一种蔬菜专用的微生物复合肥及其制备方法
技术领域
本发明涉及农业生物
技术领域
，具体涉及一种蔬菜专用的微生物复合肥及其制备方法。背景技术
蔬菜是农业生产的重要组成部分，也是人们摄取维生素和矿质元素的重要来源，是人类每日不可缺少的食物。而随着人们生活水平的提高，对蔬菜的品质特别是其营养、卫生和安全方面也提出了更高的要求。然而，蔬菜普遍对氮、磷肥的依赖性较高，传统农业主要依靠化学肥料为蔬菜提供营养，农民为追求较高产量，化肥的使用量严重超标，这不仅增加了购买性的投入，还造成了土壤退化等环境问题，同时，也给食品安全带来隐患，如白菜等叶类蔬菜很容易富集亚硝酸盐，过量化学氮肥的施用能使这种累积加剧，从而对人体健康产生危害。为此，如何减少化肥用量是当前蔬菜生产中的重要课题。
近些年，国内外研究表明，植物根际存在大量促生菌（能够促进植物生长的一大类菌），如溶磷菌能将土壤中难以被植物直接吸收利用的磷素转化为植物可吸收态；固氮菌（分为共生、联合和自由固氮）可将大气中的氮气固定为植物可吸收态；分泌植物激素菌可分泌植物激素（如生长素、赤霉素、细胞分裂素等）；病原拮抗菌（又称生防菌）可以抑制或杀死植物病原菌等。同时，一些促生菌兼具溶磷、固氮和分泌植物激素等特性。用从植物根际分离获得的高效促生菌研制成的复合接种剂（或菌肥），不但可以活化土壤难溶性磷源，固定空气中的氮素，提供氮、磷素营养，同时可以促进农作物对其它营养元素的吸收，改善植物营养结构，调节和促进植物生长，增强植物抗病能力。此外，促生菌还可改善土壤结构，提高土壤有机质含量，改良盐碱地、防止土壤退化等。因此，开展植物促生菌资源的研究及复合接种剂（菌肥）研发具有极其重要的现实意义。
现今国内外都在积极发展绿色农业，提倡生产安全、无公害的绿色食品。在生产绿色食品过程中则要求不用或尽量少用（或限量使用）化学肥料、化学农药和其它化学物质。它要求肥料必须首先保护和促进施用对象生长和提高品质；其次是不造成施用对象产生和积累有害物质；三是对生态环境无不良影响。
复合微生物肥料，是由特定解磷、分泌植物激素、固氮微生物或其他经过鉴定的两种以上互不拮抗的微生物与营养物质复合而成，是能提供、保持或改善植物营养，提高农产品产量或改善农产品品质的活体微生物制品。
复合微生物肥料集有机肥、化学肥料和微生物肥料的优点于一体，克服了过去有机肥施用量大、质量不稳定的缺点，施用十分方便。克服了单纯化学肥料造成的土壤理化性质退化和农产品质量下降的缺点。
主要特点有：1. 增加土壤肥力：如固氮、解磷微生物的应用，可进行固氮、将土壤中难溶的磷分解出来，从而提高化学肥料的有效利用率、土壤肥力、作物营养水平。2. 对有害微生物的生物防治：生防菌在作物根部大量生长繁殖，对病原微生物的起到拮抗及抑制其生长繁殖的作用，达到减轻作物病害的功效，提高农作物的品质和产量以及抗重茬的能力。
虽然现有技术中有较多的复合微生物肥料已经应用到了农业生产实践中，但是多数复合微生物肥料由于菌种组成不合理，或者制备操作不当，使其效果远远不如化肥，因此，市场认可度很低。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是针对国内外现有技术中，有关蔬菜种植中过度依赖化学肥料，造成化肥使用效率降低及引起生态环境污染问题的现状，探索、发掘和利用新的微生物资源，节约能源及保护环境。本发明技术从甘肃、宁夏等地不同生境的十字花科、葫芦科、伞形科、茄科、菊科等多种蔬菜根际筛选溶磷菌株、固氮菌株、分泌植物激素菌株和病原拮抗菌株，以一定的配比研制蔬菜专用复合微生物肥料，为蔬菜生产提供新型“环境友好型”肥料及防病复合微生物肥料，以部分替代工业化肥，同时防止蔬菜根部病害入侵，减少购买性投入。
本发明的上述目的可采用下列技术方案来实现：
本发明提供的一种蔬菜专用的微生物复合肥，所述微生物复合肥是由按照重量份计的以下组分制备得到的：载体60-100份，复合液体菌剂15-25份。
