一种吡啶酮粉蝶霉素及其制备方法和在制备抗癌药物中的应用
技术领域
：本发明属于天然产物领域，具体涉及一种吡啶酮粉蝶霉素及其制备方法和在制备抗癌药物中的应用。
背景技术
：恶性肿瘤已经成为我国居民首要死因，中国恶性肿瘤死亡率近20年来不断呈现上升趋势，处于世界恶性肿瘤死亡率的前列。据我国卫生部统计，中国每年新增肿瘤病人约200万人，目前全国肿瘤患者总数约为450万人。药物治疗在恶性肿瘤的疗法中占有相当重要的地位，发展速度最快。对于恶性肿瘤的治疗，天然产物及其衍生物药物发挥着重要作用。据报道，1981年到2008年间，天然产物来源的抗肿瘤药物占上市抗肿瘤药物的60％以上，而且，新型天然产物及其衍生物作为新的抗肿瘤药物所占数量还在不断增加。
白血病亦称作血癌，是一种造血系统的恶性肿瘤。白血病病人过分生产不成熟的白细胞，妨害骨髓的其他工作，这使得骨髓生产其它血细胞的功能降低。白血病可以扩散到淋巴结、脾、肝、中枢神经系统和其它器官。白血病居年轻人恶性疾病中的首位。白血病治疗主要有化学治疗、放射治疗、标靶治疗。部分高危险性病人，需要进行骨髓移植。化疗为目前为主要治疗手段，但其副作用大，临床易复发，而且费用较高。因此研发新型抗白血病药物一直是抗肿瘤药物研发领域的重要方向。
粉蝶霉素(piericidin)类化合物是微生物来源的α-吡啶酮/羟基吡啶类抗生素，不仅有杀虫、抗菌等活性，而且对部分肿瘤细胞也有抑制活性，近年来发现其中粉蝶霉素类化合物具有抗肾癌潜力。粉蝶霉素类天然产物大多数是以羟基吡啶的形式存在，吡啶酮形式的粉蝶霉素类自然界较少，药用潜力有待深入挖掘。
发明内容
本发明的第一个目的是提供微生物来源的式(I)所示的吡啶酮粉蝶霉素化合物piericidin N，或其药用盐。
本发明人通过对一株红树林底泥来源的链霉菌Streptomyces sp.HBERC-58855(保藏编号为CCTCC NO:M 2017186)进行放大发酵和提取纯化，获得一个未见报道的结构新颖的粉蝶霉素化合物piericidin N，经核磁共振、质谱等波谱数据鉴定结构(图1)。化合物piericidin N为自然界少见的吡啶酮形式的粉蝶霉素类，与常见的羟基吡啶形式的粉蝶霉素类，在药用活性的具有显著差异。
通过对多种癌细胞的体外活性筛选实验，发现piericidinN显示出与羟基吡啶粉蝶霉素类不同的抗癌活性，对人早幼粒白血病细胞HL-60具有强的选择性抑制活性，半数抑制率IC50分别为0.08μM。该化合物在0.1μM浓度下可HL-60细胞周期S期受阻，并诱导细胞凋亡。本发明发现了自然界少见的吡啶酮粉蝶霉素类的抗肿瘤活性与常见的羟基吡啶粉蝶霉素有明显的差异，首次发现了吡啶酮粉蝶霉素类在抗白血病中的应用潜力。因此，吡啶酮粉蝶霉素piericidin N可以做为抗白血病药物开发的先导化合物。
因此本发明的第二个目的是提供所述的化合物piericidin N，或其药用盐在制备抗白血病药物中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种抗白血病药物，其特征在于，包括有效量的作为活性成份的化合物piericidinN，或其药用盐，和药学上可以接受的载体。
本发明的第四个目的是提供所述的化合物piericidin N的制备方法，是从链霉菌Streptomyces sp.HBERC-58855的发酵培养物中分离制备得到piericidin N。
优选，所述的制备方法，包括以下步骤：
将链霉菌Streptomyces sp.HBERC-58855的发酵培养物用乙酸乙酯萃取，萃取物浓缩后得到提取物，提取物经硅胶柱层析，顺序用石油醚、石油醚：二氯甲烷1：1v/v、二氯甲烷洗脱，收集二氯甲烷洗脱的馏分S3，S3经制备HPLC纯化得到化合物piericidin N。
所述的链霉菌Streptomyces sp.HBERC-58855的发酵培养物是将链霉菌Streptomyces sp.HBERC-58855接种于罐体发酵培养基中发酵培养，收取发酵液，即为发酵培养物，所述的罐体发酵培养基每升含有葡萄糖10g，可溶性淀粉10g，棉籽粉25g，酵母提取物3g，碳酸钙5g，氯化钠2g，余量为去离子水。
本发明的第五个目的是提供链霉菌Streptomyces sp.HBERC-58855在制备所述的化合物piericidin N中的应用。
本发明的吡啶酮粉蝶霉素类化合物piericidin N是未经报道的新化合物。本发明揭示piericidin N对人早幼粒白血病细胞HL-60具有明显的选择性抑制活性，这类吡啶酮粉蝶霉素可以用于制备特异性的抗白血病药物。因此本发明为开发新的抗白血病药物提供了备选化合物，对开发我国微生物药物资源具有重要的意义。
本发明涉及的链霉菌Streptomyces sp.HBERC-58855，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2017年4月20日，保藏编号为CCTCC NO:M 2017186(该保藏信息公开于专利申请CN201710344174.3中)。
