一种桦褐孔菌多糖及其提取方法
技术领域
本发明涉及药食用菌提取
技术领域
，具体涉及一种桦褐孔菌多糖的提取方法。背景技术
桦褐孔菌(Inonotusobliquus(Fr.)Pilt)是一种珍稀而名贵的药用真菌，在《全国中草药汇编》中记载名为桦菌芝，又名桦树茸、白桦茸、桦树菇、褐多孔菌、桦癌褐孔菌、斜管纤孔菌、蔷甘、和西伯利亚灵芝，生物学范畴上，属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属，多寄生于白桦、银桦、榆树、赤杨等树皮下或被砍伐后的枯干上，主要分布在北纬45°-50°的地区。
早在12世纪，满族人们就用桦褐孔菌调理疾病，据称满族人民在大雪封山时是依靠桦褐孔菌治疗百病，多年以来，桦褐孔菌在许多国家被用于抵抗疾病。值得一提的是，其在多种疾病治疗期间未被发现明显的毒性和副反应。美国FDA将其认证称为“TheKingofHerbs”，并列入“特殊的天然物质”。现代研究表明，桦褐孔菌活性成分有：多糖、三萜类(桦褐孔菌醇、羊毛甾醇、麦角甾醇、栓菌酸、桦褐孔菌素等)、黄酮类、氨基酸类、木质素类、生物碱类、多酚类、叶酸衍生物、芳香物质(香草酸、丁香酸和γ羟基苯甲酸等)、鞘氨脂类似物、三肽等，具有抗氧化、抗衰老、免疫调节、抗肿瘤、降血糖血脂、肝肾损伤保护、抗病毒、抗炎、抗疲劳等诸多药理活性。
桦褐孔菌具有良好的保健功效和营养价值，近年来已逐渐受到国内外学者和消费者的关注。采用常规的方法提取桦褐孔菌多糖由于产率低，难于工业化生产。如何通过改进生产工艺既能提高桦褐孔菌多糖的产率以及其水溶性，这是制备褐孔菌多糖的一个难题。
在公开号为CN202011478246.1的专利中公开了一种桦褐孔菌多糖的提取和纯化方法，其依次通过乙酸乙酯和醇提，以及超声和纤维素酶酶解脱纤维素，木瓜蛋白酶脱蛋白，聚酰胺树脂柱脱色和AB-8树脂脱色的方法，以提高桦褐孔菌多糖的得率。本领域技术人员可知：采用聚酰胺树脂柱脱色和AB-8树脂脱色的方法对于有机物的损耗率非常高。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种桦褐孔菌多糖及其提取方法，其通过离子液体结合复合酶酶解的方法，可以有效提高桦褐孔菌多糖的产率，特别是能够显著提高水溶性桦褐孔菌多糖的提取率。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
第一方面，本发明实施例提供一种桦褐孔菌多糖的提取方法，其包括以下步骤：
S1桦褐孔菌子实体经过离子液体水溶液加热至50℃～100℃，浸提1～2小时得到浸提液；离子液体水溶液中离子液体的质量分数为1％～10％，桦褐孔菌子实体和离子液体水溶液的质量体积比为1:10～1:100；
离子液体水溶液为1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯盐、1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑乙酸盐、1-酰胺基-3-甲基咪唑乙酸盐、1-酰胺基-3-甲基咪唑氯盐、1-甲基-3-甲基咪唑磷酸二甲酯盐、1-甲基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯盐、1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二甲酯盐、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐或1-丁基-3-甲基吡啶氯盐中的任意一种或两种以上的组合；
S2酶解：将所得到的浸提液经过复合酶酶解后得到酶解提取液；