进一步的，上述的一种蔬菜专用的微生物复合肥，所述复合液体菌剂包括有枯草芽孢杆菌VGP004菌株发酵液、巨大芽孢杆菌VGP625菌株发酵液、圆褐固氮菌VGP021菌株发酵液和短短芽孢杆菌VGP123菌株发酵液中的任意一种或几种；
可选择为：枯草芽孢杆菌VGP004菌株发酵液（简称004）单独使用、巨大芽孢杆菌VGP625菌株发酵液（简称625）单独使用、圆褐固氮菌VGP021菌株发酵液（简称021）单独使用、短短芽孢杆菌VGP123菌株发酵液（简称123）单独使用以及004+625复配、004+021复配、004+123复配、625+021复配、625+123复配、021+123复配、004+625+021复配、004+625+123复配、004+021+123复配、625+021+123复配、004+625+021+123复配等。
因混合菌株体系的重量相对于使用的培养基重量而言，其占比例小于万分之一，因此混合菌株体系在混合菌株悬浮液中的重量可以忽略不计。
从不同生境的十字花科、葫芦科、伞形科、茄科、菊科等多种蔬菜根际筛选的300余株菌中，通过进行各菌株间拮抗、互作特性、溶磷、固氮、分泌植物激素（IAA）及耐盐及拮抗病原菌等各项指标测定及室内和田间使用对蔬菜的促生效果和品质影响实验测定，筛选出高效溶磷菌株、联合固氮菌株、分泌植物激素菌株、抗病菌株，研发出蔬菜根际复合微生物肥料。
进一步的，上述的一种蔬菜专用的微生物复合肥，所述枯草芽孢杆菌VGP004菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021578，保藏时间为2021年5月24日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis VGP004菌株，具有溶磷、分泌植物生长激素、拮抗镰刀菌（Fusariumspp）及立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）等病原菌的功效。
进一步的，上述的一种蔬菜专用的微生物复合肥，所述巨大芽孢杆菌VGP625菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021583，保藏时间为2021年5月24日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
巨大芽孢杆菌Psdeuomnoda fluoerncne VGP625菌株，具有固氮、分泌植物生长激素、拮抗镰刀菌（Fusariumspp.）及立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）等病原菌的功效。
进一步的，上述的一种蔬菜专用的微生物复合肥，所述圆褐固氮菌VGP021菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021584，保藏时间为2021年5月24日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
圆褐固氮菌Azotobacter chroococcum VGP021菌株，具有固氮、分泌植物生长激素的功效。
进一步的，上述的一种蔬菜专用的微生物复合肥，所述短短芽孢杆菌VGP123菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021581，保藏时间为2021年5月24日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
短短芽孢杆菌Brevibacillus brevisVGP123菌株，具有溶磷、固氮、分泌植物生长激素的功效。
进一步的，上述的一种蔬菜专用的微生物复合肥，所述复合液体菌剂中，按照重量份计，枯草芽孢杆菌VGP004菌株发酵液20-40份，巨大芽孢杆菌VGP625菌株发酵液10-30份，圆褐固氮菌VGP021菌株发酵液10-30份，短短芽孢杆菌VGP123菌株发酵液10-30份。
