一种pH和NH3高响应型食品次鲜级色敏指示膜及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种pH和NH3高响应型食品次鲜级色敏指示膜及其制备方法与应用，属于食品包装贮藏和检测
技术领域
。背景技术
由于高脂肪、高蛋白类食品在贮藏过程中极易发生由微生物腐败而产生的大量挥发性氮和生物胺，这给食品包装行业带来巨大挑战，亦成为目前研究的热点。在食品监测中为了不影响其外观和完整性，pH色敏指示膜作为一种方便、快捷的无损检测方式广泛应用于生鲜食品的智能包装中。其中，由于化学染料具有很高的毒性，对人类健康和环境产生有害影响，因此在新鲜度指示包装中并不适宜使用化学染料作为指示染料。由于天然色素具有安全、无毒、制备方便、可生物降解等优点，研究人员将从植物中提取的天然色素作为pH色敏指示膜的指示物质。花色苷是一种可食用的天然水溶性色素，根据溶液的pH值不同，花青素以不同的化学形式存在，且不同结构下变色明显，可作为pH敏感染料的理想选择。
大量研究证实不同来源的花色苷均可作为生物基pH色敏指示染料应用在食品新鲜度监测中。其中，蓝靛果花色苷由于其鲜食性差，且在广泛pH条件下均呈现显著的颜色变化，被用作本发明中的指示染料。现有报道在指示膜的应用中对于区分被指示食品的新鲜度和腐败度效果较好，但在食品贮藏过程中识别被监测食品的次鲜等级仍不够明确。现存的一些花色苷指示膜多通过调控花色苷含量或者色素复配等方式来提高指示膜的颜色响应性，然而通过调控成膜溶液的pH值来提高花色苷指示膜的响应灵敏性及稳定性的研究还鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种pH和NH3高响应型食品次鲜级色敏指示膜及其制备方法与应用，本发明通过调控成膜溶液pH值优选出pH和NH3响应性较好的色敏指示膜，提高指示膜的灵敏度，增强指示效果。所述指示膜的颜色随着食品新鲜程度发生变化，可以快速指示包装内产品的品质状态(新鲜级、次鲜级和腐败)。所述指示膜可用于监测鲜虾在贮藏过程中的新鲜、次鲜、腐败等级，实时可视化监控并预警制造商和消费者食品腐败的发生，以期为天然花色苷指示膜应用于高蛋白高脂肪类产品货架期监测提供参考。
本发明提供了一种pH和NH3高响应型食品次鲜级色敏指示膜的制备方法，将糊化淀粉溶液与壳聚糖溶液搅拌混合，得淀粉-壳聚糖混合溶液；将蓝靛果花色苷粗提物溶液加入到所述淀粉-壳聚糖混合溶液中，搅拌得淀粉-壳聚糖-蓝靛果花色苷混合溶液；向淀粉-壳聚糖-蓝靛果花色苷混合溶液中加入一定量的甘油，并调节溶液的pH为2～3后持续搅拌一段时间，得成膜溶液；将成膜液干燥成膜，既得。
上述技术方案中，优选所述淀粉与壳聚糖的质量比为5～15:1。
上述技术方案中，优选所述壳聚糖溶液的浓度为6～10mg/mL。
进一步地，所述壳聚糖溶液为壳聚糖的1～1.5％(v:v)乙酸水溶液。
上述技术方案中，所述淀粉优选为马铃薯淀粉。
进一步地，所述糊化淀粉溶液的制备方法包括：将浓度为50～70mg/mL淀粉溶液搅拌下逐渐升温至60～65℃，使淀粉达到刚糊化状态，所述搅拌的速率为800～1000r/min，搅拌的时间为20～40min。
上述技术方案中，优选所述蓝靛果花色苷粗提物溶液为蓝靛果花色苷粗提物的酸性乙醇溶液，所述蓝靛果花色苷粗提物浓度为2～6mg/mL。
进一步地，所述酸性乙醇溶液由1～1.5mol/L的乙酸和无水乙醇按体积比1:4～6组成。
上述技术方案中，优选所述蓝靛果花色苷与壳聚糖的质量比为20～40:1。
