一种香水莲花多糖提取物及其制备方法和应用
技术领域
：本发明属于植物提取领域，具体涉及一种香水莲花多糖提取物及其制备方法和应用。
背景技术
：香水莲为大型睡莲，属于睡莲科多年生水生宿根草本植物。香水莲花香味淡雅、花期长，为国内外城市园林水景、庭院造影景、盆栽观赏珍稀水生花卉最高档的品种。上世纪70年代美国香莲引入我国台湾，并在此基础上，经过培育开发出金、黄、紫、蓝、赤、茶、绿、红、白等九大色系，故又名“九品香水莲”。香水莲为适于热带至温带气候，因而在我国广东、湖南、浙江、江苏、海南等地都有广泛的种植。香水莲花的花朵具有非常显著的可观赏性，为我国高档水生观赏水生植物品种。
它的花朵不仅可直接泡鲜香水莲花茶，还可供人生食、泡茶、浸酒、炖煮食物等，作为药食同源新资源植物使用。此外，香水莲花在120度高温下，经过杀菌烘培，可以制作成九品香莲茶，具有消暑保健作用。香水莲花花朵内含有植物胎盘素和天然花粉，具有良好的镇静安静作用，还能软化皮肤、去除死皮的功效。此外，香水莲花还能养颜美容，增强免疫力，促进新陈代谢之功效。当前，香水莲已经正式成为奥运会的礼仪之花。
在香水莲花多糖的提取纯化过程中，当前已有的技术是依赖大孔树脂吸附，制备的多糖带有明显的色泽，因而久置容易发生色泽的变化，将困扰相关产品特别是美白产品的后续开发。当前香水莲花多糖的提取一般采用高温和超声波辅助提取法，然而多糖在高温或者超声波作用下，多糖结构容易发生断裂而变性。
同时，香水莲花多糖的提取主要集中在粗提物或者高分子量多糖，多糖的含量不高或者性质不能满足后续产品开发的需求。
发明内容
：基于当前香水莲花多糖提取方法的缺陷，本发明的目的是提供一种香水莲花多糖提取物及其制备方法，实现高纯度的、性质稳定、白色的、中等分子量(分子量主要为80-360KD) 的香水莲花多糖高效提取，在保持香水莲花多糖保湿、美白、抗菌、抗氧化等功效的基础上，更方便其通过皮肤体表吸收。
本发明的香水莲花多糖提取物的制备方法，包括以下步骤：
A、取香水莲花粉碎，加水浸提，提取液经浓缩获得浸膏；
B、向浸膏中加入乙醇溶液，搅拌后过滤，沉淀冷冻干燥后，得多糖粗提物I；
C、取多糖粗提取物I溶于水中，用Sevag法脱蛋白，沉淀洗出后过滤，沉淀经过干燥后，得多糖粗提物II；
D、除单糖及寡糖：将多糖粗提物II溶于水中，使用8000-14000D截止分子量的透析膜进行透析，向透析后的多糖粗提物液体加入乙醇溶液，搅拌至沉淀吸出后过滤，沉淀干燥后得多糖粗提物III；
E、凝胶柱纯化：将多糖粗提物III用凝胶色谱柱纯化，用硫酸-苯酚法跟踪馏分，收集主峰合并后，加入乙醇溶液，搅拌后过滤，沉淀冷冻干燥，得香水莲花多糖提取物。
所述的香水莲花是干燥或者新鲜的花朵。
所述的粉碎是粉碎至20目，以保证多糖能快速提取。
所述的加水浸提是将粉碎后的香水莲花加5-10倍的水浸泡，机械搅拌，水浴提取3-5次，每次1-12小时，然后过滤，合并滤液。在室温至50℃之间进行提取，以保证多糖性能稳定不被降解；此外，水的用量为香水量化的5-10倍。
所述的Sevag法脱蛋白是取多糖粗提取物I溶于水中，通过加入5∶1体积比的氯仿：正丁醇混合溶剂，搅拌后分层，回收上清液，向上清液中加入乙醇溶液，搅拌至沉淀析出后过滤，沉淀经过干燥后，得多糖粗提物II。
所述的透析是透析2天。
本发明的优势之处在于在室温下或者低温下提取保证了香水莲花多糖的原始结构不被降解，制备的多糖颜色纯白、纯度高(94％-99％)、性质稳定、易溶于水。制备的香水莲花多糖质量可控，活性成分含量高(94％-99％)，具有抗菌、美白、保湿以及抗氧化等药理功能。此外，制备的工艺路线操作方便，产品能广泛应用于化妆品、饮料以及保健食品中添加。
具体实施方式
：
下面将结合实施案例进一步说明本发明的实质内容与实施效果，该实施案例仅用于说明本发明的过程与结果，而非对本发明的限制。