S3将所得到的酶解提取液减压浓缩后得到浸膏，向浸膏中加入乙醇溶液进行醇沉，得到的沉淀经干燥后得到所述桦褐孔菌多糖。
离子液体是指在室温或接近室温下呈现液态的、完全由阴阳离子所组成的盐，也称为低温熔融盐。离子液体作为离子化合物，其熔点较低的主要原因是因其结构中某些取代基的不对称性使离子不能规则地堆积成晶体所致。它一般由有机阳离子和无机或有机阴离子构成。本发明方案中的离子液体可与桦褐孔菌多糖形成氢键，能有效促进木质纤维的溶解，而且与酶有良好生物相容性，促进多糖的溶出率。
本发明方案中，离子液体加热处理后能有效促进木质纤维的溶解，而且与酶有良好生物相容性，有效提高在复合酶酶解阶段多糖的溶出率，从而提高桦褐孔菌多糖的提取率。桦褐孔菌多糖通过与离子液体氢键强的作用力下，在通过复合酶解降解的的方式将桦褐孔菌多糖随离子液体释放溶解在水中，从而可以通过离心过滤的方式去除非多糖类物质。其中，复合酶可以是应用于多糖领域的任何酶的组合；优选为可以降解细胞壁的复合酶。
本发明桦褐孔菌多糖的提取方法可选地方案中，酶解包括以下步骤：将所得到的浸提液pH值调整至5～7，加入纤维素酶和溶菌酶在40～50℃下搅拌酶解1～2小时；浸提液中，纤维素酶活力为58.8U/ml、溶菌酶活力为70.5U/ml。
本发明优选采用纤维素酶和溶菌酶作为复合酶酶解，其中，本发明特别地通过溶菌酶，溶菌酶主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成具有生物药理活性的可溶性糖肽；纤维素酶降解纤维素成葡萄糖；本申请通过纤维素酶和溶菌酶的组合，能够快速降解细胞壁，同时生成可溶性糖肽和多糖，利于与大分子有机物分离，可以避免柱层析等损耗率过大的纯化。
本发明桦褐孔菌多糖的提取方法可选地方案中，所述酶解还包括以下步骤：将纤维素酶和溶菌酶的酶解液调节pH值至3～7，加入按酶活力824.6U/ml添加木瓜蛋白酶，在温度20～50℃下搅拌酶解1～2小时，灭酶处理后，离心得到的上清液为酶解提取液。
将纤维素酶和溶菌酶的酶解液通过木瓜蛋白酶可以进一步降解蛋白，以去除蛋白，其中，优选地，将纤维素酶和溶菌酶的酶解液过滤去渣后的酶解液加入木瓜蛋白酶；木瓜蛋白酶降解残留的大分子蛋白，提高多糖分子的纯度。在上述酶解的条件下，可以将大分子蛋白与多糖分子分离成不溶性的大分子多肽，通过离心的方法就可以有效的去除蛋白。
本发明桦褐孔菌多糖的提取方法的可选地方案中，所述桦褐孔菌子实体经过有机溶剂脱脂处理得到的残渣再经过离子液体水溶液加热处理。
优选地，步骤S1中，取干燥的桦褐孔菌子实体，将其粉碎后过100目筛。
本发明桦褐孔菌多糖的提取方法的可选地方案中，所述有机溶剂与干燥的桦褐孔菌子实体的质量体积比为5:1～10:1；所述有机溶剂为石油醚或/和正乙烷。
本发明桦褐孔菌多糖的提取方法的可选地方案中，所述浸膏密度为1～1.5g/m3，乙醇溶液的质量分数为95％，乙醇溶液的体积为浸膏体积的3倍。
第二方面，本发明还提供上述任一方案中所得到的桦褐孔菌多糖。
(三)有益效果
本发明的有益效果是：
本发明提出的桦褐孔菌多糖的提取方法，其通过离子液体加热浸提和复合酶酶解的方式，可以有效提高桦褐孔菌多糖的提取率，所得到的桦褐孔菌多糖的干燥物中，多糖含量达70％以上；与传统超声波辅助提取法、微波辅助提取法、热水浸提法相比，提取率可提高2％～10％；而且本发明方法简单、易于操作，便于产业化生产；
其中，离子液体是可与多糖形成氢键，能有效促进木质纤维的溶解，而且与酶有良好生物相容性，促进多糖的溶出率。
其中，本发明优选采用纤维素酶和溶菌酶组合在离子液体中可高效降解大分子，通过破坏细胞壁中的糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性多糖。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