进一步地，所述搅拌的速率为800～1000r/min，搅拌的时间为20～40min。
上述技术方案中，优选向所得淀粉-壳聚糖-蓝靛果花色苷混合溶液中加入一定量甘油，并调节溶液pH为2～3后持续磁力搅拌20～40min，搅拌速率为800～1000r/min。
进一步地，所述甘油的添加量为成膜液总体积的1％～3％。甘油主要做塑化剂，提高膜的物理性能，避免薄膜干裂。
进一步地，利用0.1～1.0mol/L HCl溶液或0.1～1.0mol/L NaOH溶液将淀粉-壳聚糖-蓝靛果花色苷混合溶液调节pH至2～3。
上述技术方案中，优选将所得成膜液流延至成膜板中，置于鼓风干燥箱，烘干成膜，干燥温度为40℃～45℃，干燥时间为12～24h。
本发明还提供了一种根据上述方法制备得到的pH和NH3高响应型食品次鲜级色敏指示膜。
本发明还提供了一种pH和NH3高响应型食品次鲜级色敏指示膜在腐败变质过程中产生挥发性含氮化合物的生鲜类产品货架期监测中的应用。
本发明一个优选的技术方案如下：
一种pH和NH3高响应型食品次鲜级色敏指示膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)将一定浓度的淀粉经糊化处理得到糊化淀粉溶液；
(2)将步骤(1)得到的糊化淀粉溶液，加入到一定浓度的壳聚糖溶液中，磁力搅拌10～30min；
(3)将一定浓度蓝靛果花色苷提取物的酸性乙醇溶液缓慢加入到步骤(2)得到的淀粉-壳聚糖混合溶液中，磁力搅拌10～30min；
(4)向步骤(3)中得到的淀粉-壳聚糖-蓝靛果花色苷溶液中，逐滴加入一定体积分数的甘油，调节最终pH为2～3，并持续磁力搅拌20～40min；
(5)将步骤(4)中得到的溶液流延至成膜板中，置于鼓风干燥箱，烘干成膜，成膜后于干燥器中平衡一段时间后揭取即可。
优选的，所述的步骤(1)中，淀粉为马铃薯淀粉，将淀粉溶解于蒸馏水中形成浓度为50～70mg/mL的淀粉溶液，将淀粉溶液在磁力搅拌下逐渐升温至淀粉刚糊化状态，搅拌速率为800～1000r/min，搅拌时间为20～40min。
优选的，所述的步骤(2)中，壳聚糖溶液的浓度为6～10mg/mL，壳聚糖溶液为壳聚糖的1％乙酸水溶液，搅拌速率为600～800r/min；淀粉与壳聚糖的质量比为5～15:1。
优选的，所述的步骤(3)中，蓝靛果花色苷提取物浓度为1～4mg/mL，酸性乙醇溶液由1～1.5mol/L乙酸和无水乙醇以1:4～6比例混合制得；蓝靛果花色苷与壳聚糖的质量比为20～40:1，搅拌速率为600～800r/min。
优选的，所述的步骤(4)中，添加甘油的最终体积分数为1％～3％，调节最终pH为2～4，搅拌速率为800～1000r/min。
优选的，所述的步骤(5)中，干燥温度为40℃～45℃，干燥时间为12～24h。
本发明的有益效果：本发明通过淀粉和壳聚糖两种物理性能较好的成膜材料复配，以蓝靛果花色苷为指示剂制备指示膜，通过调控成膜溶液pH值旨在制备物理性能和颜色响应性能双优的食品新鲜度指示膜。该方法制得的指示膜应用于食品的智能包装领域，旨在监测识别食品的次鲜级，为消费者购买生鲜类食品提供全程实时监控以达到较为准确的识别包装食品的新鲜、次鲜、腐败等级。
附图说明
