一种亚磺酰亚胺取代的吲唑类irak4激酶抑制剂、制备方法及用途
技术领域
本发明涉及生物医药
技术领域
，具体涉及一种芳(杂)亚磺酰亚胺取代的吲唑类IRAK4激酶抑制剂及其异构体、其药学上可接受的盐，及其制备方法及用途。背景技术
白细胞介素-1受体相关激酶4(IRAK-4)是细胞内丝氨酸-苏氨酸激酶IRAK家族的成员之一。激酶家族的其他成员还包括IRAK-1、IRAK-2和IRAK-M。IRAK-M仅在单核细胞和巨噬细胞中表达，IRAK-1、IRAK-2和IRAK4的表达普遍存在。IRAK4主要由N端保守的死亡结构区域(DD)、铰链区、C端的中央激酶结构域(KD)组成。DD区是IRAK4与接头蛋白髓样分化因子初次应答基因88(MyD88)相结合的区域。KD区由12个亚区域构成，具有典型的丝氨酸-苏氨酸激酶结构域特征。IRAK4的主要功能是通过KD区域将其底物磷酸化，进而激活下游信号分子。IRAK4是白细胞介素-1受体(IL-1R)/Toll样受体(TLR)介导的炎症信号转导通路下游的关键因子，在免疫系统中起关键作用(Sims JE,etal.NatRevImmunol,2010,10(2):89-102).。当白细胞介素-1受体(IL-1R)或者Toll样受体(TLR)与配体结合后，IRAK4能够介导信号传导，激活下游炎症因子的表达。TLR可以接受来自机体与微生物作用或者内源性物质刺激产生的配体信号，以及这些刺激引发的第一波炎症信号和先天免疫反应信号。TLR在许多疾病中，包括感染和自身炎症性疾病以及人类的许多其他疾病，起着非常重要的作用。像癌症坏死因子-α(TNF-α)和其他主要的细胞因子一样，白细胞介素-1(IL-1)是炎症介导通路中的关键因子，能够传播和放大信号。由于TLR、IL-1R和其他细胞因子受体介导的信号通路有着相互交联的作用，所以TLR和IL-1R炎症通路中游的关键信号因子—IRAK4，在全身炎症反应中作用重大，能够作为治疗各种炎症相关性疾病的一个有效潜在靶点。
检测发现，一部分人类患者缺乏IRAK4表达(Picard，C.et al，2003，Science 299：2076-2079)，从这些患者身上获得的细胞对所有的TLR(除TLR3外)激动剂和IL-1家族成员(包括IL-1β和IL-18)都没有响应(Ku，C.et al，2007，J.Exp.Med.204：2407-2422)。小鼠缺失IRAK4会导致IL-1、IL-18和所有TLR(除TLR3)依赖性的反应被严重阻断(Suzuki，N.etal，2002，Nature416：750-754)。相反，缺失IRAK1(Thomas，J.A.et al，1999，J.Immunol.163：978-984；Swantek，J.L.et al，2000，J.Immunol.164：4301-4306)或IRAK2(Wan，Y.et al，2009，J.Biol.Chem.284：10367-10375)仅导致信号传导部分受阻。而且，IRAK4是IRAK家族中唯一的已证明其激酶活性对于启动信号传导是必需的家族成员。将小鼠基因组中的野生型IRAK4替换为激酶活性失活的突变体(KDKI)，能阻断一切由MyD88依赖性的受体，包括IL-1、IL-18和所有T L R(除T L R 3外)所传导的信号(Koziczak-Holbro，M.etal，2007，J.Biol.Chem.282：13552-13560；Kawagoe，T.et al，2007，J.Exp.Med.204：1013-1024)。
和野生型小鼠相比，拥有IRAK4激酶活性失活的突变体(KDKI)的小鼠在多发性硬化症(Staschke，K.A.et al，2009，J.Immunol.183：568-577)、类风湿性关节炎(Koziczak-Holbro，M.et al，2009，Arthritis Rheum.60：1661-1671)、动脉粥样硬化(Kim，T.W.et al，2011，J.Immunol.186：2871–2880)和心肌梗死(Maekawa，Y.et al，2009，Circulation120：1401-1414)的疾病模型上，表现出疾病严重程度的大幅降低。如上所述，IRAK4抑制剂能阻断所有MyD88依赖性的信号传导。