本发明实施例提出的桦褐孔菌多糖的提取方法，其依次通过离子液体水溶液加热浸提的方法和复合酶酶解的方法，将桦褐孔菌多糖通过与离子液体氢键强的作用力下，在通过复合酶解降解的的方式将桦褐孔菌多糖随离子液体释放溶解在水中，从而可以通过离心过滤的方式去除非多糖类物质。
为了更好的理解上述技术方案，下面将更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然以下显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更清楚、透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1
桦褐孔菌多糖的提取方法，其步骤为：
S1取桦褐孔菌子实体在40℃的条件下减压烘干至水分含量为10％，得到干燥的桦褐孔菌子实体，将其粉碎后过100目筛后；将干燥的桦褐孔菌子实体按质量体积比为1∶50，加入质量分数为5％的1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯盐水溶液，加热至80℃浸提1小时，得到浸提液；
S2酶解：将所得到的浸提液冷却至45℃，pH值调整至6，加入纤维素酶和溶菌酶在40℃下搅拌酶解1.5小时；浸提液中，纤维素酶活力为58.8U/ml、溶菌酶活力为70.5U/ml；酶解后过滤得到的上清液为酶解提取液；
S3将所得到的酶解提取液减压浓缩后得到膏密度为1g/m3浸膏，向浸膏中加入浸膏体积3倍的质量分数为95％乙醇溶液进行醇沉12小时，反复2次，收集沉淀并用丙酮清洗2次，经冷冻喷雾干燥机中进行干燥，设置温度为-30℃，压力不高于0.05MPa，冷冻12小时，干燥后得到桦褐孔菌多糖。
本实施例将桦褐孔菌子实体通过离子液体水溶液加热浸提，以及纤维素酶和溶菌酶的复合酶酶解得到纯度较高的桦褐孔菌多糖。桦褐孔菌多糖中多糖的含量为70.6％，得率为36.3％。
实施例2
桦褐孔菌多糖的提取方法，其步骤为：
S1取桦褐孔菌子实体在40℃的条件下减压烘干至水分含量为10％，得到干燥的桦褐孔菌子实体，将其粉碎后过100目筛后；将干燥的桦褐孔菌子实体按质量体积比为1∶50，加入质量分数为5％的1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯盐水溶液，加热至80℃浸提1小时，得到浸提液；
S2酶解：将所得到的浸提液冷却至45℃，pH值调整至6，加入纤维素酶和溶菌酶在40℃下搅拌酶解1.5小时；浸提液中，纤维素酶活力为58.8U/ml、溶菌酶活力为70.5U/ml；酶解后得到复合酶解液；
S3将复合酶酶解液按酶活力824.6U/ml加入木瓜蛋白酶，在温度40℃下搅拌酶解1.5小时后，酶解结束后，升温至100℃，保持2分钟进行灭酶处理，6000r/min下离心10min，得到的上清液为酶解提取液；
S4将所得到的酶解提取液减压浓缩后得到膏密度为1g/m3浸膏，向浸膏中加入浸膏体积3倍的质量分数为95％乙醇溶液进行醇沉12小时，反复2次，收集沉淀并用丙酮清洗2次，经冷冻喷雾干燥机中进行干燥，设置温度为-30℃，压力不高于0.05MPa，冷冻12小时，干燥后得到桦褐孔菌多糖。
本实施例将桦褐孔菌子实体通过离子液体水溶液加热浸提，以及纤维素酶和溶菌酶的复合酶酶解降解多糖，并通过木瓜蛋白酶去除蛋白后，得到纯度较高的桦褐孔菌多糖。桦褐孔菌多糖中多糖的含量为76.8％，得率为33.6％。
实施例3
桦褐孔菌多糖的提取方法，其步骤为：