图1(a)是本发明所用蓝靛果花色苷溶液在pH2-12条件下的颜色变化图。pH2-3时溶液呈红色，随着pH值的增加到4-6时溶液的红色程度逐渐降低变成淡粉色且颜色强度递减，pH为7时溶液呈茶色，pH为8-9时溶液呈浅灰色且颜色强度递增，pH为10时溶液呈紫色，pH为11-12时溶液呈褐色且颜色强度递增；图1(b)是蓝靛果花色苷溶液在pH2-12条件下的紫外-可见光谱图。花色苷溶液在酸性条件下最大吸收峰在波长520nm附近，随pH升高，花色苷的最大吸收波长从520nm向580nm移动，发生红移。
图2是本发明实施例1、实施例2、对比例1制备的指示膜的机械性能测定结果。不同小写字母代表显著性差异(p<0.05)。
图3是本发明实施例1、实施例2、对比例1制备的指示膜的水溶性测定结果。不同小写字母代表显著性差异(p<0.05)。
图4是本发明实施例1、实施例2、对比例1制备的指示膜的氨气响应测定结果(a)及响应前后颜色变化图(b)。
图5是本发明实施例1(PS-CS-LCA pH2.5)指示膜分别在pH2-12条件下的图片。当pH为2-4时，指示膜PS-CS-LCA pH2.5呈粉红色，且随着pH值的增大红度降低；当pH为5和6时，指示膜PS-CS-LCA pH2.5分别呈淡紫色和灰粉色；在pH2-6的变化过程中a值显著降低(3.14→0.74)；当pH为中性即7时，指示膜PS-CS-LCA pH2.5呈现出蓝灰色；继续增大pH值至8-9时，指示膜PS-CS-LCA pH2.5分别呈现青色和水绿色；pH为10时，指示膜PS-CS-LCApH2.5分别呈灰蓝色；当pH值到达11-12范围时，指示膜PS-CS-LCA pH2.5逐渐呈现蓝色，且蓝色强度递减。
图6(a)是本发明实施例1指示膜在变质监测中的pH、菌落总数测定结果；图6(b)是本发明实施例1指示膜在变质监测中的挥发性盐基氮含量、ΔE值测定结果。不同小写字母代表显著性差异(p<0.05)。
图7是本发明实施例1指示膜在鲜虾的变质监测中的颜色变化图：红色(0h)→玫瑰红(12h)→灰粉色(24h)→灰色(30h)→蓝灰色(36h)。
图8是本发明实施例1指示膜在鲜虾的变质监测应用中颜色参数的主成分分析结果。
图9是本发明对比例1指示膜在鲜虾的变质监测中的颜色变化图：颜色本质无明显差异，0～36h灰色强度降低。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
一种pH2.5淀粉-壳聚糖-蓝靛果花色苷食品次鲜级色敏指示膜的制备方法：
将浓度为60mg/mL马铃薯淀粉水溶液在磁力搅拌下逐渐升温至62℃使淀粉达到刚糊化状态，所述磁力搅拌速率为800r/min，搅拌时间为30min，得到经糊化处理的马铃薯淀粉溶液。将壳聚糖溶解于1％的乙酸溶液中配制成8mg/mL的壳聚糖溶液。将经糊化处理的马铃薯淀粉溶液和壳聚糖溶液按照体积比1:1混合得淀粉-壳聚糖混合溶液。
将蓝靛果花色苷溶于酸性乙醇溶液(所述酸性乙醇溶液由1mol/L的乙酸和无水乙醇按体积比3:17组成)中，配置成6mg/mL的蓝靛果花色苷粗提物溶液。
取2mL蓝靛果花色苷粗提物溶液加入到上述80mL淀粉-壳聚糖混合溶液中，得淀粉-壳聚糖-蓝靛果花色苷混合溶液。按照体积分数2.5％的添加量向上述淀粉-壳聚糖-蓝靛果花色苷混合溶液中加入甘油，并调节溶液最终pH＝2.5，磁力搅拌30min，搅拌速率为800r/min，得成膜液，制备成最终成膜液体积约为80mL。将成膜液倒入成膜板中，置于烘箱中45℃干燥12h烘干成膜，并于干燥器中平衡10h后揭膜，得淀粉-壳聚糖-蓝靛果花色苷pH和NH3高响应型食品次鲜级花色苷指示膜，膜厚度为1.5～2.0mm将其命名为PS-CS-LCApH2.5指示膜。
实施例2
一种pH3.0淀粉-壳聚糖-蓝靛果花色苷食品次鲜级色敏指示膜的制备方法：