附图说明
图1是化合物piericidinN的重要二维核磁相关信息(HMBC，COSY和NOESY)图
图2是化合物piericidinN对人早幼粒白血病HL-60细胞的细胞周期作用。
图3是化合物piericidinN对人早幼粒白血病HL-60细胞的细胞凋亡作用。
具体实施方式
下面通过具体实施例和具体实验对本发明所述应用做进一步说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1：吡啶酮粉蝶霉素piericidinN的制备
1、Streptomyces sp.HBERC-58855的固体培养
链霉菌Streptomyces sp.HBERC-58855(保藏编号为CCTCC NO:M 2017186)是从红树林底泥分离得到，该菌种保存于ISP-2培养基斜面，ISP-2培养基组成为：每升含有酵母提取粉4g，葡萄糖4g，麦芽提取粉10g，粗海盐30g，琼脂粉20g，余量为水，pH 7.2-7.4；制备方法为将上述各组分混合，121℃灭菌，分装备用。
2、Streptomyces sp.HBERC-58855的放大发酵
取少量Streptomyces sp.HBERC-58855斜面菌种进行种子发酵培养，种子发酵培养基：每升含有甘露醇20g，大豆蛋白胨10g，豆油2.5g，磷酸氢二钾0.35g，余量为去离子水，pH7.0，制备方法是将各成分混合均匀，121℃灭菌备用。用500毫升三角瓶装100毫升种子发酵培养基，接种培养条件为：28℃，120转/min。培养96h后，进行扩大培养，培养体积扩大到3L，培养基和培养条件不变。培养48h后，进行罐体发酵，发酵体积为30L，罐体发酵培养基：每升含有葡萄糖10g，可溶性淀粉10g，棉籽粉25g，酵母提取物3g，碳酸钙5g，氯化钠2g，余量为去离子水，pH7.0，制备方法是将各成分混合均匀，灭菌备用；28℃，培养120h后，收取发酵液，用乙酸乙酯萃取，萃取物经浓缩后得到Streptomyces sp.HBERC-58855菌株发酵物的干燥提取物。
3、提取分离
Streptomyces sp.HBERC-58855菌株发酵物的干燥提取物用少量甲醇溶解后硅胶拌样，进行中压硅胶柱层析(200-300目)，用石油醚、石油醚：二氯甲烷1：1v/v、二氯甲烷、二氯甲烷：甲醇100：1v/v、二氯甲烷：甲醇100：2v/v、二氯甲烷：甲醇100：3v/v、二氯甲烷：甲醇100：4v/v、二氯甲烷：甲醇100：5v/v、甲醇顺序洗脱得到9个洗脱部位S1-S9。S3部位(二氯甲烷洗脱馏分)经制备HPLC(Hitachi-L2130液相色谱仪,Hitachi L-2455DAD检测器,Phenomenex ODS色谱柱,250mm×10.0mm i.d.,5μm,流动相：甲醇:水80:20v/v洗脱；流速2ml/min；柱温40℃)进行反复分离纯化，得到纯化的化合物piericidin N(Rt 32min,2.5mg)。
实施例2：吡啶酮粉蝶霉素piericidinN的结构鉴定
对化合物piericidinN进行结构分析测试，得到以下理化性质数据：
Piericidin N：淡黄色油状物；UV(MeOH)λmax(logε)211(3.20),223(3.28),227(3.25),238(3.30)nm；CD(0.33mg/ml,MeOH)λmax(Δε)211(1.04),239(-1.37),254(0.21)nm；1H和13C NMR数据见表1；HRESIMS m/z 386.2696,[M+H]+(calculated for C24H36NO3386.2690)。
根据HRESIMS判断出Piericidin N分子式为C24H36NO3(m/z 386.2696[M+H]+)。其1D-NMR核磁数据(表1)显示了7个甲基(含1个甲氧基)，2个亚甲基，8个次甲基(含6个烯次甲基)，以及7个季碳(含1个羰基碳)。通过与同类的粉蝶霉素类化合物Mer-A2026 B(J.Antibiot.1995,48,103)的核磁数据比对发现，唯一的不同点在于Mer-A2026 B中C-4'的羟基被氧化为羰基(δC 179.1)，2D-NMR数据中H-3′与C-2′/C-4′/C-5′，以及H3-9′与C-4′/C-5′的HMBC相关信号证实了C-4'羰基的存在。2D-NMR数据中其他COSY和NOESY相关信号进一步佐证了该化合物结构(图1)，因此该化合物鉴定为式(I)所示的吡啶酮粉蝶霉素类化合物，命名为piericidin N。这是除了JBIR-02a(J.Antibiot.2007，60,459)和piericidinE1(Org.Lett.2014,16,736)之外，目前报道的已第三个含有吡啶酮的粉蝶霉素类天然产物(而羟基吡啶粉蝶霉素类天然产物已有报道60多个)。
