具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明。

结合附图1-3，p54-H22细胞作为免疫原和p54-293T细胞作为检测原，所述的p54-H22细胞用的实验物为雌性Balb/c小鼠，所述的雌性Balb/c小鼠三免一周后采用IPMA方法测定，所述的雌性Balb/c小鼠血清效价可达1:25600，无菌操作取出效价较高雌性Balb/c小鼠的脾脏，研磨成单细胞后在聚乙二醇(PEG)的作用下与SP2/0细胞融合，融合后的细胞的培养基与p54-293T细胞做IPMA检测筛选阳性杂交瘤细胞株，经三次亚克隆后获得了10株能够稳定分泌抗ASFV p54蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，用p54-H22细胞的雌性Balb/c小鼠制备单抗，常用试剂包括RPMI-1640基础培养基、RPMI-1640完全培养基、HAT培养基、GNK洗液和细胞冻存液。

常用试剂配制的方法如下：

(1)RPMI-1640基础培养基：取10.4g培养基粉末，倒入800mL去离子水中，在磁力搅拌器上搅拌均匀后，再加入去离子水至终体积为1L，搅拌1h后加入2g NaHCO3，继续搅拌30min，调节pH至7.2-7.4，在超净台用0.22μm无菌滤头过滤，分装到灭菌容器内，4℃储存备用；

(2)RPMI-1640完全培养基：取10mL灭活的胎牛血清加入到90mL的RPMI-1640基础培养基中，搅拌均匀，4℃储存；

(3)HAT培养基：取98mL RPMI-1640完全培养基，加入2mL的HAT，搅拌均匀，4℃储存；

(4)GNK洗液：称取NaCl 4g，KCl 0.2g，葡萄糖1g，Na2HPO4·12H2O 1.78g，NaH2PO4·2H2O 0.39g，万分天平称取酚红0.005g，加入400mL去离子水中，在磁力搅拌器上搅拌均匀后，补加去离子水使终体积为500mL，调节pH至7.2，湿热灭菌后储存于4℃备用；

(5)细胞冻存液：取9mL血清，加入1mL DMSO，吹匀即可，现用现配。

制备方法步骤如下：

(1)对小鼠免疫测试；

(2)免疫过氧化物酶单层实验测小鼠血清效价；

(3)骨髓瘤细胞的培养；

(4)饲养细胞的制备；

(5)脾细胞的制备；

(6)细胞融合；

(7)杂交瘤细胞阳性孔的筛选；

(8)阳性杂交瘤细胞的亚克隆；

(9)阳性杂交瘤细胞株的培养和冻存；

(10)阳性杂交瘤细胞株的稳定性的测定；

(11)单克隆抗体的Western-blot鉴定；

(12)得出实验数据。

所述的雌性Balb/c小鼠为全细胞免疫6～8周龄。

所述的10株能够稳定分泌抗ASFV p54蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为3B3、4C2、4C6、4E3、5E6、5G11、8E6、10C2、16B11和21A2。

所述的抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体在制备非洲猪瘟病毒检测试剂或试剂盒中的应用。

本发明在具体实施时，制备方法的实施案例如下：

一、对小鼠免疫测试

(1)p54-H22细胞培养至生长状态良好后，细胞计数，取1×107个细胞，1000r/min离心10min，弃上清，10mL无菌PBS洗涤细胞一次，再用400μL无菌PBS缓冲液重悬，加入2μgAdjuvant，轻轻混匀；

(2)选择2只6～8周龄的健康雌性Balb/c小鼠，将处理好的细胞采用皮下多点注射法免疫小鼠，每只200μL(5×106个细胞)；

(3)每隔两周对小鼠免疫一次，共进行3次免疫，每次免疫的方法相同；

(4)第三次免疫一周后，对小鼠进行尾部采血，并用IPMA实验测定小鼠多抗血清效价；

(5)选择效价较高的小鼠进行加强免疫一次，加强免疫时，细胞处理方法同上，但是不加Adjuvant，通过腹腔注射的方法进行加强免疫。

二、免疫过氧化物酶单层实验测小鼠血清效价

(1)将pTrip-293T细胞培养在96孔板中，当细胞生长至汇合度达到70％左右时，弃去培养基，在室温下，用4％多聚甲醛固定细胞15min；

(2)弃去多聚甲醛，用含有0.3％TritonX-100的PBS缓冲液在室温下透化细胞1h；

(3)弃去透化液，小鼠血清用1×PBS进行稀释，加入96孔细胞培养板中，每孔50μL，首孔的稀释倍数为1:50，以后每孔做倍比稀释，直至第十二孔；阴性对照为未免疫小鼠血清，同样也进行倍比稀释，然后将96孔板放置37℃培养箱中温育1h；

