天使用，吸取硝酸铅贮备液10mL，加水定容至100mL。每毫升标准铅溶液含有相当于10μg的铅。
11.1.3醋酸盐缓冲液(pH3.5)：准确称取25.0g醋酸铵，溶解于25mL水中，加入38.0mL 6mol/L盐酸溶液。如有必要，可用6mol/L氨水或6mol/L的盐酸将醋酸盐溶液的pH值调至3.5，用水稀释至100毫升，混合。
11.1.4硫代乙酰胺试液：取硫代乙酰胺溶液(4g硫代乙酰胺溶于100mL水中)0.2mL与甘油碱溶液(向200g甘油中加水至总重为235g，加入140mL的1mol/L的氢氧化钠和50mL水)1mL混合，并将此溶液于沸水浴中20s，立即使用。
11.1.5酚酞指示液：取酚酞1g，加乙醇100mL溶解。
11.1.6氨试液：取浓氨溶液400mL，加水稀释至1000mL。
11.2操作
样品管：取炽灼残渣项下遗留的残渣，加硝酸0.5mL，蒸干，至氧化氮气除尽后，放冷，加盐酸2mL，置水浴上蒸干后，加水15mL，滴加氨试液至酚酞指示液显中性，加醋酸盐缓冲液2mL，微热溶解后，移至纳氏比色管中，加水稀释至25mL。
标准管：取配制样品管溶液的试剂，至瓷皿中，蒸干后加醋酸盐缓冲液2mL，加水15mL，移至纳氏比色管中，加标准铅溶液1mL，加水稀释至25mL。
向上述两管中分别加入硫代乙酰胺溶液2.0mL，混匀，静置2分钟。以白色为底，从上往下看溶液颜色，样品管不得比标准管样色深。监测管样色应等于或比标准管的颜色要深。
经检测，本发明实施例2-实施例4制备的色胺产品和D-色氨酸产品均符合标准。
对比例1：
将实施例2的步骤(1)中消旋至溶液的旋光度调整为-2°～-3°，其余条件同实施例2。
对比例2：
将实施例2的步骤(1)中消旋至溶液的旋光度调整为+4°～+5°，其余条件同实施例2。
对比例3：
将实施例2的步骤(2)中的催化反应温度调整为35℃，pH值调整为7.5，其余条件同实施例2。
对比例4：
将实施例2的步骤(2)中的催化反应温度调整为55℃，pH值调整为5.5，其余条件同实施例2。
分别考察实施例2-实施例4，以及对比例1-对比例4中L-色氨酸的转化率，L-色氨酸的转化率(％)＝(M1－M2)/M1×100％；
式中，M1为L-色氨酸的投入量；M2为反应后剩余L-色氨酸的量；M1与M2的重量单位一致。
结果如下：
表3：L-色氨酸转化率
组别
L-色氨酸转化率
实施例2
97.5％
实施例3
98.9％
实施例4
94.2％
对比例1
72.5％
对比例2
81.5％
对比例3
82.9％
对比例4
64.5％
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 新泰市佳禾生物科技有限公司,汕头市佳禾生物科技有限公司
<120> 一种将L-色氨酸转化为色胺和D-色氨酸的方法
<130> 2021
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctagttgttg atatgggttc tctggacacc aacccgaccg ctttctctgc tttcccggct 60
ggtgaaggtg aaaccttcca gccgctgaac gctgacgacg ttcgttctta cctgcacaaa 120
gctgttgact tcatctctga ctactacaaa tctgttgaat ctatgccggt tctgccgaac 180
gttaaaccgg gttacctgca ggacgaactg cgtgcttctc cgccgaccta ctctgctccg 240
ttcgacgtta ccatgaaaga actgcgttct tctgttgttc cgggtatgac ccactgggct 300
tctccgaact tcttcgcttt cttcccgtct accaactctg ctgctgctat cgctggtgac 360
ctgatcgctt ctgctatgaa caccgttggt ttcacctggc aggcttctcc ggctgctacc 420
gaaatggaag ttctggctct ggactggctg gctcagatgc tgaacctgcc gacctctttc 480
atgaaccgta ccggtgaagg tcgtggtacc ggtggtggtg ttatcctggg taccacctct 540
gaagctatgc tggttaccct ggttgctgct cgtgacgctg ctctgcgtcg ttctggttct 600
gacggtgttg ctggtctgca ccgtctggct gtttacgctg ctgaccagac ccactctacc 660
ttcttcaaag cttgccgtct ggctggtttc gacccggcta acatccgttc tatcccgacc 720
ggtgctgaaa ccgactacgg tctggacccg gctcgtctgc tggaagctat gcaggctgac 780
gctgacgctg gtctggttcc gacctacgtt tgcgctaccg ttggtaccac ctcttctaac 840
gctgttgacc cggttggtgc tgttgctgac gttgctgctc gtttcgctgc tggttgcacc 900
tctacccgtc gtaccccggc tgctcgtgct tctgctcgtt cttctggtac cacctctacc 960
gcttggtctg cttggacccc gtctgcttaa gctccgacca acggttaata accggcttct 1020
accgctccgg cttctacctg cgctaccccg accgcttctc cggctccgtc tcgtccgacc 1080
cgttctacct ctcgtaccac cccggctacc ccggctcgtt ctccgacctc tcgtacctgc 1140
cgttctgctt ctgctgctgc ttctggtggt tcttcttctg gttggtcttg cgctccgacc 1200
gcttctccgt cttgccgttc tacctctggt gctacctctc cgtggccgcg ttgctctcgt 1260
acctcttctg ctgctaccac cggttctcgt tcttcttgcc gtggtacctc tctgtcttct 1320
gcttctggtt ctggtccggg tcgtcgtcgt cgtcgtgacg gtggtggtcg tcgtcgtggt 1380
gaaccgcgtg ctgacggtgc tgctgaacag gaccgtcagg gtgttcgtgg tgctcacggt 1440
ggtcgtcgtc aggttcgtgc tgctctgcgt ggtggtctgg ttgctgctgg tcgtgcttct 1500
cgtgctgaac gtgttggtgc tcaccaggaa gac 1533
<210> 2
<211> 1533
<212> DNA
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<400> 2
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