表1.Piericidin N的(700MHz)和13C NMR(175HMz)数据(CD3OD)
化合物piericidin N的重要二维核磁相关信息(HMBC，COSY和NOESY)如图1。
由此确定化合物piericidin N的结构式如下所示：
实施例3：吡啶酮粉蝶霉素piericidinN对人癌细胞的抑制活性
6株癌细胞株订购于中科院上海细胞资源中心：HL-60细胞株(Cat#TCHu 23)；K-562细胞株(Cat#TCHu191)；MOLT-4细胞株(Cat#TCHu224)；786-O细胞株(Cat#TCHu186)，ACHN细胞株(Cat#TCHu199)；OS-RC-2细胞株(Cat#TCHu40)。癌细胞抑制活性实验采用CCK-8检测法。收集对数生长期细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度至合适浓度(依照细胞密度优化试验结果确定)，接种96孔板，每孔加100μl细胞悬液。细胞在37℃，100％相对湿度，5％CO2培养箱中孵育24小时。用培养基将待测化合物稀释至合适的作用浓度，按25μl/孔加入细胞。化合物piericidin N的作用终浓度从50μM开始，4倍梯度稀释，9个浓度点。每个处理3个重复。细胞置于37℃，100％相对湿度，5％CO2培养箱中孵育72小时。吸弃培养基，加入含10％CCK-8的新鲜完全培养基置于37℃培养箱中孵育2-4小时。轻轻震荡后在SpectraMax M5 Microplate Reader上测定450nm波长处的吸光度，以650nm处吸光度作为参比，计算抑制率。以常见的羟基吡啶粉蝶霉素piericidin A作为对照同时进行测定。并设立阴性对照(细胞+CCK-8+DMSO)和阳性对照(培养基+CCK-8+DMSO)。
按下式计算化合物对癌细胞生长的抑制率：
癌细胞生长抑制率％＝[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100％
As:样品的吸光度OA(细胞+CCK-8+待测化合物)
Ac:阴性对照的吸光度OA(细胞+CCK-8+DMSO)
Ab:阳性对照的吸光度OA(培养基+CCK-8+DMSO)
运用软件Graphpad Prism 5并采用计算公式log(inhibitor)vs.normalizedresponse进行IC50曲线拟合并计算出IC50值。
吡啶酮粉蝶霉素piericidin N和羟基吡啶粉蝶霉素piericidin A对6株癌细胞株的增殖抑制作用见表2：
表2化合物piericidin N和piericidin A对6株癌细胞的增殖抑制作用(IC50,μM)
细胞
piericidin N
piericidin A
HL-60
0.08
8.5
K562
>50
2.4
MOLT-4
>50
25
ACHN
>50
0.40
786-O
>50
30
OS-RC-2
42.9
5.2
通过对6株癌细胞的增殖抑制活性评价发现，吡啶酮粉蝶霉素piericidin N对HL-60细胞株(人早幼粒白血病细胞)具有选择性的抑制活性，半数抑制率IC50分别为0.08μM。而对其他肿瘤细胞没有显著的抑制活性，包括没有显示对粉蝶霉素常见的抗肾癌活性。对白血病细胞的选择性抑制活性，对于抗白血病药物的研发具有重要意义。
为了进一步研究piericidin N抑制人早幼粒白血病细胞HL-60的活性，取对数生长期的HL-60细胞，调整细胞浓度为2×106个/ml，接种于50mL培养瓶内，分三批，每批分3组，1组为空白对照，2、3、4组分别加入piericidin N，使其终浓度为0.1、0.2和0.4μM。细胞贴壁后，更换培养液并加药，培养至72h光镜观察照相。收集的细胞用4℃预冷的PBS洗涤，离心1000r/min，2×5min。缓冲液重悬细胞后，取100μL细胞悬液于流式管内，加入5μLAnnexin-V和10μL PI溶液，室温避光15min后，流式细胞仪进行检测。
细胞周期分析发现，在低浓度0.1μM的piericidin N处理后，HL-60细胞处于G0/G1期细胞百分含量减少、S期细胞含量明显增多(由34.4％上升到54.4％)、G2/M期细胞含量减少(图2)。细胞凋亡分析发现，0.1、0.2和0.4μM的piericidin N处理导致的细胞凋亡率分别为38.2％，40.8％和60.7％(图3)，piericidin N可以显著诱导HL-60细胞凋亡。
综上，实验显示，吡啶酮粉蝶霉素piericidin N具有选择性地抑制人早幼粒白血病细胞HL-60的活性，并使白血病HL 60细胞周期S期受阻，并诱导细胞凋亡。本发明发现了自然界少见的吡啶酮粉蝶霉素类的抗肿瘤活性与常见的羟基吡啶粉蝶霉素有明显的差异，首次发现了吡啶酮粉蝶霉素类在抗癌，特别是抗白血病中的应用潜力。因此，吡啶酮粉蝶霉素piericidin N可以做为抗白血病药物开发的先导化合物。