实施例1、香水莲花多糖提取物的制备
取冷冻干燥后的香水莲花100g，经过粉碎机进行粉碎，粉碎后的粉末经过20目的铁筛过滤，得到香水莲花微粉。向香水莲花微粉中加入10倍体积(1L)水，并在室温下经过机械搅拌(400转/每分钟)水浴中浸提4-5h。浸提液经过纱布初滤，收集滤液。药渣同法再浸提2次，合并3次滤液。滤液再经过旋转蒸发仪减压浓缩至原体积的1/10(100mL)，向浓缩液中加入体积分数95％乙醇溶液(130mL)，并搅拌以进行沉淀，当加入的乙醇浓度达到60％(体积含量)的时候，有大量絮状沉淀出现。沉淀经过纱布过滤后，真空干燥，得多糖粗提物I(27g)。
将多糖粗提物I溶于水(100mL)中，通过加入5∶1体积比的氯仿：正丁醇混合溶剂(100 mL)，充分搅拌后分层，回收上清液，向上清液中加入体积分数95％乙醇水溶液(130mL)，搅拌至沉淀析出后过滤，沉淀经过干燥后，得多糖粗提物II(16g)。
将上述多糖粗提物II溶于水(100mL)中，使用8-14KD截止分子量的透析膜进行透析2 天后，向透析后的多糖粗提物液体加入体积分数95％乙醇水溶液(130mL)，搅拌至沉淀吸出后过滤，沉淀干燥后得多糖粗提物III(11g)；
将上述多糖粗提物III用凝胶色谱柱纯化，用硫酸-苯酚法跟踪馏分，收集主峰合并后。洗脱液合并后，使用旋转蒸发仪进行常温加压浓缩，当洗脱液浓缩至50mL后，一次性加入体积分数95％乙醇水溶液(80mL)，搅拌后过滤。滤饼经过冷冻干燥12h后，得香水莲花多糖提取物(7g)。该莲花多糖为白色固体粉末，纯度为94％-99％，分子量主要为80-360KD。该莲花多糖能在室温下快速(10min)溶于水中，并且于室温下密封放置30d无颜色与物化性质变化。
实施例2：化合物的抗菌活性评价
本实施例将采用刃天青显色法测定样品抗菌活性的最低抑菌浓度(MIC)。供实验菌株为 Methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)、 Staphylococcus aureus(SA，金黄色葡萄球菌)、Bacillus cereus(BC，蜡状芽孢杆菌)、B.subtilis (BS，枯草芽孢杆菌)、B.thuringiensis(BT，苏云金杆菌)或Escherichiacoli(EC，大肠杆菌)等革兰氏阳性菌或阴性菌。
试验中将使用96孔板稀释滴度技术，同时测定多种物质的最低抑菌浓度(MIC)。首先将 7.5mL的指示剂溶液(100μg/mL的刃天青水溶液)与5mL的待测菌溶液(108CFU/mL) 混匀，并向第1至第8列的所有测试孔中各加入100μL混合菌液。然后将100μL待测样品的水溶液(32mg/mL)依次加入到第一列的各个板孔中，均匀混合后取出100μL的溶液转移到第二列相应的板孔中，并用同样的方法倍增稀释到第8列。最后，将加好样品的孔板放入到恒温培养箱，37℃培养10-12h。菌液变红色为无抑菌活性，蓝色为有抑菌活性，菌液维持蓝色的最低稀释浓度被认为是待测化合物的最低抑菌浓度。每个试样作3个平行样份。
结果表明：香水莲花多糖提取物对于革兰氏阳性菌具有明显的抗菌活性，在浓度大于2 mg/mL时，几乎对Methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)、Staphylococcus aureus(SA，金黄色葡萄球菌)、Bacillus cereus(BC，蜡状芽孢杆菌)、B.subtilis(BS，枯草芽孢杆菌)、B.thuringiensis(BT，苏云金杆菌)都具有明显的抑制效果。上述结果表明，香水莲花多糖提取物在抗菌消炎方面具有良好的应用前景。具体的实验结果如下表1所示。
表1香水莲花多糖的体外抗菌活性(MIC)
实施例3：抑制脂质过氧化活性的测定