(4)弃去小鼠血清，PBS洗板5次，将HRP-Goat anti Mouse IgG用PBS缓冲液以1:200稀释加入到细胞孔中，每孔100μg，37℃孵育1h；

(5)弃去HRP-Goat anti Mouse IgG，PBS缓冲液洗涤5次，用AEC显色试剂盒显色，具体使用方法为：在1mL去离子水中分别接入A液20μL、B液40μL、C液20μL，轻轻吹匀，每孔加显色液100μL，暗处显色10min后用倒置显微镜观察细胞显色情况。

三、骨髓瘤细胞的培养

(1)细胞复苏：取在液氮中冻存的SP2/0细胞，37℃水浴中1-2min，加入5mL1640完全培养基后，1000r/min离心10min，弃上清，细胞位于底部，轻轻打散后用5mL 1640完全培养基重悬，放入37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；

(2)细胞传代：观察培养瓶中的细胞密度，弃去原有培养基，加入新的1640完全培养基，用电动移液器沿瓶壁吹打，然后将细胞均匀分到两个细胞培养瓶中，将细胞放在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；

(3)融合当天，观察细胞状态，用GNK吹散细胞，1000r/min离心10min，弃去上清后再加入20mL GNK吹匀，进行细胞计数。

四、饲养细胞的制备

(1)细胞融合前24h，取一只健康状况良好的年轻昆明雌鼠，用颈椎脱臼法处死后放入75％酒精中表面消毒5min；

(2)将小鼠固定在消毒的解剖板上，放入超净工作台中，吸取100mL 4℃预冷的HAT培养基于一次性无菌培养皿中备用；

(3)用一套无菌的剪刀和镊子将小鼠的腹部表皮剪开(不要剪开腹膜)，露出腹膜，并用酒精棉球轻轻的擦拭小鼠腹腔；

(4)取一支20mL的注射器，吸取10mL左右冷的HAT培养基，用镊子将小鼠腹膜轻轻夹起，用针头刺穿腹膜(避开腹膜内部的脂肪层，防止堵塞针头)，缓慢地将培养基打入小鼠腹腔；

(5)用酒精棉轻揉小鼠腹部，然后吸出腹腔内的培养基并注入预先装有HAT培养基的一次性平皿中并混匀；

(6)将细胞悬液均匀加入到96孔细胞培养板中，每孔100μL，放入细胞培养箱中培养。

五、脾细胞的制备

(1)小鼠加强免疫3天后，摘取眼球，将血液滴入离心管内，在37℃静置2h，3000r/min离心10min，轻轻吸取上层血清，不要吸到血细胞，血清分装后储存在-20℃备用，将小鼠在75％酒精中浸泡消毒5min；

(2)将小鼠固定在解剖版上，放进超净工作台中。用GNK洗液润湿烧杯上的120目尼龙网纱布；

(3)用灭菌的镊子夹起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪开，不要剪开腹膜。然后换一套灭菌剪刀镊子，剪开腹膜并拉开，取出小鼠脾脏并剪去脾脏周围的脂肪，然后将脾脏放入GNK洗液浸湿的尼龙网上；

(4)用剪刀和镊子将小鼠脾脏缓慢磨碎，边磨边滴加GNK洗液，将磨碎的脾细胞经尼龙纱布过滤后冲入烧杯，并保持脾脏湿润；

(5)弃去尼龙网纱布，并将烧杯中的脾细胞悬液转移到一个50mL的无菌离心管中，1000r/min离心10min；

(6)弃去上清液，用手指轻轻打散细胞沉淀，然后向离心管中加入20mL GNK洗液重悬细胞沉淀，取少量细胞悬液计数，后将细胞悬液放置在细胞培养箱备用。

六、细胞融合

(1)取处于对数生长期的骨髓瘤细胞，弃去培养基，用电动移液器吸取5mL预热37℃的RPMI 1640完全培养基，将贴壁的骨髓瘤细胞轻轻吹下，将细胞悬液转移至无菌离心管中，1000r/min离心10min，弃上清，加入20mL GNK洗液重悬细胞并取少量细胞悬液计数；

(2)取瘤细胞和脾细胞，细胞数比例为1:8，加入到离心管中，轻轻吹匀，1000r/min离心10min，弃上清，轻轻打散细胞沉淀；

(3)将细胞沉淀在无菌环境下放入37℃水浴中，吸取1mL的PEG 1500，缓慢加入到细胞中，边加边摇晃离心管，90s内加完，加完后轻轻摇晃离心管约1min，使骨髓瘤细胞与脾细胞充分融合；