S1取桦褐孔菌子实体在40℃的条件下减压烘干至水分含量为10％，得到干燥的桦褐孔菌子实体，将其粉碎后过100目筛后；将干燥的桦褐孔菌子实体按质量体积比为1∶50，加入质量分数为5％的1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯盐水溶液，加热至80℃浸提1小时，得到浸提液；
S2酶解：将所得到的浸提液冷却至45℃，pH值调整至6，加入纤维素酶和溶菌酶在40℃下搅拌酶解1.5小时；浸提液中，纤维素酶活力为58.8U/ml、溶菌酶活力为70.5U/ml；酶解后过滤得到的上清液为复合酶酶解液；
S3将复合酶酶解液按酶活力824.6U/ml加入木瓜蛋白酶，在温度40℃下搅拌酶解1.5小时后，酶解结束后，升温至100℃，保持2分钟进行灭酶处理，6000r/min下离心10min，得到的上清液为酶解提取液；
S4将所得到的酶解提取液减压浓缩后得到膏密度为1g/m3浸膏，向浸膏中加入浸膏体积3倍的质量分数为95％乙醇溶液进行醇沉12小时，反复2次，收集沉淀并用丙酮清洗2次，经冷冻喷雾干燥机中进行干燥，设置温度为-30℃，压力不高于0.05MPa，冷冻12小时，干燥后得到桦褐孔菌多糖。
本实施例将桦褐孔菌子实体通过离子液体水溶液加热浸提，以及纤维素酶和溶菌酶的复合酶酶解降解多糖，过滤去除大分子不溶性物质后，并通过木瓜蛋白酶降解蛋白至大分子多肽，并通过离心过滤掉大分子多肽后，得到纯度较高的桦褐孔菌多糖。桦褐孔菌多糖中多糖的含量为79.49％，得率为30.05％。
实施例4
桦褐孔菌多糖的提取方法，其步骤为：
S1取桦褐孔菌子实体在40℃的条件下减压烘干至水分含量为10％，得到干燥的桦褐孔菌子实体，将其粉碎后过100目筛后，加入石油醚回流脱脂两次，每次回流脱脂1小时，石油醚与桦褐孔菌粉的质量体积比为5:1，过滤得到残渣，烘干至水分含量为8％；
将烘干后的残渣按质量体积比为1∶50，加入质量分数为5％的1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯盐水溶液，加热至80℃浸提1小时，得到浸提液；
S2酶解：将所得到的浸提液冷却至45℃，pH值调整至6，加入纤维素酶和溶菌酶在40℃下搅拌酶解1.5小时；浸提液中，纤维素酶活力为58.8U/ml、溶菌酶活力为70.5U/ml；酶解后过滤得到的上清液为复合酶酶解液；
S3将复合酶酶解液按酶活力824.6U/ml加入木瓜蛋白酶，在温度40℃下搅拌酶解1.5小时后，酶解结束后，升温至100℃，保持2分钟进行灭酶处理，6000r/min下离心10min，得到的上清液为酶解提取液；
S4将所得到的酶解提取液减压浓缩后得到膏密度为1g/m3浸膏，向浸膏中加入浸膏体积3倍的质量分数为95％乙醇溶液进行醇沉12小时，反复2次，收集沉淀并用丙酮清洗2次，经冷冻喷雾干燥机中进行干燥，设置温度为-30℃，压力不高于0.05MPa，冷冻12小时，干燥后得到桦褐孔菌多糖。
本实施例将桦褐孔菌子实体依次通过石油醚回流脱脂通过离子液体水溶液加热浸提，以及纤维素酶和溶菌酶的复合酶酶解降解多糖，过滤去除大分子不溶性物质后，并通过木瓜蛋白酶降解蛋白至大分子多肽，并通过离心过滤掉大分子多肽后，得到纯度较高的桦褐孔菌多糖。桦褐孔菌多糖中多糖的含量为81.05％，得率为28.05％。
经过分析，本发明实施例1-4所得到的桦褐孔菌多糖中含有糖肽，还含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。
对比例1
桦褐孔菌多糖的提取方法，其步骤为：
其它同实施例4，不同点在于：S1取桦褐孔菌子实体在40℃的条件下减压烘干至水分含量为10％，得到干燥的桦褐孔菌子实体，将其粉碎后过100目筛后，加入石油醚回流脱脂两次，每次回流脱脂1小时，石油醚与桦褐孔菌粉的质量体积比为5:1，过滤得到残渣，烘干至水分含量为8％；将烘干后的残渣按质量体积比为1∶50，加入蒸馏水，加热至80℃浸提1小时，得到浸提液。
