一种通过诱发嘧啶或嘌呤发生质子转移改变其配对性质进行基因治疗的方法
技术领域
本发明属于生物
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，尤其涉及一种通过诱发嘧啶或嘌呤发生质子转移改变其配对性质进行基因治疗的方法。背景技术
基因治疗是通过各种方法和策略对突变基因进行结构性或功能性修复，以达到治疗疾病的目的。目前基因治疗的主要策略包括基因添加、基因替代、RNA/DNA嵌合寡核苷酸介导的定点修复技术、采用反义核酸与靶基因互补结合，在转录和翻译水平抑制基因的表达、将小片段RNA导入靶细胞调节mRNA的剪接、引起外显子跳跃或引起mRNA降解等作用的RNA水平的干预、通过基因编辑技术修复突变位点的DNA序列等。近2/3的人类遗传性疾病是由单碱基变异引起，因此单碱基编辑技术是基因治疗研究的热点技术。
现有的单碱基编辑技术是将CRISPR/Cas系统和脱氨酶结合起来，使嘧啶或嘌呤上的氨基水解为羰基，从而实现突变碱基的编辑，但该系统需要将酶系统导入细胞或细胞核，体系较大，且存在脱靶、额外缺失或插入、载体容量有限、触发先天免疫反应等缺陷，致使CRISPR/Cas系统单碱基编辑技术目前尚不能有效应用于临床治疗。
发明内容
本发明提供一种通过诱发嘧啶或嘌呤发生质子转移改变其配对性质进行基因治疗的方法，旨在解决CRISPR/Cas单碱基编辑酶复合物体系过大,使基因治疗过程复杂、难度大，且产生免疫反应等多种副作用，致使CRISPR/Cas单碱基编辑技术尚不能有效应用于临床治疗的问题。
本发明是这样实现的，一种通过诱发嘧啶或嘌呤发生质子转移改变其配对性质进行基因治疗的方法，包括如下步骤：
步骤S100：构建经典嘧啶或嘌呤以及嘧啶嘌呤复合物的分子结构理论模型；
步骤S200：通过替换经典嘧啶或嘌呤上的原子或基团形成多个新的嘧啶或嘌呤类似物分子结构；
步骤S300：计算各个新分子与嘧啶或嘌呤相互作用并发生质子转移的多个物理化学参数；
步骤S400：评估各项参数，筛选出可在生理条件下诱发嘧啶或嘌呤发生质子转移的候选分子；
S500：候选分子作为核心原材料合成为药物分子，用于单碱基突变基因治疗或其他用途。
优选的，所述步骤S100中，嘧啶或嘌呤与糖环结合的位点用甲基或氢基进行替代。
优选的，所述步骤S100中，采用M06X或B3LYP等方法对单分子以及复合物进行结构优化。
优选的，所述步骤S200中，为了加强碱基对氢键中N原子获取质子的能力，可将其上下游原子或基团替换为电负性较弱的原子或基团。
优选的，所述步骤S200中，为了使碱基对氢键中氨基更容易提供质子，氨基可替换为羟基或巯基。
优选的，所述步骤S300中，采用密度泛函理论、M062X或B3LYP方法、以及def2sv或6-31++g(d,p)基组对嘧啶或嘌呤类似物与其配对的嘧啶或嘌呤之间质子转移反应进行模拟计算。
优选的，所述步骤S300中，所有计算均在T＝310.15K和p＝1atm的水溶剂化条件下进行。
优选的，所述步骤S400中，将设计的分子发生分子内质子转移后与转移前能量差(△E)作为分子稳定的评判标准，将设计的分子诱发嘧啶或嘌呤发生质子转移的化学反应平衡率(Keq)作为评判其诱发质子转移能力的评判标准，选择△E>0和Keq>1的分子作为候选分子。
优选的，所述步骤S500中，用候选分子合成药物，通过诱发嘧啶或嘌呤发生质子改变其配对性质进行基因治疗或其他用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的一种通过诱发嘧啶或嘌呤发生质子转移改变其配对性质进行基因治疗的方法，通过理论建模、设计和计算出具有特定结构的候选分子，使其具有在生理条件下诱发胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤发生质子转移和配对性质改变的作用，从而实现基因治疗的方法和思路。
附图说明
图1为本发明的方法步骤示意图；
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1，本发明提供一种通过诱发嘧啶或嘌呤发生质子转移改变其配对性质进行基因治疗的方法，包括如下步骤：
步骤S100：构建经典嘧啶或嘌呤以及嘧啶嘌呤复合物的分子结构理论模型；
通过高斯(Gaussian)等软件构建胸腺嘧啶、腺嘌呤以及胸腺嘧啶腺嘌呤复合物的分子结构，为了模拟经典碱基对的最小结构，胸腺嘧啶和腺嘌呤中与糖环结合的位点用甲基或氢基进行替代。采用密度泛函理论和M06X或B3LYP方法对单分子以及复合物进行结构优化，获得最优结构。结果如下图：
步骤S200：通过替换经典嘧啶或嘌呤上的原子或基团形成多个新的嘧啶或嘌呤类似物分子结构；
为了加强腺嘌呤N1位获取质子的能力，C2位的氢基可替换为氨基，C2位的碳原子可替换为硼原子，N3位的氮原子可替换为碳原子；为了使N6更容易提供质子，C6位的氨基可替换为羟基或巯基，亦可进行其他原子或基团的替换或修饰。以下罗列出部分经过原子或基团替换形成的腺嘌呤类似物结构：
步骤S300：计算各个新分子与嘧啶或嘌呤相互作用并发生质子转移的多个物理化学参数。
采用密度泛函理论、M062X或B3LYP方法、以及def2sv或6-31++g(d,p)基组对腺嘌呤类似物与胸腺嘧啶之间质子转移反应进行模拟计算。为了提高能量和结构计算的准确性，采用D3弥散校正。为了模拟DNA分子所处的生理环境，所有计算均在T＝310.15K(37℃)和p＝1atm的水溶剂化条件下进行。所有计算采用高斯程序包等软件进行。在此理论水平上对所有分子单体和复合物进行结构优化、分子总能量、质子转移过渡态能垒、化学反应率和反应平衡常数等评估质子转移的重要参数进行计算。下表为部分腺嘌呤类似物与胸腺嘧啶复合物发生分子间质子转移的各项参数计算值。