(4)在37℃水浴中，向融合的细胞中缓慢滴加15mL预热的GNK洗液，静置5min，再加入25mL的GNK洗液，混匀后1000r/min离心10min，弃上清，轻轻打散细胞沉淀，加10mL的HAT培养基重悬细胞沉淀；

(5)向无菌一次性平皿中加入90mL，37℃的HAT培养基，吸取离心管中的10mL细胞悬液与HAT培养基混匀后铺到96孔细胞培养板中，每孔100μL，将细胞放入细胞培养箱培养。

七、杂交瘤细胞阳性孔的筛选

细胞融合后的第5天向细胞培养板中补加新鲜的HAT培养基，50μL/孔；在细胞融合后8天左右，孔内融合细胞成较大细胞团，取细胞培养上清，用IPMA法筛选阳性孔。

八、阳性杂交瘤细胞的亚克隆

通过IPMA方法筛选出阳性杂交瘤细胞孔后，准备亚克隆前的一天，要准备好饲养层细胞，制备方法同3.2.3，唯一不同之处在于所HAT培养基更换为HT培养基。将IPMA阳性孔中的细胞轻轻吹匀，对活细胞进行准确计数，计数后根据结果计算出细胞悬液体积，加入到所需的HT培养基中，混匀后铺在96孔细胞培养板内，每孔100μL，分为3个细胞密度梯度(前四排的细胞密度为30个细胞/mL，中间四排的细胞密度为15个细胞/mL，后四排的细胞密度为7.5个细胞/mL)，将亚克隆的细胞培养板放置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。一周后在显微镜下观察细胞生长状态，并准确记录每个孔中细胞团的个数，待孔内细胞团较大时，收取亚克隆细胞孔的培养上清并用IPMA法筛选阳性克隆，方法同3.2.2。将获得的阳性孔中的杂交瘤细胞扩大培养至24孔板并继续亚克隆2～3次，以确保最终获得的杂交瘤细胞株既能稳定分泌单克隆抗体又是单克隆。

九、阳性杂交瘤细胞株的培养和冻存

(1)细胞扩大培养：将筛选的阳性单克隆杂交瘤细胞从96孔板用移液器轻轻吹下，吸到24孔板中，补加培养基至500μL。静置培养2～3天，待细胞汇合度达到80％，且细胞状态良好时将其转移至25cm2细胞培养瓶中培养；

(2)细胞冻存：用电动移液器将25cm2细胞培养瓶底的细胞吹下，将细胞悬液1000r/min离心10min，弃上清，打散沉淀后加入1mL冻存液并混匀，加入冻存管中，放在冻存盒缓慢降温，-80℃保存。

十、阳性杂交瘤细胞株的培养和冻存

(1)将杂交瘤细胞进行复苏；

(2)将复苏的细胞进行培养，待细胞长满一个25cm2细胞培养瓶时收集细胞培养上清液体，用IPMA法测培养上清液中抗体的效价，具体参考3.2.2，将筛选的阳性杂交瘤细胞反复冻融3次，如果每次上清效价变化不大，说明该细胞株可稳定分泌单克隆抗体。

十一、单克隆抗体的Western-blot鉴定

将p54-H22细胞和pLVX-H22细胞在25cm2细胞培养瓶中培养，当细胞生长状态良好时，用RIPA裂解液(强)裂解细胞，收集上清，用p54-H22细胞裂解上清作为抗原，制备的单抗上清作为一抗，进行Western-blot实验。

十二、实验结果

分离三免一周后小鼠抗血清，用IPMA法测其效价，结果如图1所示，小鼠的多抗血清IPMA效价达到1:25600。

细胞融合后用IPMA法筛选阳性克隆，经三次亚克隆后获得10株抗p54蛋白的杂交瘤细胞株，如图2所示，命名为3B3、4C2、4C6、4E3、5E6、5G11、8E6、10C2、16B11和21A2，NC:阴性对照，免疫前小鼠血清；PC：阳性对照，融合前小鼠血清。

Western-blot如图3所示，单克隆抗体4C2、4C6、4E3、5E6、5G11、10C2、16B11和21A2与p54-H22细胞裂解上清反应强烈，而不与pLVX-H22细胞裂解上清反应，表明这些单克隆抗体识别了p54蛋白的线性表位。而其余2个单克隆抗体可能与p54蛋白的构象表位结合。这2个Wb阴性的单克隆抗体未作进一步研究。

以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。