将实施例1中调节溶液最终pH＝2.5替换成pH＝3.0，其余制备条件不变。将其命名为PS-CS-LCA pH3.0指示膜。
对比例1
一种pH3.5淀粉-壳聚糖-蓝靛果花色苷食品次鲜级色敏指示膜的制备方法：
将实施例1中调节溶液最终pH＝2.5替换成pH＝3.5，其余制备条件不变。将其命名为PS-CS-LCA pH3.5指示膜。
蓝靛果花色苷在不同pH条件下颜色变化及紫外可见光谱分析：
利用紫外分光光度计测定蓝靛果花色苷提取物溶液在pH2-12条件下的紫外-可见光谱，扫描波长为380-780nm，并绘制紫外-可见光谱图，同时用相机记录颜色变化。
蓝靛果花色苷溶液在pH2-12条件下的颜色变化如图1(a)所示。pH2-3时溶液呈红色，随着pH值的增加到4-6时溶液的红色程度逐渐降低变成淡粉色且颜色强度递减，pH为7时溶液呈茶色，pH为8-9时溶液呈浅灰色且颜色强度递增，pH为10时溶液呈紫色，pH为11-12时溶液呈褐色且颜色强度递增。蓝靛果花色苷溶液在pH2-12条件下的紫外-可见光谱如图1(b)所示。花色苷溶液在酸性条件下最大吸收峰在波长520nm附近，随pH升高，花色苷的最大吸收波长从520nm向580nm移动，发生红移。结果表明蓝靛果花色苷溶液在pH2-12条件下呈现出了显著的颜色变化。
对实施例1以及实施例2、对比例1指示膜的机械性能、水溶性、表观颜色、氨气响应、pH响应进行测试，得到结果如下。
一、指示膜的机械性能测定：参照GB/T 1040.3—2006《塑料拉伸性能的测定》的方法测定机械性能，把膜裁剪为100mm×15mm的长条状，固定在电子拉力试验机上，测量膜的拉伸强度(Tensile Strength,TS)和断裂伸长率(Elongation at Break,EBA)。初始夹距为80mm，拉伸速率为250mm/s，每组膜重复测定10次。拉伸强度和断裂伸长率分别按照公式[1]和[2]计算。
TS＝F/W×d [1]
其中，TS为拉伸强度，MPa；
F为试样断裂时承受的最大拉力，N；
W为膜的宽度，mm；
d为膜的厚度，mm。
EBA＝L1/L0×100 [2]
其中，EBA为断裂伸长率，％；
L1为膜断裂时的拉伸长度，mm；
L0为初始夹距，mm。
指示膜的水溶性测定：将指示膜放在105℃烘箱中烘至恒质量W1(g)然后浸泡在50mL蒸馏水中，24h后倒出浸泡液，再次放入105℃烘箱中烘至恒质量并称取质量为W2(g)，每组重复测定3次。根据公式[3]计算水溶性：
水溶性/100％＝(W1-W2)/W1×100 [3]
指示膜的机械性能结果如图2所示，随着成膜溶液pH值从2.5增加到3.0指示膜的拉伸强度略有增加(5.98MPa→6.43MPa)，但无显著性差异；当成膜液pH增加到3.5时拉伸强度(4.74MPa)显著降低。指示膜的断裂伸长率在成膜溶液pH值为2.5～3.5的变化过程中没有显著性差异。指示膜的水溶性结果如图3所示，成膜溶液pH值为2.5和3.0时指示膜的水溶性分别为33.11％和33.20％，无显著性差异；当成膜溶液pH值为3.5时，指示膜的水溶性为36.46％，高于实施例1和实施例2。综上，成膜液的pH值对指示膜的物理性能影响较小，但均呈现出良好的物理性能。
二、指示膜表观颜色及参数的测定：利用色度仪测定实施例1、实施例2、对比例1复合膜的颜色参数(L，a，b)，同时用相机记录各复合膜的颜色照片。以标准白板(L0＝97.02,a0＝-0.92,b0＝2.06)为色差参比，根据公式[4]计算各复合膜的总色差ΔE值。