Aa<sub>n</sub>
△E
△G<sup>≠</sup><sub>f</sub>
△G<sup>≠</sup><sub>r</sub>
k<sub>f</sub>(s<sup>-1</sup>)
k<sub>r</sub>(s<sup>-1</sup>)
K<sub>eq</sub>
Aa1
—
8.79
-1.77
4.11×10<sup>6</sup>
1.14×10<sup>14</sup>
3.61×10<sup>-8</sup>
Aa2
11.07
4.93
-0.61
2.16×10<sup>9</sup>
1.74×10<sup>13</sup>
1.24×10<sup>-4</sup>
Aa3
-0.43
-0.65
1.03
1.86×10<sup>13</sup>
1.21×10<sup>12</sup>
1.54×10<sup>1</sup>
Aa4
9.48
3.32
1.21
2.95×10<sup>10</sup>
9.07×10<sup>11</sup>
3.25×10<sup>-2</sup>
Aa5
11.97
3.01
1.04
4.88×10<sup>10</sup>
1.20×10<sup>12</sup>
4.07×10<sup>-2</sup>
Aa6
1.79
-0.46
0.34
1.36×10<sup>13</sup>
3.72×10<sup>12</sup>
3.66×100
Aa7
-2.35
0.33/-1.17/0.42
-1.46/-2.96/-1.37
3.27×10<sup>12</sup>
5.97×10<sup>13</sup>
5.48×10<sup>-2</sup>
Aa8
-2.05
0.11
4.74
5.41×10<sup>12</sup>
2.94×10<sup>9</sup>
1.84×10<sup>3</sup>
Aa9
-8.55
-0.59/-3.61/-3.35
1.55/-1.47/-1.21
1.68×10<sup>13</sup>
5.22×10<sup>11</sup>
3.22×10<sup>1</sup>
Aa10
-6.16
-0.52
5.02
1.51×10<sup>13</sup>
1.87×10<sup>9</sup>
8.07×10<sup>3</sup>
Aa11
-1.01
1.47
-0.38
5.95×10<sup>11</sup>
1.20×10<sup>13</sup>
4.96×10<sup>-2</sup>
Aa12
-0.94
2.44
0.73
1.23×10<sup>11</sup>
1.98×10<sup>12</sup>
6.21×10<sup>-2</sup>
Aa13
-0.93
-0.24
2.62
9.54×10<sup>12</sup>
9.19×10<sup>10</sup>
1.04×10<sup>2</sup>
Aa14
-0.63
1.94
0.26
2.77×10<sup>11</sup>
4.24×10<sup>12</sup>
6.53×10<sup>-2</sup>
Aa15
-0.54
1.73
1.73
3.90×10<sup>11</sup>
3.90×10<sup>11</sup>
1.00×100
Aa16
-0.72
-0.60
3.60
1.17×10<sup>13</sup>
1.87×10<sup>10</sup>
9.14×10<sup>2</sup>
Aa17
-0.96
-0.52
6.30
1.50×10<sup>13</sup>
2.34×10<sup>8</sup>
4.41×10<sup>4</sup>
Aa18
-0.86
-1.23
6.10
4.74×10<sup>13</sup>
3.23×10<sup>8</sup>
1.47×10<sup>5</sup>
Aa19
-0.34
-1.16
9.72
4.25×10<sup>13</sup>
9.09×10<sup>5</sup>
4.68×10<sup>7</sup>
Aa20
-0.13
-0.48
8.18
1.41×10<sup>13</sup>
1.11×10<sup>7</sup>
1.27×10<sup>6</sup>
注：分子内质子转移后产物与反应物能量差(△E)；PT正向反应能垒(△G≠ f)；PT反向反应势垒(△G≠ r)；PT正向反应率(kf)；反向反应率(kr)；PT反应平衡常数(Keq)；所有能垒值单位为kcal/mol。
步骤S400：评估各项参数，筛选出可在生理条件下诱发嘧啶或嘌呤发生质子转移的候选分子。
根据以上计算的各项参数值，选择分子较稳定且易诱发质子转移的分子作为候选分子。将设计的分子发生分子内质子转移后与转移前能量差(△E)作为分子稳定的评判标准，将设计的分子诱发嘧啶或嘌呤发生质子转移的化学反应平衡率(Keq)作为评判其诱发质子转移能力的评判标准，选择△E>0和Keq>1的分子作为候选分子。例如Aa6分子△E为正值，提示分子结构稳定，其Keq大于1，提示具有诱发胸腺嘧啶质子转移的可能。故Aa6分子可作为候选分子。
S500：候选分子作为核心原材料合成为药物分子，用于单碱基突变基因治疗或其他用途。
将Aa6合成为亚磷酰胺单体，并进一步合成在特定的ssDNA序列或RNA序列中，通过ssDNA或RNA与靶基因或RNA结合，使Aa6分子与靶位点的胸腺嘧啶配对并发生质子转移反应，使靶位点的胸腺嘧啶配对性质发生变化，呈现胞嘧啶的配对性质，从而实现基因治疗或其他用途的目的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