进一步的，上述的一种蔬菜专用的微生物复合肥，所述复合液体菌剂中，菌体数量大于等于109cfu/mL；菌株培养液为NA液体培养基。
混合菌株可在含5%以下NaCl培养基上生长；对该混合菌株体系测定表明，四株菌间均无拮抗反应，在溶磷、固氮、分泌植物生长激素（IAA）及耐盐等各项测定中：有效磷含量为117.5 mg·L-1，较组合中菌株单独培养时提高了25.8~56.4%；固氮酶活性为884.2 nmolC2H4 h-1 mL-1，较组合中菌株分别单独培养时提高了43.3~64.7；IAA含量为19.16 μg ·mL-1，较组合中菌株分别单独培养时含量提高了41.3~83.4（如表1所示）。
表1显示为复合菌剂与单菌株菌剂使用效果对比，具体如下表所示：
进一步的，上述的一种蔬菜专用的微生物复合肥，所述载体由按照重量份计的以下原料制备得到：花土25-35份，马铃薯渣5-15份，草炭20-30份，木炭10-20份；载体原料均粉碎后过2mm筛。
本发明的第二个发明点是提供了一种蔬菜专用的微生物复合肥的制备方法，所述蔬菜专用的微生物复合肥为上述的微生物复合肥，其制备方法包括以下步骤：
S1.将载体原料分别充分晒干、去杂、粉碎、过筛后按照配比充分混匀；载体原料按重量份计为花土25-35份，马铃薯渣5-15份，草炭20-30份，木炭10-20份；过2mm筛；
S2.将混匀的载体高温高压灭菌，冷却备用；
灭菌过程为121℃，0.1MPa高温高压灭菌1min；
S3.配制NA液体培养基，分别接种菌株并培养，菌体数量大于等于109cfu/mL时终止培养，将菌液混匀得到复合液体菌剂；
菌株培养条件为：30℃培养24~48小时，用血球计数板在显微镜下计数培养液中菌体数量，当数量超过109cfu/ml时终止培养；
S4.按照配比将复合液体菌剂接种于灭菌后的载体中，并在无菌条件下培养后使用或置于无菌密封容器中常温保存待用；
无菌条件下培养为：在无菌条件下置于28-30℃培养5天即可。
本发明提供的一种蔬菜专用的微生物复合肥及其制备方法，具有如下特点及优点：经本发明根际复合微生物肥料处理的西红柿、黄瓜、辣椒等果类蔬菜比未处理的相比，其果实产量、单果重量、品相有明显的提高，成熟期平均提前3~5天；芹菜、白菜、生菜等叶类蔬菜产量、叶面积、平均株高有显著提高，叶色明显加深。可见，施用本发明根际微生物复合接种剂，既可以增加蔬菜的产量，同时可以提高其质量。另外，使用该产品也可以溶解土壤中的难溶性磷素、固定空气中的氮素，给植物提供充足的养分，同时还可以促进植物对其他营养元素的吸收，调节和促进植物生长，除此而外，还可以帮助植物抵御病原真菌的侵染，提高产量。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种蔬菜专用的微生物复合肥，是由按照重量计的以下组分制备得到的：载体60kg，复合液体菌剂15kg。
复合液体菌剂包括有枯草芽孢杆菌VGP004菌株发酵液、巨大芽孢杆菌VGP625菌株发酵液、圆褐固氮菌VGP021菌株发酵液和短短芽孢杆菌VGP123菌株发酵液中的任意一种或几种。
复合液体菌剂中，按照重量比计，枯草芽孢杆菌VGP004菌株发酵液：巨大芽孢杆菌VGP625菌株发酵液：圆褐固氮菌VGP021菌株发酵液：短短芽孢杆菌VGP123菌株发酵液为2：1：1：1。
复合液体菌剂中，菌体数量大于等于109cfu/mL；菌株培养液为NA液体培养基。
载体由按照重量计的以下原料制备得到：花土25kg，马铃薯渣5kg，草炭20kg，木炭10kg；载体原料均粉碎后过2mm筛。
蔬菜专用的微生物复合肥的制备方法，包括以下步骤：
S1.将载体原料分别充分晒干、去杂、粉碎、过2mm筛后按照配比充分混匀；
S2.将混匀的载体高温高压灭菌，灭菌过程为121℃，0.1MPa高温高压灭菌1min，冷却备用；