本对比例1中所得到的桦褐孔菌多糖中多糖的含量为75.78％，得率为20.13％。
实施例5
桦褐孔菌多糖的提取方法，其步骤为：
S1取桦褐孔菌子实体在40℃的条件下减压烘干至水分含量为10％，得到干燥的桦褐孔菌子实体，将其粉碎后过100目筛后，加入正乙烷回流脱脂两次，每次回流脱脂1小时，石油醚与桦褐孔菌粉的质量体积比为10:1，过滤得到残渣，烘干至水分含量为8％；
将烘干后的残渣按质量体积比为1∶70，加入质量分数为10％的质量比为1∶2的1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯盐和1-酰胺基-3-甲基咪唑氯盐的混合水溶液，加热至50℃浸提1.5小时，得到浸提液；
S2酶解：将所得到的浸提液pH值调整至5.5，加入纤维素酶和溶菌酶在48℃下搅拌酶解1小时；浸提液中，纤维素酶活力为58.8U/ml、溶菌酶活力为70.5U/ml；酶解后过滤得到的上清液为复合酶酶解液；
S3将复合酶酶解液调节pH值至4，按酶活力824.6U/ml加入木瓜蛋白酶，在温度35℃下搅拌酶解2小时后，酶解结束后，升温至100℃，保持3分钟进行灭酶处理，8000r/min下离心15min，得到的上清液为酶解提取液；
S4将所得到的酶解提取液减压浓缩后得到膏密度为1.5g/m3浸膏，向浸膏中加入浸膏体积3倍的质量分数为95％乙醇溶液进行醇沉，得到沉淀，沉淀经冷冻喷雾干燥机中进行干燥，设置温度为-30℃，压力不高于0.05MPa，冷冻时间不低于12小时，干燥后得到所述桦褐孔菌多糖。
本实施例得到的桦褐孔菌多糖中多糖的含量为77.18％，得率为26.13％。
实施例6
桦褐孔菌多糖的提取方法，其步骤为：
S1取桦褐孔菌子实体在40℃的条件下减压烘干至水分含量为10％，得到干燥的桦褐孔菌子实体，将其粉碎后过100目筛后，加入石油醚回流脱脂两次，每次回流脱脂1小时，石油醚与桦褐孔菌粉的质量体积比为5:1，过滤得到残渣，烘干至水分含量为8％；
将烘干后的残渣按质量体积比为1∶15，加入质量分数为7％的质量比为1∶1∶3的1-丁基-3-甲基咪唑乙酸盐、1-酰胺基-3-甲基咪唑氯盐、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐或1-丁基-3-甲基吡啶氯盐的混合水溶液，加热至100℃浸提2小时，得到浸提液；
S2酶解：将所得到的浸提液pH值调整至7，加入纤维素酶和溶菌酶在40℃下搅拌酶解2小时；浸提液中，纤维素酶活力为58.8U/ml、溶菌酶活力为70.5U/ml；酶解后过滤得到的上清液为复合酶酶解液，
S3将复合酶酶解液调节pH值至7，按酶活力824.6U/ml加入木瓜蛋白酶，按酶活力824.6U/ml加入木瓜蛋白酶，在温度50℃下搅拌酶解1小时后，酶解结束后，升温至100℃，保持1分钟进行灭酶处理，4000r/min下离心5min，得到的上清液为酶解提取液；
S4将所得到的酶解提取液减压浓缩后得到膏密度为1.3g/m3浸膏，向浸膏中加入浸膏体积3倍的质量分数为95％乙醇溶液进行醇沉，得到沉淀，沉淀经冷冻喷雾干燥机中进行干燥，设置温度为-30℃，压力不高于0.05MPa，冷冻时间不低于12小时，干燥后得到所述桦褐孔菌多糖。
本实施例得到的桦褐孔菌多糖中多糖的含量为75.36％，得率为23.89％。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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