表1实施例1及实施例2、对比例1的颜色参数测定结果
注：同一列的不同小写字母代表显著性差异，p<0.05。
表1为实施例1及实施例2、对比例1的颜色参数(L，a，b)、ΔE值及指示膜图像。随着成膜溶液pH值从2.5增加到3.5，指示膜的a值(4.72→2.66→-0.59)和b值(-0.23→-0.54→-0.98)均显著降低。对应地，实施例1、实施例2、对比例1的指示膜颜色分别为红色、粉红色、灰色。成膜溶液pH2.5的指示膜(实施例1)色差值最大(57.79)，同时从图像看其呈现出最大的颜色强度。综上，成膜溶液pH的降低对最终指示膜颜色变化影响显著，且低pH值下指示膜颜色强度最大，红度最强，指示膜的视觉呈现效果更强烈，易于观测其颜色状态，为后续显色应用提供良好的基础。
三、氨气响应测定：在含10mL氨水(20％，v/v)的100mL锥形瓶上覆盖指示膜，测定其对氨水的比色响应，颜色变化由相机捕捉，用色度计测量颜色参数(L，a，b)，以初始膜颜色为参比，根据公式[4]计算ΔE值，时间隔1min，持续监测20min。
为了评价指示膜对碱性气体的敏感性，本研究对挥发氨进行了颜色响应性试验。将指示膜暴露在氨水溶液上空，通过氨气挥发观察指示膜的颜色变化，其作用机理是氨气与指示膜中的水结合形成NH3·H2O，然后水解形成NH4+和OH-，OH-会导致花色苷的颜色发生变化，进而促使指示膜颜色发生变化。氨气响应结果如图4(a)所示，随着响应时间的增加指示膜的L，a值变化显著，先逐渐降低，随后基本保持不变。相应地，PS-CS-LCA pH2.5、PS-CS-LCA pH3.0、PS-CS-LCA pH3.5指示膜的响应时间达到15、11、10min时，总色差分别为9.18、8.13、5.86，此后均保持稳定，无明显变化。由图4(b)中可以直观的看出，响应20min后三种指示膜呈现出明显的颜色变化：PS-CS-LCA pH2.5由红色变为水绿色；PS-CS-LCA pH3.0由粉红色变为蓝灰色；PS-CS-LCA pH3.5由红色变为深青色。在所有指示膜中PS-CS-LCApH2.5(实施例1)表现出最高的色差值，氨气响应性最佳。
综上，比较实施例1与实施例2、对比例1，在机械性能、水溶性、表观颜色、氨气响应等方面实施例1均表现出优势性。因此对实施例1(PS-CS-LCA pH2.5指示膜)进行应用研究表征。
将PS-CS-LCA pH2.5膜浸泡在不同pH值(pH2-12)的缓冲溶液中，评价PS-CS-LCApH2.5膜的pH响应性。颜色参数(L、a、b)和ΔE以及颜色变化图像如表2所示。
表2实施例1(PS-CS-LCA pH2.5指示膜)的颜色参数及颜色变化测定结果
注：同一列的不同字母代表显著性差异，p<0.05。
由表2和图5可以观察到，当pH为2-4时，指示膜PS-CS-LCA pH2.5呈粉红色，且随着pH值的增大红度降低；当pH为5和6时，指示膜PS-CS-LCA pH2.5分别呈淡紫色和灰粉色；在pH2-6的变化过程中a值显著降低(3.14→0.74)；当pH为中性即7时，指示膜PS-CS-LCApH2.5呈现出蓝灰色；继续增大pH值至8-9时，指示膜PS-CS-LCA pH2.5分别呈现青色和水绿色；pH为10时，指示膜PS-CS-LCA pH2.5呈灰蓝色；当pH值到达11-12范围时，指示膜PS-CS-LCA pH2.5逐渐呈现蓝色，且蓝色强度递减。指示膜PS-CS-LCA pH2.5在pH值为2-12的范围内呈现出清晰的不同颜色的变化。然而，多数动物性产品蛋白质的微生物腐败导致的产品变质pH范围大致在5-8之间，在此pH范围内指示膜PS-CS-LCA pH2.5的颜色变化显著，肉眼易于区分，为后续次鲜级指示提供有力支撑。