MyD88依赖性的TLRs已经被证明是导致以下病症的原因：多发性硬化症、类风湿性关节炎、心血管疾病、代谢综合症、脓血症、系统性红斑狼疮、炎症性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、自身免疫性葡萄膜炎、哮喘、过敏、I型糖尿病和器官移植后的排斥反应(Keogh，B.et al，2011，Trends Pharmacol.Sci.32：435-442；Mann，D.L.2011，Circ.Res.108：1133-1145；Goldstein，D.R.et al，2005，J.Heart LungTranspl.24：1721-1729；and Cario，E.，2010，Inflamm.Bowel Dis.16：1583-1597)。在弥漫性大B细胞淋巴瘤中，拥有致癌性MyD88突变的肿瘤细胞已经被确定对IRAK4抑制敏感(Ngo，V.et al，2011，Nature 470：115-121)。全基因组测序也确认了MyD88突变与慢性淋巴性白血病有关，表明IRAK4抑制剂用在治疗白血病方面的可能性(Puente，X.S.et al，2011，Nature 475：101-105)。
IRAK4抑制剂同样能阻断IL-1与IL-1家族所传导的信号。对IL-1的调控已被证明对多种疾病有效，包括痛风、痛风性关节炎、II型糖尿病、自身炎症性疾病、肿瘤坏死因子受体相关周期性综合征、家族性地中海热、成人斯蒂尔病、全身发作幼年特发性关节炎、中风、移植物抗宿主病、无症候性多发性骨髓瘤、复发性心包炎、骨关节炎和肺气肿等(Dinarello，C.A.，2011，Eur.J.Immunol.41：1 203-1217；and Couillin，I.et al，2009.J.Immunol.183：8195-8202)。在阿尔茨海默氏病的小鼠模型中，阻断IL-1受体改善了认知缺陷，降低了Tau蛋白病变和减少了β淀粉样蛋白的寡聚形式(Kitazawa，M.et al，2011，J.Immunol.187：6539-6549)。IL-1也被证明是获得性免疫中的一个关键联接，能驱动效应T细胞亚群Th17的分化(Chung，Y.et al，2009，Immunity 30：576-587)。因此，IRAK4抑制剂被预测在Th17细胞相关的疾病中能展现出效果，这些疾病包括多发性硬化症、牛皮癣、炎症性肠病、自身免疫性眼色素层炎和类风湿性关节炎等(Wilke，C.M.et al，2011，TrendsImmunol.32：603-611)。
肺部病症如肺纤维化、阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性肺损伤(ALI)、间质性肺病(ILD)、结节病和肺动脉高压也显示与各种TLR介导的信号传导途径相关。肺部病症的发病机理可能为感染介导的或非感染介导的过程(Jeyaseelan，Chu等人，Infection and Immunity，2005；Seki，Tasaka等人，Inflammation Research，2010；Nadigel，Prefontaine等人，Respiratory Research，2011；Kovach and Standiford，International Immunopharmacology，2011；Bauer，Shapiro等人，Mol Med，2012；Deng，Yang等人，PLoS One，2013；Freeman，Martinez等人，Respiratory Research，2013；Dubaniewicz，A.，Human Imm unolog y，201 3)。TLR以及IL-1R家族成员还参与其他炎症性病症如贝切特氏病、痛风、红斑狼疮、成人斯蒂尔氏病和慢性炎性肠病如溃疡性结肠炎和克罗恩氏病(Crohn’s disease)以及移植排斥的发病机理，因此，IRAK4抑制剂适合治疗此类疾病(Nickerson，Christensen等人，The Journal of Immunology，2010；Kobori，Yagi等人，J Gastroenterol，2010；Shi，Mucsi等人，Immunological Reviews，2010；Chen，Lin等人，Arthritis Res Ther，2013；Ha o，Liu等人，Curr O pin Gastroenterol，2013；Kreisela nd Gold stein，Transplant International，2013；Li，Wang等人，Pharmacology&Therapeutics，2013；Zh u，J ia ng等人，Autoimmunity，2013；Yap and Lai，Nephrology，2013)。