称取0.50mL卵磷脂溶液，将其加入到1.0mL pH＝7.0的PBS缓冲液中。将1.0mL含有不同浓度的样品溶液与1.0mL含有2.5mmol/L EDTA-Fe(II)的水溶液均匀混合，然后将其加入前述卵磷脂的PBS混合溶液中。待混匀后，将其置于37℃水浴中反应45min。再相继加入28％(w/v)的三氯乙酸2.0mL、1％(w/v)的硫代巴比妥酸1.0mL。待混匀后，将混合溶液置于100℃沸水浴中加热10min，冷却后在532nm处测定吸光度。用PBS缓冲液调零，空白管用PBS缓冲液代替样品测吸光度A0。每个试样作3个平行样份，取其平均值A1。按下式计算脂质过氧化抑制率：抑制率(％)＝[(A0-A1)/A0]×100式中：A0为不含样品的吸光度； A1为含样品的吸光度。
结果表明：香水莲花多糖提取物对于脂质过氧化具有明显的抑制活性。该结果说明，香水莲花多糖提取物在作为抗氧化剂应用方面具有一定的潜能。具体的实验结果如下表2所示。
表2、香水莲花多糖的体外抗脂质过氧化活性
实施例4：香水莲花多糖细胞内抑制酪氨酸酶的活性测定
调整小鼠黑色素瘤细胞数为5×104个/mL，并在96孔板中每孔添加细胞液100μL，再补充培养液100μL，铺板12h后，弃上清。此后，向体系内加入200μL含不同质量浓度样品的培养液(质量浓度梯度为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mg/mL)，在37℃，体积分数 5％CO2饱和湿性条件下培养，每一质量浓度设6个复孔，以不添加样品培养的细胞作为空白对照，培养48h，每天换液。采用多巴氧化法对酪氨酸酶活性进行测定。将孔板中上清液弃去，用PBS缓冲液漂洗后每孔加入1％Triton-X100 40μL，迅速放入-80℃冰箱内，30min 后取出于37℃融化，破裂细胞，加入1％L-DOPA溶液10μL/孔，以L-DOPA为本底进行校正，以不加美白剂培养的细胞作为对照，37℃反应30min，置酶标仪测定450nm处A450 值。测定时以相应的阴性对照为参比，用下列公式计算受试液(包括阳性对照)对酪氨酸酶的抑制率。抑制率(％)＝(A–B)/A×100％其中，A为标准对照的吸光值，B为阳性对照的吸光值。每个实验做3个平行。抑制率高表明其对酪氨酸酶活性的抑制强度高。
结果表明：香水莲花多糖提取物抑制酪氨酸酶具有明显的抑制活性，特别在浓度大于1.6 mg/mL时，表现出良好的抗酪氨酸酶活性，具体的实验结果如下表3所示。酪氨酸酶是一种氧化酶，且是调控黑色素生成的限速酶。它存在于植物与动物组织中，催化生成由酪氨酸氧化而来的黑色素以及其它色素。酪氨酸酶抑制剂一般都是优良的美白剂，能够抑制皮肤黑色素的生成。该结果说明，香水莲花多糖提取物能够做美白剂广泛应用与美白产品的开发。
表3、香水莲花多糖的体外抗酪氨酸酶活性
实施例5：具有美白、抗菌、保湿以及抗氧化等功能的香水莲花多糖精华液的制备
取200mg香水莲花多糖提取物溶于100mL超纯水中，搅拌30min后，依次加入苯氧乙醇(0.5mL)、丁二醇(0.2mL)、儿茶素(1.0g)、橙花香精(0.2mL)。充分搅拌均匀后，得到近似凝胶状的香水莲花多糖精华液。
实施例6：香水莲花多糖饮料的制备
取200mg香水莲花多糖提取物溶于100mL超纯水中，搅拌30min后，依次加入多聚赖氨酸(0.5g)、脱氢乙酸钠(0.5g)、蔗糖(2.0g)、甜菊糖(0.2g)、橙汁(10mL)。充分搅拌均匀后，得到近似橙汁味的香水莲花多糖功能性饮料。
实施例7：香水莲花多糖含片的制备
取1.0g香水莲花多糖提取物、4.0g木糖醇、50mg甜菊糖、50mg橙汁粉和50mg硬脂酸镁，搅拌均匀后，经粉碎机粉碎成300目以上的微粉。加入3mL超纯水搅拌均匀后，制成颗粒状(大约25颗)。把制成的颗粒冷冻干燥后，经过压片机压片，记得香水莲花多糖功能性含片。