一种pH和NH3高响应型食品次鲜级色敏指示膜的应用：
本发明将所制备的指示膜应用在包装虾的新鲜度监测中，将鲜虾在4℃条件下储存36h，期间分别按照GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》、GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》、GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》操作要求测定其pH、挥发性盐基氮含量(TVB-N)、菌落总数(TVC)指标的变化情况，同时拍照记录指示膜的颜色变化并计算ΔE值。
测定结果(图6)及指示膜的颜色变化(图7)结果：当贮存时间达到24h和30h，鲜虾的TVB-N值由初始的9.80mg/100g分别增加到22.87mg/100g、29.40mg/100g，虾的pH值(6.78→7.43→7.50)，TVC值(3.17→4.05→5.35(lg(CFU/g)))均发生显著变化，对应的指示膜颜色从初始的红色变为灰粉色(24h)和灰色(30h)，ΔE值分别为8.01和8.95，根据国标GB2733—2015规定新鲜海水鱼虾中TVB-N应该小于30mg/100g，因此判定在24h到30h贮藏期间鲜虾为次鲜级，是腐败变质的临界点，此时警告商家和消费者食品腐败即将发生。当贮藏时间达到36h时，鲜虾的TVB-N值为38.50mg/100g，表明虾已完全腐败，相应的pH值为7.68、TVC值为6.37(lg(CFU/g))，此时指示膜呈现出蓝灰色，ΔE值为10.95，肉眼可直观地察觉到指示膜颜色的改变。
主成分分析：将每组鲜虾样本平行检测10次，对指示膜的图像进行特征提取后获得5×10×3维的数据(5代表天数0h、12h、24h、30h、36h，10代表每天的平行试验次数，3代表R、G、B变量)，通过PCA对实验数据进行统计分析，绘制三维图。
在R、G、B颜色空间模型下提取指示膜的特征信号，特征信号被重组为三个主成分。如图8所示，第一主成分的贡献率为79.69％；第二主成分的贡献率为19.88％；第三主成分的贡献率为0.43％。根据TVB-N的测定结果将0、12h的鲜虾样本判定为新鲜级，24、30h的鲜虾样本为次新鲜级，36h的鲜虾样本为腐败。主成分的三维如图8所示，在4℃贮藏环境下，不同贮藏时间的虾样本存在明显的聚类趋势，可较好地分成新鲜级、次鲜级和腐败级三个等级。PCA结果证明，所制备的PS-CS-LCA pH2.5指示膜可以作为虾的次鲜级指示。
同样的，将对比例1(PS-CS-LCA pH3.5)指示膜应用在鲜虾的变质监测时，肉眼无法清晰分辨出整个监测过程中指示膜的颜色变化(图9)，因此不能界定出所监测产品的次鲜状态，无法预警消费者产品即将腐败。
综上，本发明中通过调控成膜液pH值优选出的PS-CS-LCA pH2.5指示膜表现出良好的物理性能、氨气响应性能以及pH响应性能。应用实验结果中，该指示膜可以显著区分鲜虾的新鲜、次鲜、腐败级。因此，本发明中指示膜通过颜色的变化实时可视化监控并预警制造商和消费者食品腐败的发生，以期为天然花色苷指示膜应用于腐败变质过程中产生挥发性含氮化合物的生鲜类产品货架期监测提供参考。