IRAK4抑制剂还适于TLR和IL-1R家族介导的病症子宫内膜异位症和动脉粥样硬化的预防性和/或治疗性用途(Akoum，Lawson等人，Human Reproduction，2007；Allhorn，Boing等人，Reproductive Biology and Endocrinology，2008；Lawson，Bourcier等人，Journalof Reproductive Immunology，2008；Seneviratne，Sivagurunathan等人，ClinicaChimica Acta，2012；Khan，Kitajima等人，Journal of Obstetrics and GynaecologyResearch，2013；Santulli，Borghese等人，Human Reproduction，2013；Sedimbi，Hagglof等人，Cell Mol Life Sci，2013)。
除了已经提及的病症外，在眼部病症的发病机理中也记载了IRAK4介导的TLR过程，所述眼部病症如视网膜缺血、角膜炎、变应性结膜炎、干燥性角结膜炎、黄斑变性和葡萄膜炎(Kaa rnira nta a nd Sa lminen，J Mol Med(Berl)，2009；Sun and Pearlman，Investigative Ophthalmology&Visual Science，2009；Redfern and McDermott，Experimental Eye Research，2010；Kezic，Taylor等人，J Leukoc Biol，2011；Chang，McCluskey等人，Clinical&Experimental Ophthalmology，2012；Guo，Gao等人，ImmunolCell Biol，2012；Lee，Hattori等人，Investigative Ophthalmology&Visual Science，2012；Qi，Zhao等人，Investigative Ophthalmology&Visual Science，2014)。
现有技术公开了许多IRAK4抑制剂(参见，例如，Annual Reports in MedicinalChemistry(2014)，49，117-133；Progress in Medicinal Chemistry，2017；56:117-163)。
吲唑骨架的IRAK4抑制剂得到了广泛研究，并也已证明为IRAK4抑制剂有效结构类型之一。其中BAY-1834845和BAY-1830839均处于I期临床研究阶段。现有文献也公布了一系列吲唑类结构的IRAK4抑制剂，如：WO2007091107A1、WO2011153588A1、WO2013106254A1、WO2015091426A1、WO2015193846A1、WO201510466A1、WO2016083433A1、WO2016174183A1、WO2017009798A1、WO2017108744A1、WO2017157792A1、WO2017207385A1、WO2017207386A1、WO2017148902A1、WO2017207481A1、WO2018060174A1、WO2018178947A1、CN110835332A、WO2019089580A1、WO2020035019A1、WO2020048471A1。另外还有类似的非吲唑结构IRAK4抑制剂文献报道：WO2020035020A1、CN109890829A、CN110770229A、CN110785418A、CN111094292A、CN110835338A、WO2017207340A1、WO2018234345A1。
尽管关于IRAK4抑制剂类早期临床已有公开报道，然而目前还没有针对该靶点的药物上市，而进入临床阶段的只有PF-06650833、BAY-1834845、BAY-1830839、R835和CA-4948。
处于临床I期阶段的BAY-1830839、BAY-1834845正是吲唑类IRAK4抑制剂。
专利文献CN111362920A公开了一类烷基亚磺酰亚胺吲唑类化合物，代表化合物有：
申请人通过系统科学实验研究发现，上述吲唑类IRAK4抑制剂尚存在一定缺陷，具有较大提升空间。主要缺陷为：IRAK4抑制活性不高、动物安全性风险、药代动力学及生物利用度低等问题。