S3.配制NA液体培养基，分别接种菌株并培养，菌株培养条件为：30℃培养24小时，用血球计数板在显微镜下计数培养液中菌体数量，当数量超过109cfu/ml时终止培养，将菌液混匀得到复合液体菌剂；
S4.按照配比将复合液体菌剂接种于灭菌后的载体中，并在无菌条件下培养后使用或置于无菌密封容器中常温保存待用，无菌条件下培养为：在无菌条件下置于28℃培养5天即可。
实施例2：
一种蔬菜专用的微生物复合肥，是由按照重量计的以下组分制备得到的：载体100kg，复合液体菌剂25kg。
复合液体菌剂包括有枯草芽孢杆菌VGP004菌株发酵液、巨大芽孢杆菌VGP625菌株发酵液、圆褐固氮菌VGP021菌株发酵液和短短芽孢杆菌VGP123菌株发酵液中的任意一种或几种。
复合液体菌剂中，按照重量比计，枯草芽孢杆菌VGP004菌株发酵液：巨大芽孢杆菌VGP625菌株发酵液：圆褐固氮菌VGP021菌株发酵液：短短芽孢杆菌VGP123菌株发酵液为4：3：3：3。
复合液体菌剂中，菌体数量大于等于109cfu/mL；菌株培养液为NA液体培养基。
载体由按照重量计的以下原料制备得到：花土35kg，马铃薯渣15kg，草炭30kg，木炭20kg；载体原料均粉碎后过2mm筛。
蔬菜专用的微生物复合肥的制备方法，包括以下步骤：
S1.将载体原料分别充分晒干、去杂、粉碎、过2mm筛后按照配比充分混匀；
S2.将混匀的载体高温高压灭菌，灭菌过程为121℃，0.1MPa高温高压灭菌1min，冷却备用；
S3.配制NA液体培养基，分别接种菌株并培养，菌株培养条件为：30℃培养48小时，用血球计数板在显微镜下计数培养液中菌体数量，当数量超过109cfu/ml时终止培养，将菌液混匀得到复合液体菌剂；
S4.按照配比将复合液体菌剂接种于灭菌后的载体中，并在无菌条件下培养后使用或置于无菌密封容器中常温保存待用，无菌条件下培养为：在无菌条件下置于30℃培养5天即可。
实施例3：
一种蔬菜专用的微生物复合肥，是由按照重量计的以下组分制备得到的：载体80kg，复合液体菌剂20kg。
复合液体菌剂包括有枯草芽孢杆菌VGP004菌株发酵液、巨大芽孢杆菌VGP625菌株发酵液、圆褐固氮菌VGP021菌株发酵液和短短芽孢杆菌VGP123菌株发酵液中的任意一种或几种。
复合液体菌剂中，按照重量比计，枯草芽孢杆菌VGP004菌株发酵液：巨大芽孢杆菌VGP625菌株发酵液：圆褐固氮菌VGP021菌株发酵液：短短芽孢杆菌VGP123菌株发酵液为3：2：2：2。
复合液体菌剂中，菌体数量大于等于109cfu/mL；菌株培养液为NA液体培养基。
载体由按照重量计的以下原料制备得到：花土30kg，马铃薯渣10kg，草炭25kg，木炭15kg；载体原料均粉碎后过2mm筛。
蔬菜专用的微生物复合肥的制备方法，包括以下步骤：
S1.将载体原料分别充分晒干、去杂、粉碎、过2mm筛后按照配比充分混匀；
S2.将混匀的载体高温高压灭菌，灭菌过程为121℃，0.1MPa高温高压灭菌1min，冷却备用；
S3.配制NA液体培养基，分别接种菌株并培养，菌株培养条件为：30℃培养36小时，用血球计数板在显微镜下计数培养液中菌体数量，当数量超过109cfu/ml时终止培养，将菌液混匀得到复合液体菌剂；
NA液体培养基的配制方法为：在1L的蒸馏水中依次加入蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化钠5.0g即可；
S4.按照配比将复合液体菌剂接种于灭菌后的载体中，并在无菌条件下培养后使用或置于无菌密封容器中常温保存待用，无菌条件下培养为：在无菌条件下置于29℃培养5天即可。
实施例4：
本发明提供了一种复合微生物肥料，按照重量份数计，其原料组分包括花土30份、马铃薯渣10份、草炭25份、木炭15份、液体菌剂20份。液体菌剂由枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis VGP004菌株发酵液、巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium VGP625菌株发酵液、圆褐固氮菌Azotobacter chroococcum VGP021菌株发酵液、短短芽孢杆菌Brevibacillus brevis VGP123菌株发酵液按2:1:2:1的比例组成。