现有技术中公开的化合物以及试验药物在有效性、安全性、药代动力学等方面仍不能令人满意，仍有必要继续研究和开发新的IRAK4抑制剂，以满足人们日益增长的医疗和健康需要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种具有优异的IRAK4抑制活性、动物安全性和药代动力学参数的亚磺酰亚胺取代的吲唑类IRAK4激酶抑制剂。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种亚磺酰亚胺取代的吲唑类化合物、或其异构体、药学上可接受的盐，其结构如式I所示：
其中，
A选自
R1选自氢、氰基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷基羟基、C1-C6烷氧基或C3-C8环烷基；
或R1为吗啉基或四氢吡咯基，或被一个或多个羟基或C1-C6烷基取代的吗啉基或四氢吡咯基；
R2选自氢、C1-C6烷基、C3-C8环烷基；所述C1-C6烷基、C3-C8环烷基上可被一个或多个卤素取代；
Ar选自芳基或杂芳基，任选的被一个或多个R5基团取代；
R5选自氢、氰基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基；
R6选自氢、卤素或C1-C6烷基。
优选的，
A选自
R1选自氢、氰基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或C3-C8环烷基；
或R1为:
R2选自氢、C1-C6烷基、C3-C8环烷基；
R3和R4总是具有相同的定义，均选自氢或C1-C6烷基；
Ar选自被一个或多个R5基团取代的苯环、吡啶环、嘧啶环、喹啉环、喹唑啉环、噻吩环、噻唑环或噁唑环；除上述列举的芳环外，Ar还可以选择其他常见的芳环结构。
R5选自氢、氰基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基；
R6选自氢或C1-C6烷基。
进一步优选的，
A选自
R1选自氢、氰基、卤素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基或C3-C8环烷基；
或R1为:
R2选自氢、C1-C3烷基、C3-C8环烷基；
R3和R4总是具有相同的定义，均选自氢或C1-C3烷基；
Ar选自被一个、两个或三个R5基团取代的苯环、吡啶环、嘧啶环、喹啉环、喹唑啉环、噻吩环、噻唑环或噁唑环；
R5选自氢、氰基、卤素或C1-C3烷基；
R6选自氢或C1-C3烷基。
本申请所述的“C1-C3的烷基”是指甲基、乙基、正丙基或异丙基；所述的“C1-C3的烷氧基”是指甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基；所述“卤素”是指F、Cl、Br、I；所述“C3-C8环烷基”是指环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基。
本发明的典型化合物包括，但不限于以下表1化合物：
表2
本发明的第二目的在于提供了上述化合物的合成方法：
(1)化合物IA与IB经缩合反应制得IC；
(2)化合物IC与侧链ID反应制得终产物I。
反应步骤中各基团的定义如前文所述。
在本发明的第三方面提供了一种式(I)化合物、或其异构体、药学上可接受的盐的用途，其用于制备抑制蛋白质激酶的药物。
在一些实施方案中，蛋白质激酶是IRAK家族激酶，尤其是IRAK4激酶。
在本发明的另一方面，提供了式(I)化合物、或其异构体、药学上可接受的盐的用途，其用于制备治疗由蛋白质激酶引起的疾病的药物。
在一些实施方案中，本发明化合物或组合物可用于治疗由IRAK家族激酶，尤其是IRAK4激酶而引起的自身免疫性疾病；炎症疾病；疼痛病；呼吸道，气道和肺疾病；肺炎症和损伤；肺动脉高压；胃肠道疾病；过敏性疾病；感染疾病；创伤和组织损伤疾病；纤维化疾病；眼疾病；关节，肌肉和骨疾病；皮肤疾病；肾脏疾病；造血系统疾病；肝脏疾病；口腔疾病；代谢疾病，心脏疾病；血管疾病；神经炎性疾病；神经变性疾病；脓毒症；基因疾病。
在一些实施方案中，本发明所述的自身免疫性疾病和炎症疾病选自：系统性红斑狼疮(SLE)，狼疮性肾炎，关节炎，牛皮癣，结肠炎，克罗恩氏病，特应性皮炎，肝纤维化，骨髓纤维化，血小板增多症，红细胞增多症，老年痴呆症，痛风，蛋白相关的周期性综合征(CAPS)，慢性肾脏病或急性肾脏损伤，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，哮喘，支气管痉挛，和移植物抗宿主病。
在一些实施方案中，本发明化合物或组合物可用于治疗由IRAK家族激酶，尤其是IRAK4激酶而引起的细胞异常增殖的疾病，尤其是癌症。
在一些实施方案中，本发明所述的癌症包括乳癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，支气管肺泡癌，前列腺癌，胆小管癌，骨癌，膀胱癌，头颈癌，肾癌，肝癌，胃肠组织癌，食道癌，卵巢癌，胰腺癌，皮肤癌，睾丸癌，甲状腺癌，子宫癌，子宫颈和阴道癌，白血病，多发性骨髓瘤和淋巴瘤。
本发明的衍生物在实施疾病治疗过程中，可以组合物的形成通过口服、注射等方式，用于治疗相关癌症及其他疾病。用于口服时，可将其制备成常规的固体制剂如片剂、粉剂或胶囊等；用于注射时，可将其制备成注射液。
在本发明的第三方面提供了一种组合物，所述组合物包括治疗有效量的上述新型芳(杂)亚磺酰亚胺取代的吲唑类化合物、或其异构体、药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
药学上可接受的盐，例如，与无机酸形成的盐、与有机酸形成的盐。与无机酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等形成的盐。与有机酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、苹果酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲基苯磺酸等形成的盐。
所述及的载体是指药学领域常规的载体，如：稀释剂、赋形剂如水等；粘合剂如纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂如淀粉等；崩裂剂如碳酸钙、碳酸氢钠；另外，还可以在组合物中加入其他辅助剂如香味剂和甜味剂。
本发明的组合物的各种剂型可以采用医学领域常规的方法进行制备，其中活性成分的含量为0.1％～99.5％(重量比)。
本发明的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等进行变化，其日剂量为0.001-30mg/kg体重(口服)或0.005-30mg/kg体重(注射)。
本发明中的化合物与现有吲唑类IRAK4抑制剂(如BAY-1834845、BAY-1830839)、专利文件CN111362920A中MY-004-102、MY-004-103相比，除IRAK4活性更优特点外，本申请化合物与现有技术相比还具有如下优势：1)芳(杂)亚磺酰亚胺结构替代现有技术取代基获得了意想不到的降低hERG抑制风险的效果；2)本发明化合物初步安全性优于现有吲唑类IRAK4抑制剂；3)动物体内实验数据显示，同等剂量下，本发明化合物药代参数AUC、Cmax明显高于现有吲唑类IRAK4抑制剂。可见本发明化合物具有更优的PK性质，由此可以合理推测，本发明化合物应用于临床，有效剂量将会更低，用药安全性更高。
本发明中化合物的中文命名与结构式有冲突的，以结构式为准；结构式有明显错误的除外。
与现有技术相比，本发明提供的新型芳(杂)亚磺酰亚胺取代的吲唑类化合物、及其药学上可接受的盐具有更好的IRAK4抑制活性，更优的安全性，且本发明的优选化合物表现出良好的药代动力学性质，具有开发成为选择性IRAK4抑制剂的潜力。
具体实施方式
实施例1:I-1的合成
合成路线：
操作步骤：
步骤1：
化合物IA-1(1.63g,0.01mol)、IB-1(1.91g,0.01mol)、加入二氯甲烷(DCM，30mL)中，再加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，1.94g,0.015mol)、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)(2.3g,0.015mol),反应体系30℃搅拌反应12h。反应混合物经水(20mL)萃取，有机层减压浓缩至干，加无水乙醇(10mL)重结晶，制得淡黄色固体IC-1(2.67g,收率79.5％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝13.10(br,1H),11.55(br,1H),8.35(d,J＝8.0Hz,1H),8.14(m,1H),7.98(d,J＝8.0Hz,1H),7.72(s,1H),7.47(s,1H),7.04(s,1H),3.92(s,3H)。LCMS:MS Calcd.:336.3,MS Found:337.2[M+1]。