实施例5：
本发明提供了一种复合微生物肥料，按照重量份数计，其原料组分包括花土25份、马铃薯渣15份、草炭30份、木炭10份、液体菌剂20份。液体菌剂由枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis VGP004菌株发酵液、巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium VGP625菌株发酵液、圆褐固氮菌Azotobacter chroococcum VGP021菌株发酵液、短短芽孢杆菌Brevibacillus brevis VGP123菌株发酵液按4:3:2:1的比例组成。
实施例6：
本发明提供了一种复合微生物肥料，按照重量份数计，其原料组分包括花土35份、马铃薯渣5份、草炭20份、木炭20份、液体菌剂20份。液体菌剂由枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis VGP004菌株发酵液、巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium VGP625菌株发酵液、圆褐固氮菌Azotobacter chroococcum VGP021菌株发酵液、短短芽孢杆菌Brevibacillus brevis VGP123菌株发酵液按3:3:2:2的比例组成。
实施例4~6中蔬菜根际复合微生物肥料的制备方法如下：（1）将花土、马铃薯渣、草炭、木炭等原料分别充分晒干，去除杂物，粉碎，过2 mm筛；（2）将花土、马铃薯渣、草炭、木炭等原料按照重量比6:2:5:3的比例充分混匀；（3）将上述混匀的载体在121℃，0.1 MPa高温高压灭菌1 min冷却后备用；（4）配制NA液体培养基，接种权利要求2中所述4种菌株，30℃培养24~48 h，用血球计数板在显微镜下计数培养液中菌体数量，当数量超过109cfu/ml时终止培养，将4种菌液充分混匀；（5）将培养好的菌液按照载体：菌液为8:2的比例接种于已灭菌的载体，并在无菌条件下置于28~30℃培养5天即成蔬菜专用复合菌肥。经本方法制备而成的接种剂储存于室温下，6个月后检测其活菌数，达5.15×108cfu/g。符合《中华人民共和国农业行业标准（NY/T 1113-2006）》之规定。
实施例4~6提供的本发明蔬菜根际复合微生物肥料经大田实验分别施用于西红柿、白菜、黄瓜（试验地位于甘肃省兰州市），并与CK（空白对照）以及现有市售枯草芽孢杆菌菌肥的各方面效果进行了对比。
表2显示为本发明提供的蔬菜专用微生物复合肥与空白（不施肥）及现有常规肥料的施用效果对比，具体如下所示：
表2中，与CK空白（不施肥，各项指标计为100%）对比，使用本发明复合菌肥的西红柿总产量增加15.2%，株高增加7.6%，单果重量平均增加3.5%，成熟期提前4天；使用本发明复合菌肥的白菜总产量增加9.4%，株高增加3.4%，单株重量平均增加1.8%；使用本发明复合菌肥的黄瓜总产量增加11.7%，株高增加8.5%，单果重量平均增加5.6%，成熟期提前5天。
与市售的枯草芽孢杆菌菌肥对比，使用本发明复合菌肥的西红柿总产量增加了10.2%，株高增加了4.9%，单果重量平均增加了2.4%，成熟期提前3天；使用本发明复合菌肥的白菜总产量增加了7.6%，株高增加了2.2%，单株重量平均增加了1.2%；使用本发明复合菌肥的黄瓜总产量增加了9.1%，株高增加了6.3%，单果重量平均增加了4.0 %，成熟期提前4天。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