步骤2：
化合物IC-1(400mg,1.2mmol)、ID-1(327mg,1.32mmol)、K2CO3(332mg,2.4mmol)、KI(17mg,0.1mmol)加入DMF(10mL)中，N2气保护下，加热至内温100℃，搅拌反应24h。反应完成后降温至室温，减压浓缩溶剂至干，剩余物过硅胶柱(洗脱剂乙酸乙酯/石油醚:1/2)，收集产物流份，浓缩至干得产物I-1(210mg,收率35％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝11.53(br,1H),10.45(br,1H),8.36(d,J＝8.0Hz,1H),8.12(m,2H),8.02(s,1H),7.71(d,J＝8.0Hz,1H),7.51(m,5H),7.32(s,1H),4.11(t,J＝4.8Hz,2H),3.86(s,3H)，3.04(t,J＝4.8Hz,2H)。LCMS:MS Calcd.:503.5,MS Found:504.2[M+1]。
化合物I-2～I-36制备按实施例1化合物I-1方案进行，化合物有关数据见表2。
表3
生物测试
测试例1、IRAK4激酶活性测试
用迁移率变动检测法(MSA)，检测化合物对IRAK4激酶在Km ATP下的抑制活性(IC50)，设置10个药物浓度梯度(起始浓度1μM，3倍稀释，每个浓度2个复孔)，在激酶基础缓冲溶液中加入IRAK4激酶转移至测试板，再加入FAM标记的肽段和ATP(37μM)，28℃孵化一段时间后，加入10μL终止缓冲液终止反应，用Caliper读取转化率数据，再把转化率转化成抑制率数据。根据各浓度的抑制率数据，采用Logit法计算半数抑制浓度的IC50(表3)。
表3、化合物IRAK4激酶活性实验测试结果
注：以上对照品、本发明化合物均为同一实验条件实测值。
结论：本发明化合物对IRAK4激酶活性明显优于对比化合物BAY-1834845、BAY-1830839、MY-004-102和MY-004-103。
测试例2、化合物抑制THP-1细胞中TNF-α分泌能力
借助于该测试，其可适于测试化合物抑制THP-1细胞(人单核细胞急性白血病细胞系)中TNF-α(肿瘤坏死因子α)分泌的能力。TNF-α为参与所列自身免疫疾病的炎性过程的关键细胞因子，所述自身免疫疾病如类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病、克罗恩病、溃疡性结肠炎等。在该测试中，TNF-α分泌通过与细菌脂多糖(LPS)的温育而触发。
向96孔板中每孔加入含有10000个THP-1细胞的150μL RPMI-1640培养基溶液，然后加入含有8倍最终浓度的25μL测试化合物(从10μM开始，3倍稀释，9个浓度，每个浓度含4％DMSO的RPMI-1640培养基)溶液，混合均匀后，在37℃孵育30分钟。向每个测试孔中加入25μL含有LPS的RPMI-1640培养基溶液(最终LPS的浓度是1μg/mL，最终DMSO浓度是0.5％)，混匀，在37℃下孵育4.5小时。96孔板在2000rpm旋转5分钟，然后取50μL上清液，用人的ELISA试剂盒测定上清液中的TNF-α含量，经XL-Fit计算得化合物的IC50值(表4)。
表4、本发明化合物在THP-1细胞中抑制LPS刺激的TNF-α分泌的活性
注：以上对照品、本发明化合物均为同一实验条件实测值。
结论：本发明化合物能在THP-1细胞中有效地抑制LPS刺激的TNF-α分泌，且抑制效果明显优于对比化合物BAY-1834845、BAY-1830839、MY-004-102和MY-004-103。
测试例3、本发明化合物药代动力学测试
以SD大鼠为受试动物，采用LC/MS/MS法测定大鼠灌胃给予BAY-1834845、BAY-1830839、MY-004-102、MY-004-103和本发明优选实施例化合物后，测定其不同时刻血浆中的药物浓度，研究本发明化合物在大鼠体内药代动力学特征。
SD大鼠来源：上海斯莱克实验动物有限公司
给药方式:单次灌胃给药
给药剂量及浓度：10mg/kg；2mg/mL
制剂处方：0.5％methylcellulose
取样点：5min，15min，30min，1h，2h，4h，8h，24h.
标准曲线和质控样本配制处理：取适量储备液用50％乙腈水稀释成0.04、0.10、0.20、0.40、1.00、2.00、4.00μg/mL的标准工作液，0.10、1.00、3.00μg/mL的质控工作液。分别取47.5μL空白大鼠血浆中加入2.50μL的标准曲线工作液和质控工作液，配置成含待测物浓度为2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00ng/mL的标曲和浓度为5.00、50.00和150.00ng/mL的质控样本，分别加入200μL的乙腈(含内标氯雷他定5ng/mL)，涡旋振荡3min后，15000rpm，4℃离心15min，取上清液100μL进行LC-MS/MS分析。采用8.0计算实验结果。
本发明优选化合物药代动力学参数如表5所示。
表5：优选化合物药代动力学参数
结论：本发明实施例化合物表现出良好的药代动力学性质，与BAY-1834845、BAY-1830839、MY-004-102和MY-004-103相比，具有明显的药代动力学优势。
测试例4、本发明化合物急性毒性试验
选取本发明所述的化合物(I-1、I-2、I-5、I-7、I-7、I-10、I-16、I-21、I-24、I-26、I-29、I-31、I-34)，以及MY-004-102、BAY-1830839(阳性对照药)进行急性毒性实验。
(1)实验方案
①、观察其口服给予ICR小鼠MY-004-102、BAY-1830839、本发明所述I-1等化合物后动物出现的毒性征状和死亡情况，比较其急性毒性。
②、溶媒配制：称取适量甲基纤维素钠(MC)，用超纯水溶解定体积，配制成0.5％MC(w/v)。
③、给药制剂：分别称取所需的供试品，用0.5％MC溶液配制成浓度为12.5、37.5、75.0和100.0mg/mL混悬液。
④、给药途径：供试品及溶媒对照组(0.5％MC)的给药途径均为经口服给予。
⑤、给药频率：单次给药，给药前均隔夜禁食。
一般征状观察：给药当天于第一次给药后约0.5、1、2、4、6小时分别观察1次；观察期第2～6天，每天观察2次，上、下午各1次。
观察内容包括但不限制于：一般状况、行为活动、步态姿势、眼、口、鼻、胃肠道、皮肤被毛、泌尿生殖道。
(2)统计分析
体重数据以均数±标准差表示，并采用组间比较采用Levene`s检验和单因素方差分析，如果显示有差异，再采用Dunnet t检验。
(3)实验结果
选取本发明所述I-1等化合物，以及MY-004-102、BAY-1830839(阳性对照药)如上述进行急性毒性实验。实验结果见表6。
MTD试验中，考察动物对药物的耐受情况，给药剂量达到动物频临死亡时，即是最大耐受量。
表6：I-1等化合物及MY-004-102、BAY-1830839单次口服给药急性毒性实验结果
受试物
MTD(mg/kg)
MY-004-102
750
BAY-1830839
750
I-1
＞2000
I-2
＞2000
I-5
＞2000
I-7
＞2000
I-10
＞2000
I-16
＞2000
I-21
＞2000
I-24
＞2000
I-26
＞2000
I-29
＞2000
I-31
＞2000
I-34
＞2000
注：MTD：最大耐受量。
结果表明：上述选取的本发明所述I-1等化合物MTD(最大耐受量)均大于2000mg/kg，急性毒性远远低于MY-004-102、BAY-1830839。
测试例5、本发明化合物对hERG钾离子通道的影响
快速激活人延迟整流外向钾电流(IKr)主要由hERG离子通道介导，参与人类心肌细胞复极化。药物阻断这一电流将导致临床上出现QT间期延长综合征，易诱发急性心律失常甚至猝死。本研究应用手动膜片钳的方法在转染hERG钾通道的稳定细胞株上测试I-1等化合物对hERG钾电流的作用，从而确定I-1等化合物是否对hERG离子通道具有抑制作用。
待测化合物最终浓度为5、50和500μM，细胞外液中DMSO最终浓度为0.3％。待测化合物对hERG电流的抑制作用见表6。
表6：I-1等化合物及MY-004-102、BAY-1830839对hERG钾离子通道的影响
在本实验条件下，本发明I-1等化合物在500μM时对hERG钾通道电流的平均抑制率<50％(N＝3)，故本发明I-1等化合物对hERG电流抑制作用的IC50值大于500μM。对比化合物MY-004-102、BAY-1830839在50μM时对hERG钾通道电流的平均抑制率>50％(N＝3)，推测MY-004-102、BAY-1830839对hERG电流抑制作用的IC50值50μM左右。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
